本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种用于提高细菌自然转化效率的基因及其应用方法。
背景技术：
1、转化是将质粒或线性片段形式的dna转移到细菌中的过程，是细菌的分子克隆中最常用的技术，是现代微生物学的一项基础性技术。由于dna分子呈负电性，与同样携带负电荷的细胞膜间存在静电互斥效应，正常情况下无法通过细胞膜，因此需要通过对细菌的处理使dna能够通过。
2、目前在细菌中转化dna的方法包括化学转化法、电转化法、接合转移法等。化学转化法是利用缓冲液(如氯化钙溶液)洗涤菌体，改变细胞膜电性和通透性，制备感受态细胞使dna容易通过，但制备过程中影响因素较多，容易失败。电转化法是利用缓冲液洗涤菌体以改变细胞膜通透性后，对细胞进行电击处理使细胞膜表面出现孔洞，从而让dna进入，但需要特殊仪器，操作不便。
3、自然转化是弧菌属等部分水源性细菌菌属在天然环境下自发发生的一种转化现象。其原理为全局转录因子tfox表达后启动细菌鞭毛形成、外源dna解旋与结合保护等相关功能基因，使得外源dna可以通过鞭毛进入细菌。tofx是发生这一现象的关键基因。通过外源导入和人工调控表达tfox，可以增强细菌的自然转化能力并使其可控发生，从而高效地在细菌中转化dna。
4、因此，本领域的技术人员致力于开发一种简单快速、低成本、高效的dna转化方法。
技术实现思路
1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是一种简单快速、低成本、高效的dna转化方法。
2、为实现上述目的，本发明提供了一种用于提高细菌自然转化效率的基因，其特征在于，所述基因是根据需钠弧菌的密码子频率对霍乱弧菌基因组上的tfox基因进行密码子优化而得到的，为vchtfox基因。
3、在本发明的较佳实施方式中，所述基因的序列如seq id no.1所示。
4、本发明还提供前述基因的表达盒基因，在vchtfox基因前后分别添加t7启动子和t7终止子，即得到所述表达盒基因。
5、在本发明的较佳实施方式中，所述表达盒基因的序列如seq id no.2所示。
6、本发明还提供一种用于提高细菌自然转化效率的基因的应用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7、步骤1、将所述vchtfox基因的表达盒连接到质粒上，在大肠杆菌中扩增并抽提重组质粒，即为pet28a-vchtfox质粒；
8、步骤2、将步骤1中的重组质粒通过电转化法转化进需钠弧菌野生型宿主菌株vmax，即为vmax-pet28a-vchtfox细菌；
9、步骤3、培养步骤2中转化后的vmax菌株，加入诱导剂诱导表达，即成为感受态细胞；
10、步骤4、向步骤3中的感受态细胞中加入供体质粒和诱导剂，进行自然转化，从而表达外源基因。
11、在本发明的佳实施方式中，所述步骤2具体包括：
12、步骤2.1、按照如下配方配制lb3培养基：胰蛋白胨即tryptone10 g/l，酵母提取物即yeast extract5 g/l，氯化钠即nacl30 g/l，在5ml培养基中接种100μl需钠弧菌vmax菌株种子液，在30℃、220rpm的恒温摇床中培养；
13、步骤2.2、在50ml lb3培养基中培养vmax至od600＝0.4～0.6，4200rpm离心8min，去上清，用25ml蔗糖缓冲液重悬，重复3次，最终重悬于5ml蔗糖缓冲液中，所述蔗糖缓冲液配方为蔗糖232.8g/l，磷酸氢二钾即k2hpo41.6 g/l；
14、步骤2.3、采用电穿孔仪，将pet28a-vchtfox质粒以1.4kv/1.6kv，200ω，25μf的条件进行电转化入步骤2.2制备的菌液中，将转化后的菌液涂布于添加了200ng/μl卡那霉素的lb3固体培养基平板上，30℃培养过夜，所得阳性克隆即为vmax-pet28a-vchtfox细菌，所述l3固体培养基即在lb3培养基中添加18g/l的琼脂粉。
15、在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤3具体包括：
16、取步骤2中转化后的菌液，在添加了200ng/μl卡那霉素的lb3固体培养基上划线培养，转移至37℃培养箱培养约8h至看到明显的单菌落，在falcon 14ml试管中，用移液器精准加入2.997ml lb3培养基和3μl 1m iptg溶液，挑取单菌落培养，放入30℃摇床培养4-4.5h，转速220rpm，待菌液变浑浊后测量其od600，至od600＝3.9～4.6时，完成感受态细胞制备。
