本发明涉及生化分析，具体地说，涉及一种基于fe-n-c纳米酶信号放大的比色生物传感器和微流控芯片的检测致病菌的方法。
背景技术：
1、金属有机骨架是以无机金属为中心，由有机配体自组装而成的多孔材料，由于其高度有序的孔隙度、可调节的孔径和原子分散的金属节点而备受关注。掺杂过渡金属的双金属mof材料不仅具有酶活性，而且具有mof材料高度有序的孔隙和原子分散的金属节点，从而形成了独特的限制效应和催化微环境，使底物能够与活性位点相互作用，提高催化性能。因此，双金属mof材料被认为是理想的模拟酶。然而，双金属mof材料的稳定性较差，其很多特性易受到外部环境的刺激而降低，如结晶度和孔隙度。结合其可能的失效机制，有必要探索新的方法来促进其发展mof衍生材料，以具有较高的稳定性。沸石咪唑骨架(zif)材料具有较高的机械稳定性，掺杂过渡金属元素并在高温下进行热解，不仅可以保持zif材料的整体结晶度和形貌，而且可以充分暴露多孔碳载体负载的金属的活性位点，大大提高催化能力。有趣的是，mof中配位键的反应性和不稳定性使其在热解反应中容易转化为其他形式，从而影响其物理化学性质。在zif-8的热解后，更多的表现出fe的催化特性得到具有模拟酶活性的fe-n-c纳米酶。
2、重力微流控芯片是一种结合了微流控技术和重力控制的微型实验室装置，可用于进行生物学、化学和物理实验。其可控制和操作微小体积的液体样品，用于混合、分离、输送和检测液体样品。重力微流控芯片通常具有较低的制造成本。这使得它们更容易被广泛采用，尤其是在资源有限的实验室环境中，制造重力微流控芯片通常采用标准的微加工技术，如光刻、pdms（聚二甲基硅氧烷）微制造和3d打印，这些技术已经得到广泛发展，制造流程相对容易掌握。并且，它通常能够实现高度灵敏的实验，可以检测和分析微小浓度的化合物或生物分子。因此，将其与比色生物传感器结合可极大地提高其灵敏度。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种基于fe-n-c纳米酶信号放大的比色生物传感器和微流控芯片的检测致病菌的方法。
2、为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供了一种基于fe-n-c纳米酶信号放大的比色生物传感器的构建方法，包括如下步骤：
3、（1）fe-n-c纳米酶的制备。
4、（2）氨基化fe-n-c纳米酶的制备。
5、（3）免疫纳米酶即氨基化fe-n-c纳米酶偶联第一抗体的制备。
6、（4）免疫磁珠即磁珠偶联第二抗体的制备。
7、进一步地，步骤（1）所述fe-n-c纳米酶的制备方法包括：
8、a. 将zn(no3)2·6h2o、fe(no3)3·9h2o与甲醇混合得到溶液a；
9、b. 将2-甲基咪唑与甲醇混合，得到溶液b；
10、c. 将溶液a和溶液b混合，得到fe-zif-8前体；最后在800-900°c下用n2高温热解，得到fe-n-c纳米酶；
11、更优选地，在其中一种较为具体的实施方式中，步骤（1）所述fe-n-c纳米酶的制备方法包括：
12、a. 将2.185 g的zn(no3)2·6h2o和0.065 g的fe(no3)3·9h2o的混合物与100 ml甲醇混合得到溶液a。
13、b. 将2-甲基咪唑与100 ml甲醇混合，得到溶液b。
14、c. 将溶液a和溶液b混合，在室温下搅拌，得到fe-zif-8前体；将fe-zif-8前体清洗数次，冷冻干燥得到固体粉末，最后在800-900°c下用n2高温热解1.5-2h，得到fe-n-c纳米酶。
15、其中，zn(no3)2·6h2o和fe(no3)3·9h2o摩尔比为(11-15):1，2-甲基咪唑与锌离子的摩尔比为(10-12):1。
16、步骤（3）所述第一抗体、步骤（4）所述第二抗体为抗同一致病菌的不同抗体，且所述第一抗体、第二抗体分别结合于所述致病菌的不同表位。
17、进一步地，步骤（2）所述氨基化fe-n-c纳米酶的制备方法包括：
18、将fe-n-c纳米酶溶解于无水乙醇中，加入aptes，用氨水调节ph至10.5-11.0，然后在50℃-65℃水浴中搅拌5-8h，得到氨基化fe-n-c纳米酶。
19、更优选地，在其中一种较为具体的实施方式中，步骤（2）所述氨基化fe-n-c纳米酶的制备方法包括：
20、称取50 mg fe-n-c纳米酶溶解于100 ml无水乙醇中，超声分散后，加入6-10 ml的aptes，用氨水调节ph至10.5-11.0，然后在50℃-65℃水浴中搅拌5-8h，然后用无水乙醇洗涤残留的aptes，制备表面有共轭氨基的功能纳米酶，冷冻干燥，得到氨基化fe-n-c纳米酶。
