本发明属于分子生物学，具体涉及一种以金银花its2序列为靶标、基于proofman-lmtia的金银花成分快速检测方法、引物组、探针及其应用。
背景技术：
1、《中国药典》2020版规定金银花为忍冬科植物忍冬lonicerajaponicathunb.的干燥花蕾或带初开的花。其功能为清热解毒，疏散风热，主要用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热。药典同时规定山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬loniceramacranthoideshand.mazz.、红腺忍冬lonicera hypoglauca miq.、华南忍冬lonicera confusa dc.或黄褐毛忍冬lonicerafulvotomentosahsuet s.c.cheng的干燥花蕾或带初开的花，其功能与主治和金银花相同。研究表明金银花富含绿原酸和木犀草苷，性凉，清热解毒、疏风散热功效佳；而山银花富含绿原酸但木犀草苷含量很低，性偏热，药效欠佳。此外，由于主要有效成分含量的差异，导致金银花与山银花的价格存在较大差异。近年来，金银花的统货价格在135-260元/kg，是同时期山银花统货价格(53-100元/kg)的2.5倍左右。(https://www.kmzyw.com.cn/jiage/month_price_0311-0004.html)这种价格差异促使一些商家为了追求更高的经济利益，使用低价的山银花冒充或掺杂于高价的金银花中，用于饮片、食品、药品和饮料的生产和加工。这种行为严重损害了消费者的健康权益和经济利益。
2、为应对这一问题，2020版《中国药典》提供了性状、显微鉴别、薄层色谱鉴别、高效液相色谱(hplc)测定在内的金银花鉴定方法。然而，这些方法在实际应用中都存在一些局限性，如性状鉴定的主观性、显微鉴定需要专门的显微镜、薄层层析依赖于标准品、hplc法需要昂贵的仪器及专业的操作。鉴于金银花与山银花药材在形态上的相似性，以及在加工成成粉末后无法通过肉眼进行区分，开发一种快速、成本低、不需要昂贵仪器、适合于大众的金银花快速鉴定方法显得尤为迫切。
3、为解决以上问题，陈士林院士等开发了一种主要基于its2序列的药用植物中药材鉴定系统，该方法能够克服性状鉴定中的主观性缺陷，但仍需通过pcr技术扩增its2序列并进行dna测序和序列比对，这涉及到昂贵的仪器、专业操作人员和较长的检测时间。
4、cn104419754a公开了一种鉴别金银花和山银花的pcr-rflp方法；cn201210372344.6公开了一种基于pcr、dna测序的方法，可以鉴定金银花和山银花；cn104419755a公开了一种使用焦磷酸测序技术快速检测金银花成分掺伪量的方法；cn104946731a公开了一种快速检测金银花的pcr试剂盒及检测方法；cn103305595a公开了一种基于snp分型技术的鉴别金银花和山银花的方法。以上这些方法同样需要昂贵的仪器设备和较长的检测时间，且灵敏度有待提高。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明创新性地引入了ladder-shape meltingtemperature isothermal amplification(lmtia)技术(技术原理详见wang deguo,etal.ladder-shape melting temperature isothermal amplification of nucleicacids.biotechniques,2021,71(1):358-369，或专利cn2020111054053或pct/cn2020/133584)，设计lmtia引物和proofman探针，开发了一种快速、灵敏、特异的金银花成分检测方法。该方法不仅为金银花药材及其衍生产品提供了一种高效的真实性鉴定手段，而且极大地简化了检测流程，降低了成本，缩短了检测时间。
2、本发明是通过以下技术方案实现的：
3、根据本发明实施例的第一方面，本发明提供了一种特异性针对金银花its2序列的lmtia引物组和proofman探针；所述引物组和探针的序列如下：
4、lj-f1：5'-gacgcccaggcagacgttttaatcccgtgaaccatcgagt-3'
5、lj-b1：5'-cgtcacgcatcgcttttccgctcgcgaccctg-3'
6、lj-lf：5'-taatggcttcgggcgcaact-3'
7、lj-lb：5'-ccccgccccgcctccca-3'
8、ljprobe：5'bhq1-ccccgccccgct-3'-6-fam。
9、根据本发明实施例的第二方面，本发明提供一种用于金银花及其衍生产品(包含金银花成分的食品、药品等产品)真实性检测的试剂盒，使得金银花成分的检测更加便捷和标准化；所述试剂盒包含第一方面所述的引物组和探针。
10、根据本发明实施例的第三方面，本发明提供一种根据上述第一方面的lmtia引物组和proofman探针或上述第二方面的试剂盒在金银花原材料及其衍生产品(包含金银花成分的食品、药品等产品)检测中的应用。