17、在本发明的另一较佳实施方式中，所述步骤4具体包括：
18、步骤4.1、配置iom培养基：将购买的商用iom培养基固体按照28g/l的浓度溶解为液体并121℃高温灭菌20分钟；
19、步骤4.2、按照每个待转化片段实验组＝350μl iom培养基+0.35μl 1m iptg+3.5μl感受态细胞比例制成预混体系，再吸取350μl预混体系与供体质粒溶液混合；
20、步骤4.3、将步骤4.2的混合液30℃静置培养6h以上，添加1ml lb3培养基复苏，30℃220rpm培养1.5h，在平板上吸取菌液，吸取的菌液为20-100μl，30或37℃培养箱培养。
21、本发明还提供另一种前述用于提高细菌自然转化效率的基因的应用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
22、步骤1、将所述vchtfox基因的表达盒连接到质粒上，在大肠杆菌中扩增并抽提重组质粒，即为pet28a-vchtfox质粒；
23、步骤2、将步骤1中的重组质粒通过电转化法转化进需钠弧菌野生型宿主菌株vmax，即为vmax-pet28a-vchtfox细菌；
24、步骤3、培养步骤2中转化后的vmax菌株，加入诱导剂诱导表达，即成为感受态细胞；
25、步骤4、向步骤3中的感受态细胞中加入供体质粒和诱导剂，并加入vchtfox基因的线性片段，进行自然转化，得到的插入了vchtfox基因的细菌为vcod-2；
26、步骤5、培养步骤4中的vcod-2细菌，加入诱导剂诱导表达，成为vcod-2感受态细胞；
27、步骤6、向步骤5中的vcod-2感受态细胞加入供体质粒和诱导剂，并加入供体dna线性片段，进行自然转化，从而表达外源基因。
28、在本发明的较佳实施方式中，所述步骤4中，vchtfox基因的插入位点为vmax 1号基因组上t7 rna聚合酶基因座。
29、技术效果
30、1、本发明在需钠弧菌中导入全局转录因子tfox，用诱导型启动子调控其表达，实现可控的自然转化，可将除需钠弧菌以外的弧菌属细菌以及其他水源性细菌开发为能发生自然转化的细菌，可省去电转化、化学转化感受态细胞制备的复杂工序，单次转化实验流程约48-72小时，其中手动操作时间约为25分钟，转化效率达到10-1～10-2之间，简化了细菌dna转化的操作步骤，解除了对于电转仪、水浴锅等仪器设备的需求；
31、2、需钠弧菌和霍乱弧菌的亲缘关系相近，霍乱弧菌的tfox基因有更强的启动自然转化相关基因表达的能力，装配在基因组上的基因随着细胞分裂过程中的dna复制而自主分配到子代细胞中，不会发生丢失，从洗油中直接略过多步深加工，且在无需去除杂质的情况下，甚至可利用杂质从而代谢生成高值化合物。
32、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
1.一种用于提高细菌自然转化效率的基因，其特征在于，所述基因是根据需钠弧菌的密码子频率对霍乱弧菌基因组上的tfox基因进行密码子优化而得到的，为vchtfox基因。
2.如权利要求1所述的用于提高细菌自然转化效率的基因，其序列如seq id no.1所示。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的用于提高细菌自然转化效率的基因的表达盒基因，其特征在于，在vchtfox基因前后分别添加t7启动子和t7终止子，即得到所述表达盒基因。
4.如权利要求3所述的表达盒基因，其序列如seq id no.2所示。
5.一种如权利要求1-2任一项所述的用于提高细菌自然转化效率的基因的应用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述步骤2具体包括：
7.如权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：
8.如权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述步骤4具体包括：
9.一种如权利要求1-2任一项所述的用于提高细菌自然转化效率的基因的应用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
10.如权利要求9所述的应用方法，其特征在于，所述步骤4中，vchtfox基因的插入位点为vmax 1号基因组上t7 rna聚合酶基因座。
