本发明涉及用于纯化抗α4β7抗体或其片段的方法。相关申请本技术要求2019年6月10日提交的美国临时申请62/859,580的优先权。前述申请的全部内容以引用的方式并入本文。序列表本技术含有序列表，所述序列表已经以ascii格式以电子方式提交，并且特此以引用的方式整体并入。所述ascii副本于2020年6月5日创建，命名为t103022_1120wo_sl.txt且大小为10,015字节。
背景技术：
1、蛋白质的大规模经济纯化已成为生物技术行业中越来越重要的问题。一般而言，生物药物为使用已工程化成大量产生目标治疗性蛋白质的原核(例如细菌)细胞系或真核(例如哺乳动物或真菌)细胞系，通过细胞培养而产生。由于所用细胞系为活生物体，所以必须对其饲喂包含糖、氨基酸和生长因子的复合细胞培养基，所述复合细胞培养基有时由动物血清制剂供应。将所需重组治疗性蛋白质与工艺相关杂质，包括例如细胞培养基组分、宿主细胞蛋白质(hcp)、宿主核酸和/或色谱材料，以及产物相关杂质诸如聚集体、错误折叠的物质或目标蛋白质的片段分离以实现足以用作人用治疗剂的纯度为巨大的挑战。
2、产物相关杂质和工艺相关杂质，包括聚集体在内，可能会干扰纯化工艺，在储存期间影响蛋白质，和/或在将抗体作为药物施用于受试者后，可能会引起不良反应(shukla等人,j.chromatogr.b.analyt.technol.biomed.life sci.,848(1),28-39)。
3、因此，本领域中仍然需要将治疗性蛋白质，例如抗体纯化至高纯度，同时有效地移除杂质，提高蛋白质的回收率并维持治疗需求的改进的方法。
技术实现思路
1、本发明尤其提供用于例如从液体溶液纯化抗α4β7抗体，诸如维多珠单抗(vedolizumab)的方法。
2、在一个方面中，本发明的特征在于一种用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液获得包含抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括使包含蛋白质a的基质与包含所述抗α4β7抗体和一种或多种杂质的所述液体溶液接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述蛋白质a；用洗涤溶液洗涤包含蛋白质a的所述基质；以及通过使包含蛋白质a的所述基质与ph值为3.2至4的洗脱溶液接触，从所述基质洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含所述抗α4β7抗体的组合物，其中所述抗α4β7抗体为人源化抗体，为igg1抗体，包含含有如seqid no:4中所示的cdr3结构域、如seq id no:3中所示的cdr2结构域和如seq id no:2中所示的cdr1结构域的重链可变区；并且包含含有如seq id no:8中所示的cdr3结构域、如seqid no:7中所示的cdr2结构域和如seq id no:6中所示的cdr1结构域的轻链可变区。
3、在一个实施方案中，所述方法用于从包含所述抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液获得包含少于1％的高分子量(hmw)聚集体的组合物，所述方法包括使包含蛋白质a的基质与包含所述抗α4β7抗体和一种或多种杂质的所述液体溶液接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述蛋白质a；所述用洗涤溶液洗涤包含蛋白质a的所述基质；以及所述通过使包含蛋白质a的所述基质与ph值为3.2至4的洗脱溶液接触，从所述基质洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含少于1％ hmw聚集体的组合物。
4、在一个实施方案中，所述蛋白质a固定于固相上。在一个实施方案中，所述固相包含珠粒、凝胶和树脂中的一者或多者。
5、在一个实施方案中，所述洗涤溶液的ph值为约7。在一个实施方案中，所述洗脱溶液包含柠檬酸。
6、在一个实施方案中，所述洗脱溶液的ph值为3.2至3.7。
7、在另一个方面中，本发明的特征在于一种用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液获得包含抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括使包含抗α4β7抗体和至少一种杂质的溶液与疏水相互作用色谱(hic)树脂在允许所述抗α4β7抗体流动通过所述hic树脂的条件下接触，由此获得包含所述抗α4β7抗体的组合物，其中所述hic树脂被表征为高疏水性hic树脂，其中所述抗α4β7抗体为人源化抗体，为igg1抗体，包含含有如seq idno:4中所示的cdr3结构域、如seq id no:3中所示的cdr2结构域和如seq id no:2中所示的cdr1结构域的重链可变区；并且包含含有如seq id no:8中所示的cdr3结构域、如seq idno:7中所示的cdr2结构域和如seq id no:6中所示的cdr1结构域的轻链可变区。
