本发明属于生物检测，具体涉及一种基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物、试剂盒及其应用。
背景技术：
1、多重pcr扩增技术具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究，自1988年首次提出多重pcr扩增这个概念以来，多重pcr扩增已经应用于许多领域，包括基因突变与缺失、基因分型与定量、遗传检测、伴药诊断等。
2、采用特异性引物对病原微生物进行扩增并检测的多重pcr技术已成为目前病原体检测不可或缺的一种手段，多重pcr可以对目前所有已知的病原微生物进行扩增、捕获，且可有效提高分辨率以及抗干扰性强等优良特性。
3、目前，现有技术中有关于采用多重pcr扩增技术对一种或几种病原微生物检测的报道，但很少有采用多重pcr扩增技术能同时对多种病原微生物检测的报道。
技术实现思路
1、本发明提供了一种基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物、试剂盒及其应用，该试剂盒能快速、准确检测并区分多种病原微生物。
2、在第一方面，本发明提供了一种基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物，其特征在于，包括如下所示引物组中的至少2种组合：如seq id no:1～6所示的扩增风疹病毒的引物组；如seq id no:7～12所示的扩增登革热病毒2型的引物组；如seq id no:13～18所示的扩增登革热病毒3型的引物组；如seq id no:19～24所示的扩增柯萨奇病毒b6型的引物组；如seq id no:25～30所示的扩增人类嗜t细胞病毒i型的引物组；如seq id no:31～38所示的扩增柯萨奇病毒b2型的引物组；如seq id no:39～44所示的扩增蜱传脑炎病毒的引物组；如seq id no:45～48所示的扩增黄热病毒的引物组；如seq id no:49～54所示的扩增柯萨奇病毒b5型的引物组；如seq id no:55～60所示的扩增人类冠状病毒229e的引物组；如seq id no:61～68所示的扩增戊型肝炎病毒的引物组；如seq id no:69～74所示的扩增新疆出血热病毒的引物组；如seq id no:75～80所示的扩增sars病毒的引物组；如seqid no:81～90所示的扩增萨比亚病毒的引物组；如seq id no:91～96所示的扩增人类冠状病毒oc43的引物组；如seq id no:97～102所示的扩增柯萨奇病毒a2型的引物组；如seq idno:103～110所示的扩增柯萨奇病毒a9型的引物组；如seq id no:111～116所示的扩增肠道病毒d70型的引物组；如seq id no:117～120所示的扩增丙型流感病毒的引物组；如seqid no:121～130所示的扩增裂谷热病毒的引物组；如seq id no:131～138所示的扩增人鼻病毒a的引物组；如seq id no:139～148所示的扩增人副肠孤病毒1型的引物组；如seq idno:149～156所示的扩增柯萨奇病毒a16型的引物组；如seq id no:157～168所示的扩增人副流感病毒4b型的引物组；如seq id no:169～176所示的扩增人星状病毒的引物组；如seqid no:177～184所示的扩增鹅口疮冠状病毒hku12的引物组；如seq id no:185～190所示的扩增穆尼亚冠状病毒hku13的引物组；如seq id no:191～198所示的扩增人副肠孤病毒3型的引物组；如seq id no:199～206所示的扩增肠道病毒a71型的引物组；如seq id no:207～214所示的扩增人类偏肺病毒的引物组；如seq id no:215～222所示的扩增柯萨奇病毒a6型的引物组；如seq id no:223～232所示的扩增人免疫缺陷病毒的引物组；如seq idno:233～248所示的扩增甲型流感病毒h7n9的引物组；如seq id no:249～258所示的扩增埃博拉病毒的引物组；如seq id no:259～268所示的扩增肠道病毒d68型的引物组；如seqid no:269～278所示的扩增新型布尼亚病毒的引物组；如seq id no:279～288所示的扩增人呼吸道合胞病毒b型的引物组；如seq id no:289～296所示的扩增丙型肝炎病毒1b亚型的引物组；如seq id no:297～302所示的扩增乙型脑炎病毒的引物组；如seq