21、所述致病菌包括但不限于沙门氏菌（ salmonella），如鼠伤寒沙门氏菌（ salmonella typhimurium）。
22、当所述致病菌为沙门氏菌时，所述第一抗体为沙门氏菌单抗，所述第二抗体为沙门氏菌多抗。
23、进一步地，步骤（3）包括：将沙门氏菌单抗与氨基化fe-n-c纳米酶混合，加入5%-10% bsa封闭30 min，最后用1%-3% bsa复溶，得到免疫纳米酶。
24、更优选地，在其中一种较为具体的实施方式中，步骤（3）包括：取10-30 μg的沙门氏菌单抗加入到1 ml氨基化fe-n-c纳米酶中，磁力搅拌，静电吸附2-5 h后，加入100 μl使用超纯水配制的5%-10% bsa封闭30 min，使用超纯水清洗数次（如3次），最后用1 ml 1%-3%bsa复溶，得到免疫纳米酶，置于4℃备用。
25、进一步地，步骤（4）包括：向磁珠中加入edc和nhss混合液，活化1 h，得到免疫磁珠；磁分离回收磁珠后，加入沙门氏菌多抗，偶联2-4 h；向偶联产物中加入封闭液封闭，磁分离回收磁珠，复溶液复溶。
26、更优选地，在其中一种较为具体的实施方式中，步骤（4）包括：
27、1）磁珠清洗：先将0.8-1 ml pb缓冲液加入1.5 ml离心管中，再加入0.2 ml 10mg/ml的磁珠，用1 ml pb缓冲液先后洗涤数次，然后重悬于1-2 ml pb缓冲液中（每次洗涤前都需超声，使磁珠保持悬浮状态）。
28、2）活化羧基：向粒径为180 nm的磁珠中加入edc和nhss混合液，混合均匀后，置于混匀仪上保持磁珠悬浮并缓慢转动，室温活化1 h，得到免疫磁珠；反应结束后，观察磁珠状态，确保状态良好，无聚沉现象。
29、其中，所述edc和nhss混合液的配制方法包括：将edc 0.58 mg和nhss 0.65 mg混合溶解于0.01m ph6.0的pb溶液中，即得浓度为1 mg/ml的混合液。
30、3）偶联沙门氏菌多抗：磁分离回收磁珠后，用1 ml pb 缓冲液洗涤数次，重悬于1ml pb缓冲液中，加入15-25μg沙门氏菌多抗，置于混匀仪上，37℃偶联2-4 h。
31、4）封闭：向3）的偶联产物中加入终浓度为1% bsa，室温封闭45-70 min。磁分离回收磁珠，用1 ml pb缓冲液先后洗涤数次，并用1 ml的复溶液复溶。
32、其中，所述复溶液的配制方法如下：将2.5 g蔗糖、100 mg脱脂乳和70 μl proclin300溶于10 ml浓度为0.01m ph7.4的pbs溶液中，即得。
33、所述pb缓冲液的浓度为0.01m，ph7.4。
34、第二方面，本发明提供一种基于fe-n-c纳米酶信号放大的比色生物传感器的微流控芯片，其为重力驱动式微流控芯片，包括进样孔、气孔、若干条流动通道以及如下6个腔室：反应腔室、清洗液腔室、tmb-h2o2体系腔室、分离腔室、废液腔室和检测腔室；其中，所述反应腔室预埋弱磁小铁球，通过将样本、免疫磁珠和免疫纳米酶与弱磁小铁球混合来提高捕获率；其中，所述免疫磁珠、免疫纳米酶同权利要求1-5任一项所述方法中所述的免疫磁珠、免疫纳米酶。
35、更优选地，在其中一种较为具体的实施方式中，所述微流控芯片包括进样孔、气孔、若干条流动通道（流道）以及如下6个腔室：反应腔室、清洗液腔室、tmb-h2o2体系腔室、分离腔室、废液腔室和检测腔室。
36、如图1所示，所述微流控芯片的尺寸为：长度8.6cm，宽度6.8cm，厚度0.55cm。
37、所述微流控芯片的材质为pdms，各结构单元通过浇筑而成；即所述微流控芯片分别由等厚度的上、下两层刻有流动通道和腔室的pdms层组成。
38、所有腔室均经过表面疏水化处理；所有腔室均设有气孔用于平衡气压，且气孔的位置均高于腔室内液面高度，以确保腔室内的试剂不泄露。
39、所述微流控芯片主要包括：容积为300µl的反应腔室、容积为300µl的清洗液腔室、容积为100µl的tmb-h2o2体系腔室、容积为400 µl的分离腔室、容积为800µl的废液腔室和容积为200µl的检测腔室以及若干条直径为3mm的流动通道，且反应腔室、清洗液腔室、tmb-h2o2体系腔室各自通过流动通道与分离腔室连通，检测腔室、废液腔室各自通过流动通道与分离腔室连通。
40、所述反应腔室预埋一个直径为3mm的弱磁小铁球，通过将样本、免疫磁珠和免疫纳米酶与弱磁小铁球混合来提高捕获率；其中，所述免疫磁珠、免疫纳米酶同权利要求1-5任一项所述方法中所述的免疫磁珠、免疫纳米酶。
41、所述分离腔室内预埋有一个直径为3mm的钕铁硼小球（钕铁硼磁球），用于捕获磁珠（基于钕铁硼小球的磁性实现磁分离）。
42、所述tmb-h2o2体系腔室用于储存tmb-h2o2体系。