8、在一个实施方案中，所述方法用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液获得包含所述抗α4β7抗体和少于0.6％ hmw聚集体的组合物，所述方法包括所述使包含抗α4β7抗体和至少一种杂质的溶液与hic树脂在允许所述抗α4β7抗体流动通过所述hic树脂的条件下接触，由此获得包含所述抗α4β7抗体和少于0.6％ hmw聚集体的组合物，其中所述抗α4β7抗体为人源化抗体，为igg1抗体，包含含有如seq id no:4中所示的cdr3结构域、如seq id no:3中所示的cdr2结构域和如seq id no:2中所示的cdr1结构域的重链可变区；并且包含含有如seq id no:8中所示的cdr3结构域、如seq id no:7中所示的cdr2结构域和如seq id no:6中所示的cdr1结构域的轻链可变区。
9、在一个实施方案中，所述hic树脂用ph值小于约7.2的磷酸盐缓冲液平衡。在一个实施方案中，所述磷酸盐缓冲液包含约0.35mm至约0.15mm的磷酸钾。
10、在一个实施方案中，树脂负载量为约55至75mg/ml。
11、在一个实施方案中，所述组合物包含少于约0.22ppm的残留蛋白质a。
12、在一个实施方案中，所述组合物含有少于约0.3ppm的宿主细胞蛋白质(hcp)。
13、在一个实施方案中，所述高疏水性hic树脂的平均孔径为约50至150μm。
14、在一个实施方案中，所述高疏水性hic树脂的平均孔径为约100nm和/或孔径为约100μm。
15、在另一个方面中，本发明的特征在于一种用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液产生包含抗α4β7抗体的制剂的方法，所述方法包括使包含所述抗α4β7抗体和一种或多种杂质的所述液体溶液与混合模式色谱树脂接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述树脂；用洗涤溶液洗涤所述混合模式色谱树脂；以及通过使所述混合模式色谱树脂与ph值等于或高于ph 3.9的洗脱溶液接触，从所述树脂洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含纯化的抗α4β7抗体的制剂，其中所述抗α4β7抗体包含seq id no:1中所示的重链可变区和seq id no:2中所示的轻链可变区。
16、在前述方面的一个实施方案中，所述方法用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液获得包含少于1％ hmw聚集体的制剂，所述方法包括使包含所述抗α4β7抗体和一种或多种杂质的所述液体溶液与混合模式色谱树脂接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述树脂；所述用洗涤溶液洗涤所述混合模式色谱树脂；以及所述通过使所述混合模式色谱树脂与ph值等于或高于ph 3.9的洗脱溶液接触，从所述树脂洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含少于1％ hmw聚集体的制剂。
17、在一个实施方案中，所述洗脱溶液的ph值等于或高于ph 4.1。在另一个实施方案中，所述洗脱溶液的ph值为约ph 3.9至约ph 4.4。
18、在一些实施方案中，所述洗脱溶液的电导率为30ms/cm或更低。在某些实施方案中，所述洗脱溶液的电导率为约20ms/cm至约30ms/cm。
19、在一些实施方案中，所述洗脱溶液包含浓度为约160mm至约240mm的nacl。
20、在某些实施方案中，所述混合模式色谱树脂为capto adhere impres。
21、在上述方面的一些实施方案中，所述方法还包括使用阳离子交换(cex)树脂纯化所述抗α4β7抗体。在一些此类实施方案中，所述cex树脂以结合/洗脱模式操作。
22、在另一个方面中，本发明的特征在于一种用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液产生包含抗α4β7抗体的制剂的方法，所述方法包括使包含所述抗α4β7抗体和一种或多种杂质的所述液体溶液与混合模式色谱树脂接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述树脂；用洗涤溶液洗涤所述混合模式色谱树脂；以及通过使所述混合模式色谱树脂与ph值等于或低于ph 4.2且电导率等于或低于28ms/cm的洗脱溶液接触，从所述树脂洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含纯化的抗α4β7抗体的制剂，其中所述抗α4β7抗体包含seq idno:1中所示的重链可变区和seq id no:2中所示的轻链可变区。
23、在前述方面的一些实施方案中，所述方法用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液获得包含产率增加的抗α4β7抗体的制剂，所述方法包括所述使包含所述抗α4β7抗体和一种或多种杂质的所述液体溶液与混合模式色谱树脂接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述树脂；所述用洗涤溶液洗涤所述混合模式色谱树脂；以及所述通过使所述混合模式色谱树脂与ph值等于或低于ph 4.2且电导率等于或低于28ms/cm的洗脱溶液接触，从所述树脂洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含产率增加的抗α4β7抗体的制剂。