11、根据本发明实施例的第四方面，本发明提供一种基于proofman-lmtia的金银花及其衍生产品快速检测方法，包括：取待检样品，提取样品基因组dna，采用上述第一方面所述的lmtia引物组和proofman探针或第二方面所述的试剂盒配制proofman-lmtia反应体系；将配制好的proofman-lmtia反应体系置于等温设备中进行等温扩增，以检测样品中是否存在金银花成分。
12、作为进一步优选的技术方案，所述的检测样品中是否存在金银花成分的判断方法具体为：在反应完成的样品检测管中，若在绿色荧光通道(fam)能够检测到荧光信号，并且扩增结果图中出现指数扩增曲线，则样品中含有金银花成分；若在绿色荧光通道(fam)检测不到荧光信号，并且扩增结果图中无指数扩增曲线，则样品中不包含金银花成分。
13、作为进一步优选的技术方案，所述的等温设备包括实时荧光定量pcr系统。
14、作为进一步优选的技术方案，proofman-lmtia反应体系中lj-f1∶lj-b1∶lj-lf∶lj-lb∶ljprobe的摩尔比为4∶4∶1∶1∶2.5。
15、作为进一步优选的技术方案，proofman-lmtia反应体系为10μl，组成成分为：5μl的2×mix预混液、0.4μl的gpv8超保真dna聚合酶、0.16μl的引物lj-f1、0.16μl的lj-b1、0.04μl的环引物lj-lf、0.1μl的ljprobe、2μl的基因组dna模板、2.10μl的depc处理水。
16、作为进一步优选的技术方案，所述等温扩增的温度为67℃，循环次数为40-60，每30s采集一次荧光信号，共采集40-60次荧光信号。
17、本发明提出了一种基于proofman-lmtia技术的金银花成分快速检测方法。该方法利用lmtia引物和proofman探针，在恒温条件下进行快速扩增反应，显著提高了检测的效率和灵敏度。与传统方法相比，本发明不仅简化了操作流程，降低了成本，而且大幅缩短了检测时间，具有广泛的应用前景。通过本发明的实施，可以有效地解决金银花及其衍生产品在生产、加工和流通环节中的真伪鉴定问题，保障消费者健康权益，促进中医药产业的健康发展。
18、本发明的有益效果包括：
19、本发明的用于检测金银花成分的proofman-lmtia引物组、探针具有良好的特异性和灵敏度，检测速度快，在恒温条件下即可实现对样品中金银花成分的准确检测。
20、本发明的用于检测金银花成分的lmtia检测的方法简单、快捷，在等温条件下扩增约30分钟即可实现样品中金银花成分的快速精准检测，并具有较好的重复性和较高的稳定性。
21、本发明的lmtia引物组和proofman探针在67℃时特异性最佳。
22、本发明的lmtia引物组和proofman探针的绝对灵敏度可达10pg/μl。
23、本发明的lmtia引物组和proofman探针不仅可用于检测金银花种子、种苗、藤茎、饮片等原材料，而且还可用于含金银花成分食品、药品和固体饮料等终端产品的真实性鉴定。
1.用于金银花检测的lmtia引物组和proofman探针，其特征在于，所述引物组和探针以金银花its2为靶序列，所述引物组和探针的序列为：
2.用于金银花真实性检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和探针。
3.权利要求1所述的lmtia引物组和proofman探针或权利要求2所述的试剂盒在金银花原材料、含金银花成分的产品检测中的应用。
4.一种基于proofman-lmtia的金银花快速检测方法，其特征在于，包括：取待检样品，提取样品基因组dna，采用权利要求1所述的lmtia引物组和proofman探针或权利要求2所述的试剂盒配制proofman-lmtia反应体系；将配制好的proofman-lmtia反应体系置于等温设备中进行等温扩增，以检测样品中是否存在金银花成分。
5.根据权利要求4所述的基于proofman-lmtia的金银花快速检测方法，其特征在于，所述的检测样品中是否存在金银花成分的判断方法具体为：在反应完成后的样品检测管中，若在绿色荧光通道能够检测到绿色荧光信号，并且扩增结果图中出现指数扩增曲线，则样品中含有金银花成分；若在绿色荧光通道检测不到绿色荧光信号，并且扩增结果图中无指数扩增曲线，则样品中不含金银花成分。
6.根据权利要求4所述的基于proofman-lmtia的金银花快速检测方法，其特征在于，所述的等温设备包括实时荧光定量pcr系统。
7.根据权利要求4所述的基于proofman-lmtia的金银花快速检测方法，其特征在于，所述proofman-lmtia反应体系中lj-f1∶lj-b1∶lj-lf∶lj-lb∶ljprobe的摩尔比为4∶4∶1∶1∶2.5。
8.根据权利要求7所述的基于proofman-lmtia的金银花快速检测方法，其特征在于，所述proofman-lmtia反应体系为10μl，组成成分为：5μl的2×mix预混液、0.4μl的gpv8超保真dna聚合酶、0.16μl的引物lj-f1、0.16μl的lj-b1、0.04μl的环引物lj-lf、0.04μl的环引物lj-lb、0.1μl的ljprobe、2μl的基因组dna模板、2.10μl的depc处理水。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的基于proofman-lmtia的金银花快速检测方法，其特征在于，所述等温扩增的温度为67℃，循环次数为40-60，每30s采集一次荧光信号，共采集40-60次荧光信号。