43、所述清洗液腔室用于储存清洗液。
44、所述废液腔室用于废液的收集。
45、将tmb-h2o2体系从tmb-h2o2体系腔室释放于所述分离腔室中进行显色反应，反应结束后将释放至检测腔室中，并利用智能手机图像分析app采集和分析产物图像，以实现对样本中致病菌的检测。
46、由于浇筑材料具有一定的疏水性，为使流动通道内的流体顺畅流通，对流动通道的尺寸进行了优化，优选后的流动通道尺寸为3 mm。
47、第三方面，本发明提供所述微流控芯片在样本中致病菌的定性和定量检测中的应用（含非疾病诊断目的）。
48、第四方面，本发明提供一种基于fe-n-c纳米酶信号放大的比色生物传感器和微流控芯片的检测致病菌的方法（含非疾病诊断目的），利用所述微流控芯片检测样本中的致病菌。
49、包括以下步骤：
50、将免疫磁珠（免疫纳米磁珠mnbs）、样品溶液和免疫纳米酶（氨基化fe-n-c纳米酶）预先混合同时注入微流控芯片的反应腔室中，使用外加磁铁对弱磁小铁球搅动进行混合反应一段时间后，通过气孔开关调节控制将其通过流动通道释放至分离腔室，形成的双抗夹心复合物被内置的钕铁硼小球捕获，通过气孔开放控制将上清液释放至废液腔室后，释放清洗液腔室中的清洗液，清洗磁珠表面的非特异性吸附，释放上清液至废液腔室；然后，释放tmb-h2o2体系腔室中的tmb-h2o2体系至分离腔室，显色底物由免疫纳米酶对双抗夹心复合物进行催化；催化反应结束后，再释放至检测腔室，在检测腔室中使用智能手机图像分析app对催化产物进行数据分析，以确定样本中致病菌的浓度。
51、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
52、本发明通过一锅法合成了fe-zif8前体，高温灼烧后，得到具有较高模拟酶活性的fe-n-c纳米酶，使用该纳米酶来代替传统的生物酶（如hrp）对目标细菌进行标记，使其产生更加明显的颜色变化，并对参数进行了优化，使之与智能手机app的线性检测范围相匹配。最后，开发重力微流控芯片来执行细菌检测步骤，进一步通过优化通道尺寸使流体流动更为通畅。其反应原理如下：该传感器采用鼠伤寒沙门氏菌抗体作为识别元件，可检测出食品中的沙门细菌。在合成体系中加入fe制备了fe- zif -8前驱体，高温煅烧制备了fe-n-c纳米酶。利用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)对fe-n-c纳米酶进行氨基修饰。将鼠伤寒沙门氏菌单抗与氨基功能化的fe-n-c纳米酶偶联，鼠伤寒沙门氏菌多抗与与羧基化的磁珠偶联。当靶标存在时，靶标与fe-n-c纳米酶和免疫磁珠形成三明治夹心结构。磁分离后，将与靶标结合的fe-n-c纳米酶转移到沉淀中。沉淀具有很好的过氧化物酶活性，能催化tmb-h2o2体系，其变色程度与沙门氏菌的浓度呈正相关。该方法具有高度的敏感性，重复性和特异性。
1.一种基于fe-n-c纳米酶信号放大的比色生物传感器的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述氨基化fe-n-c纳米酶的制备方法包括：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病菌为沙门氏菌；
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）包括：将沙门氏菌单抗与氨基化fe-n-c纳米酶混合，加入5%-10% bsa封闭30 min，最后用1%-3% bsa复溶，得到免疫纳米酶。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）包括：向磁珠中加入edc和nhss混合液，活化1 h，得到免疫磁珠；磁分离回收磁珠后，加入沙门氏菌多抗，偶联2-4 h；向偶联产物中加入封闭液封闭，磁分离回收磁珠，复溶液复溶。
6.一种基于fe-n-c纳米酶信号放大的比色生物传感器的微流控芯片，其特征在于，其为重力驱动式微流控芯片，包括进样孔、气孔、若干条流动通道以及如下6个腔室：反应腔室、清洗液腔室、tmb-h2o2体系腔室、分离腔室、废液腔室和检测腔室；其中，所述反应腔室预埋弱磁小铁球，通过将样本、免疫磁珠和免疫纳米酶与弱磁小铁球混合来提高捕获率；其中，所述免疫磁珠、免疫纳米酶同权利要求1-5任一项所述方法中的免疫磁珠、免疫纳米酶。
7.权利要求6所述微流控芯片在样本中致病菌的定性和定量检测中的应用。
8.一种基于fe-n-c纳米酶信号放大的比色生物传感器和微流控芯片的致病菌检测方法，其特征在于，利用权利要求6所述微流控芯片检测样本中的致病菌；