id no:303～312所示的扩增人类嗜t细胞病毒ii型的引物组；如seq id no:313～320所示的扩增甲型肝炎病毒的引物组；如seq id no:321～328所示的扩增柯萨奇病毒b3型的引物组；如seq idno:329～334所示的扩增人呼吸道合胞病毒a型的引物组；如seq id no:335～342所示的扩增人轮状病毒a的引物组；如seq id no:343～348所示的扩增登革热病毒1型的引物组；如seq id no:349～360所示的扩增人鼻病毒b的引物组；如seq id no:361～370所示的扩增麻疹病毒的引物组；如seq id no:371～378所示的扩增狂犬病病毒的引物组；如seq idno:379～388所示的扩增人副流感病毒3型的引物组；如seq id no:389～400所示的扩增甲型流感病毒h1n1的引物组；如seq id no:401～406所示的扩增腮腺炎病毒的引物组；如seqid no:407～412所示的扩增乙型流感病毒的引物组；如seq id no:413～420所示的扩增登革热病毒4型的引物组；如seq id no:421～430所示的扩增人副流感病毒2型的引物组；如seq id no:431～440所示的扩增人副流感病毒1型的引物组；如seq id no:441～456所示的扩增东方马脑炎病毒的引物组；如seq id no:457～466所示的扩增版纳病毒的引物组；如seq id no:467～476所示的扩增淋巴脉络丛脑膜炎病毒的引物组；如seq id no:477～482所示的扩增汉坦病毒的引物组；如seq id no:483～490所示的扩增人类冠状病毒nl63的引物组；如seq id no:491～500所示的扩增甲型流感病毒h5n1的引物组；如seq id no:501～510所示的扩增甲型流感病毒h3n2的引物组；如seq id no:511～518所示的扩增人鼻病毒c的引物组；如seq id no:519～524所示的扩增寨卡病毒的引物组；如seq id no:525～532所示的扩增肠道病毒a114的引物组；如seq id no:533～540所示的扩增柯萨奇病毒b3型的引物组；如seq id no:541～548所示的扩增诺如病毒的引物组；如seq id no:549～560所示的扩增2019新型冠状病毒的引物组；如seq id no:561～568所示的扩增人类冠状病毒hku1的引物组；如seq id no:569～574所示的扩增埃可病毒的引物组；如seq id no:575～580所示的扩增脊髓灰质炎病毒1的引物组；如seq id no:581～586所示的扩增脊髓灰质炎病毒3的引物组；如seq id no:587～594所示的扩增脊髓灰质炎病毒1的引物组；如seq id no:595～604所示的扩增肠道病毒d68型的引物组；如seq id no:605～608所示的人冠状病毒hku1的引物组。
3、本发明中，包括上述引物组中的至少2种组合，例如可以为2种组合、3种组合、4种组合、5种组合、6种组合、7种组合、8种组合、9种组合、10种组合、11种组合、12种组合、13种组合、14种组合、15种组合、16种组合、17种组合、18种组合、19种组合、20种组合、21种组合、22种组合、23种组合、24种组合、25种组合、26种组合、27种组合、28种组合、29种组合、30种组合、31种组合、32种组合、32种组合、33种组合、34种组合、35种组合、36种组合、37种组合、38种组合、39种组合、40种组合、41种组合、42种组合、43种组合、44种组合、45种组合、46种组合、47种组合、48种组合、49种组合、50种组合、51种组合、52种组合、53种组合、54种组合、55种组合、56种组合、57种组合、58种组合、59种组合、60种组合、61种组合、62种组合、63种组合、64种组合、65种组合、66种组合、67种组合、68种组合、69种组合、70种组合、71种组合、72种组合、73种组合、74种组合、75种组合。
4、在一些实施方案中，包括引物组中的至少30种组合。
