本发明属于细胞外囊泡分离和蛋白质组学领域；具体涉及一种evlent磁珠、制备方法及在提取血浆细胞外囊泡中的应用。
背景技术：
1、细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是大多数细胞分泌的纳米级囊泡，由磷脂双层结构组成，细胞外囊泡作为细胞间通信的重要工具，包含蛋白质、脂质、rna和dna等多种生物分子。这些囊泡在多种生理过程中发挥作用，如免疫反应、组织修复、血液凝固以及疾病相关过程，包括癌症的转移和炎症。它们的多样性和复杂性使得细胞外囊泡成为了生物医学研究的热点，特别是在疾病诊断和治疗策略的开发方面。
2、血浆来源的细胞外囊泡(evs)是生物标志物的重要来源。目前，从少量人血浆中分离出evs用于下游蛋白质组学分析仍然是一个挑战。分离过程受到高丰度白蛋白和脂蛋白颗粒污染的阻碍，这对蛋白质组学分析产生负面影响。尽管从血浆中分离和纯化evs的方法有多种，如超速离心、沉淀法，大小排除色谱法和免疫亲和法等，但血浆ev的分离仍然存在一些挑战。超速离心：方法耗时且操作复杂，需要多个离心步骤，每个步骤可能需要几小时；样品损失和污染，离心过程中可能会损失一部分evs，同时可能会捕获其他非evs粒子；批次间变异大，操作人员的操作差异可能导致结果不一致。沉淀法：低纯度，沉淀通常不能保证高纯度的样品，因为沉淀物可能包括多种类型的生物颗粒和杂质；样品损失，沉淀过程中可能会丢失部分目标物质，尤其是在多次洗涤和转移过程中；这种损失可能导致后续分析的灵敏度降低。尺寸排除色谱法：分离效率不高，可能无法完全去除所有的小分子污染物；样品稀释，evs在处理过程中可能被稀释，影响后续分析。虽然已经开发出了基于免疫亲和的磁珠，但是，通过磁珠进行的ev免疫分离通常与流式分选和westernblotting(wb)相结合，但它缺乏与纳米颗粒跟踪分析(nta)或蛋白质组学分析的兼容性。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
2、一种evlent磁珠，所述evlent磁珠包括磁珠本体和修饰在磁珠本体外表面的生物标志物，所述生物标志物为一种四跨膜蛋白抗体，包括cd9，cd63和cd81，其中cd9、cd63以及cd81的含量占比为：30％-80％：10％-50％：10％-50％。
3、一种evlent磁珠的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：s1、取羧基磁珠并利用包被液清洗3次，然后加入edc溶液和nhs溶液重悬羧基磁珠，再将磁珠悬浊液放置搅拌器上充分混匀得到活化磁珠；
4、s2、使用包被液清洗活化磁珠至少3次，然后加入cd9,cd63和cd81抗体，室温混匀反应4-6h；反应结束后用封闭液清洗磁珠2-3次，再加入封闭液，室温搅拌12h；搅拌结束后使用磁分离方法去除封闭液得到evlent磁珠。
5、进一步地，步骤s1中edc溶液和nhs溶液的体积比为1:1。
6、进一步地，步骤s2中cd9,cd63和cd81抗体的添加量为30％-80％：10％-50％：10％-50％。
7、上述所述的一种evlent磁珠应用于血浆中细胞外囊泡的提取。
8、进一步地，使用evlent磁珠提取血浆中细胞外囊泡的具体步骤为：取血浆样品，用loading buffer溶液稀释10倍后，加入evlent磁珠室温孵育1小时，用磁分离除去上清液；随后，分别用loading buffer溶液洗涤1次,1xpbs溶液洗涤2次；再用洗脱液洗脱evlent磁珠2次，即可从血浆中提取得到细胞外囊泡。
9、进一步地，所述血浆样品和evlent磁珠的体积比为1:2-5:1。
10、进一步地，所述洗脱液为三乙胺溶液，其浓度为100mm，用量为200μl。
11、本发明的有益效果：本发明提出的多种抗体修饰的磁珠优点为：①增强捕获范围：通过组合多种抗体，可以同时捕获表达不同标记的多种囊泡，增加了捕获的综合性和覆盖范围，适用于探索和分析囊泡的多样性；②提高捕获效率：多种抗体的组合可以提高对囊泡的整体捕获效率，尤其是当单一标记不足以代表所有有关囊泡时；③灵活性：可以根据研究目的选择不同的抗体组合，灵活调整磁珠的组成以适应不同的实验条件和目标。与此同时，在捕获血浆中的evs后，我们直接进行原位裂解，避免的洗脱方法带来的样品损失，这种方法能够很好的兼容蛋白质组学分析。
1.一种evlent磁珠，其特征在于，所述evlent磁珠包括磁珠本体和修饰在磁珠本体外表面的生物标志物，所述生物标志物为一种四跨膜蛋白抗体，包括cd9，cd63和cd81，其中cd9、cd63以及cd81的含量占比为：30％-80％：10％-50％：10％-50％。
2.一种evlent磁珠的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：s1、取羧基磁珠并利用包被液清洗3次，然后加入edc溶液和nhs溶液重悬羧基磁珠，再将磁珠悬浊液放置搅拌器上充分混匀得到活化磁珠；
3.根据权利要求2所述的一种evlent磁珠的制备方法，其特征在于，步骤s1中edc溶液和nhs溶液的体积比为1:1。
4.根据权利要求2所述的一种evlent磁珠的制备方法，其特征在于，步骤s2中cd9,cd63和cd81抗体的添加量为30％-80％：10％-50％：10％-50％。
5.如权利要求1所述的一种evlent磁珠应用于血浆中细胞外囊泡的提取。
6.根据权利要求5中的应用，其特征在于，使用evlent磁珠提取血浆中细胞外囊泡的具体步骤为：取血浆样品，用loading buffer溶液稀释10倍后，加入evlent磁珠室温孵育1小时，用磁分离除去上清液；随后，分别用loading buffer溶液洗涤1次,1xpbs溶液洗涤2次；再用洗脱液洗脱evlent磁珠2次，即可从血浆中提取得到细胞外囊泡。
7.根据权利要求6中的应用，其特征在于，所述血浆样品和evlent磁珠的体积比为1:2-5:1。
8.根据权利要求6中的应用，其特征在于，所述洗脱液为三乙胺溶液，其浓度为100mm，用量为200μl。