5、在一些实施方案中，包括如下所示引物组：如seq id no:1～6所示的扩增风疹病毒的引物组；如seq id no:7～12所示的扩增登革热病毒2型的引物组；如seq id no:13～18所示的扩增登革热病毒3型的引物组；如seq id no:19～24所示的扩增柯萨奇病毒b6型的引物组；如seq id no:25～30所示的扩增人类嗜t细胞病毒i型的引物组；如seq id no:31～38所示的扩增柯萨奇病毒b2型的引物组；如seq id no:39～44所示的扩增蜱传脑炎病毒的引物组；如seq id no:45～48所示的扩增黄热病毒的引物组；如seq id no:49～54所示的扩增柯萨奇病毒b5型的引物组；如seq id no:55～60所示的扩增人类冠状病毒229e的引物组；如seq id no:61～68所示的扩增戊型肝炎病毒的引物组；如seq id no:69～74所示的扩增新疆出血热病毒的引物组；如seq id no:75～80所示的扩增sars病毒的引物组；如seq id no:81～90所示的扩增萨比亚病毒的引物组；如seq id no:91～96所示的扩增人类冠状病毒oc43的引物组；如seq id no:97～102所示的扩增柯萨奇病毒a2型的引物组；如seq id no:103～110所示的扩增柯萨奇病毒a9型的引物组；如seq id no:111～116所示的扩增肠道病毒d70型的引物组；如seq id no:117～120所示的扩增丙型流感病毒的引物组；如seq id no:121～130所示的扩增裂谷热病毒的引物组；如seq id no:131～138所示的扩增人鼻病毒a的引物组；如seq id no:139～148所示的扩增人副肠孤病毒1型的引物组；如seq id no:149～156所示的扩增柯萨奇病毒a16型的引物组；如seq id no:157～168所示的扩增人副流感病毒4b型的引物组；如seq id no:169～176所示的扩增人星状病毒的引物组；如seq id no:177～184所示的扩增鹅口疮冠状病毒hku12的引物组；如seq id no:185～190所示的扩增穆尼亚冠状病毒hku13的引物组；如seq id no:191～198所示的扩增人副肠孤病毒3型的引物组；如seq id no:199～206所示的扩增肠道病毒a71型的引物组；如seqid no:207～214所示的扩增人类偏肺病毒的引物组；如seq id no:215～222所示的扩增柯萨奇病毒a6型的引物组；如seq id no:223～232所示的扩增人免疫缺陷病毒的引物组；如seq id no:233～248所示的扩增甲型流感病毒h7n9的引物组；如seq id no:249～258所示的扩增埃博拉病毒的引物组；如seq id no:259～268所示的扩增肠道病毒d68型的引物组；如seq id no:269～278所示的扩增新型布尼亚病毒的引物组；如seq id no:279～288所示的扩增人呼吸道合胞病毒b型的引物组；如seq id no:289～296所示的扩增丙型肝炎病毒1b亚型的引物组；如seq id no:297～302所示的扩增乙型脑炎病毒的引物组；如seq idno:303～312所示的扩增人类嗜t细胞病毒ii型的引物组；如seq id no:313～320所示的扩增甲型肝炎病毒的引物组；如seq id no:321～328所示的扩增柯萨奇病毒b3型的引物组；如seq id no:329～334所示的扩增人呼吸道合胞病毒a型的引物组；如seq id no:335～342所示的扩增人轮状病毒a的引物组；如seq id no:343～348所示的扩增登革热病毒1型的引物组；如seq id no:349～360所示的扩增人鼻病毒b的引物组；如seq id no:361～370所示的扩增麻疹病毒的引物组；如seq id no:371～378所示的扩增狂犬病病毒的引物组；如seq id no:379～388所示的扩增人副流感病毒3型的引物组；如seq id no:389～400所示的扩增甲型流感病毒h1n1的引物组；如seq id no:401～406所示的扩增腮腺炎病毒的引物组；如seq id no:407～412所示的扩增乙型流感病毒的引物组；如seq id no:413～420所示的扩增登革热病毒4型的引物组；如seq id no:421～430所示的扩增人副流感病毒2型的引物组；如seq id no:431～440所示的扩增人副流感病毒1型的引物组；如seq id no:441～456所示的扩增东方马脑炎病毒的引物组；如seq id no:457～466所示的扩增版纳病毒的引物组；如seq id no:467～476所示的扩增淋巴脉络丛脑膜炎病毒的引物组；如seqid no:477～482所示的扩增汉坦病毒的引物组；如seq id no:483～490所示的扩增人类冠状病毒nl63的引物组；如seq id no:491～500所示的扩增甲型流感病毒h5n1的引物组；如seq id no:501～510所示的扩增甲型流感病毒h3n2的引物组；如seq id no:511～518所示的扩增人鼻病毒c的引物组；如seq id no:519～524所示的扩增寨卡病毒的引物组；如seqid no:525～532所示的扩增肠道病毒a114的引物组；如seq id no:533～540所示的扩增柯萨奇病毒b3型的引物组；如seq id no:541～548所示的扩增诺如病毒的引物组；如seq idno:549～560所示的扩增2019新型冠状病毒的引物组；如seq id no:561～568所示的扩增人类冠状病毒hku1的引物组；如seq id no:569～574所示的扩增埃可病毒的引物组；如seqid no:575～580所示的扩增脊髓灰质炎病毒1的引物组；如seq id no:581～586所示的扩增脊髓灰质炎病毒3的引物组；如seq id no:587～594所示的扩增脊髓灰质炎病毒1的引物组；如seq id no:595～604所示的扩增肠道病毒d68型的引物组；如seq id no:605～608所示的人冠状病毒hku1的引物组。
6、在一些实施方案中，组合物均带有通用序列。
7、在一些实施方案中，上游引物通用序列如seq id no:609所示，下游引物通用序列如seq id no:610所示。
8、在第二方面，本发明提供了上述任一项基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物在制备用于检测rna病毒的试剂盒中的应用。
9、在一些实施方案中，检测包括如下步骤：
10、s1、提取rna病毒核酸后，进行逆转录，得到cdna；
11、s2、使用上述组合物对cdna进行扩增，得到扩增产物，扩增产物经处理后，建库，得到混合文库；
12、s3、将混合文库中的扩增产物连接接头序列，得到待测样品；
13、s4、对待测样品进行测序，并分析检测结果。
14、在一些实施方案中，步骤s3中，接头序列为ont接头序列。
15、在第三方面，本发明提供了一种基于三代靶向测序检测rna病毒的试剂盒，包括上述任一项基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物。
16、在一些实施方案中，试剂盒还包括如下至少一种试剂：1)核酸提取及逆转录所需试剂；2)核酸扩增所需试剂；3)测序所需试剂。
17、本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明能同时扩增75种病原微生物，然后采用三代靶向测序，能快速准确地对上述75种病原微生物进行区分鉴定。
1.一种基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物，其特征在于，包括如下所示引物组中的至少2种组合：
2.根据权利要求1所述的基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物，其特征在于，包括引物组中的至少30种组合。
3.根据权利要求1所述的基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物，其特征在于，包括如下所示引物组：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物，其特征在于，所述组合物均带有通用序列。
5.根据权利要求4所述的基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物，其特征在于，上游引物通用序列如seq id no:609所示，下游引物通用序列如seq id no:610所示。
6.权利要求1-5中任一项所述的基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物在制备用于检测rna病毒的试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤s3中，所述接头序列为ont接头序列。
9.一种基于三代靶向测序检测rna病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-5中任一项所述的基于三代靶向测序检测rna病毒的组合物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还包括如下至少一种试剂：