24、在一些实施方案中，所述洗脱溶液的ph值等于或低于4.0。在其他实施方案中，所述洗脱溶液的ph值为约ph 4.2至约ph 3.8。
25、在一些实施方案中，所述洗脱溶液的电导率为约18ms/cm至约28ms/cm。
26、在一些实施方案中，所述洗脱溶液包含浓度为约160mm至约240mm的nacl。
27、在前述方面的一些实施方案中，所述混合模式色谱树脂与每升树脂至少55g的抗α4β7抗体接触。在某些实施方案中，所述混合模式色谱树脂与每升树脂约55g至约80g的抗α4β7抗体接触。
28、在前述方面的一些实施方案中，所述混合模式色谱树脂为capto adhere impres。
29、在上述方面的一些实施方案中，所述方法还包括使用阳离子交换(cex)树脂纯化所述抗α4β7抗体。在一些此类实施方案中，所述cex树脂以结合/洗脱模式操作。
30、在另一个方面中，本发明的特征在于一种用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液产生包含抗α4β7抗体的制剂的方法，所述方法包括使包含所述抗α4β7抗体和一种或多种杂质的所述液体溶液与阳离子交换(cex)树脂接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述树脂；用洗涤溶液洗涤所述cex树脂；以及通过使所述cex树脂与电导率等于或低于16ms/cm的洗脱溶液接触，从所述树脂洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含纯化的抗α4β7抗体的制剂，其中所述抗α4β7抗体包含seq id no:1中所示的重链可变区和seq id no:2中所示的轻链可变区。
31、在前述方面的一些实施方案中，所述方法用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液获得包含降低水平的hmw聚集体的制剂，所述方法包括所述使包含所述抗α4β7抗体和一种或多种杂质的所述液体溶液与cex树脂接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述树脂；所述用洗涤溶液洗涤所述cex树脂；以及所述通过使所述cex树脂与电导率等于或低于16ms/cm的洗脱溶液接触，从所述树脂洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含降低水平的hmw聚集体的制剂。
32、在上述方面的一些实施方案中，所述洗脱溶液的电导率等于或低于14ms/cm。在其他实施方案中，所述洗脱溶液的电导率为约11-16ms/cm。在又一些其他实施方案中，所述洗脱溶液的电导率为约12-14ms/cm。
33、在上述方面的一些实施方案中，所述洗脱溶液包含浓度为约70mm至约110mm的nacl。
34、在上述方面的一些实施方案中，所述洗脱溶液的ph值为约ph 5至约ph6。在某些实施方案中，所述洗脱溶液的ph值为约ph 5.1至约ph 5.8。
35、在上述方面的一些实施方案中，所述抗α4β7抗体以每升树脂约25-70g抗体的浓度负载于所述cex树脂上。在某些实施方案中，所述抗α4β7抗体以每升树脂约30-60g抗体的浓度负载于所述cex树脂上。
36、在上述方面的一些实施方案中，所述cex树脂为nuvia hr-s。
37、在上述方面的一些实施方案中，所述方法还包括使用混合模式色谱树脂纯化所述抗α4β7抗体。在一些此类实施方案中，所述混合模式色谱树脂以结合/洗脱模式操作。
38、在另一个方面中，本发明的特征在于一种用于从包含抗α4β7抗体的主要同种型和一种或多种碱性同种型种类的液体溶液产生包含抗α4β7抗体的制剂的方法，所述方法包括使包含所述抗α4β7抗体和一种或多种碱性同种型种类的所述液体溶液与阳离子交换(cex)树脂接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述树脂；用洗涤溶液洗涤所述cex树脂；以及通过使所述cex树脂与电导率等于或高于11ms/cm的洗脱溶液接触，从所述树脂洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含纯化的抗α4β7抗体的制剂，其中所述抗α4β7抗体包含seq id no:1中所示的重链可变区和seq id no:2中所示的轻链可变区。
39、在前述方面的一些实施方案中，所述方法用于从包含抗α4β7抗体的主要同种型和一种或多种碱性同种型种类的液体溶液获得包含降低水平的α4β7抗体的碱性同种型种类的制剂，所述方法包括使包含所述抗α4β7抗体和一种或多种碱性同种型种类的所述液体溶液与cex树脂接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述树脂；所述用洗涤溶液洗涤所述cex树脂；以及所述通过使所述cex树脂与电导率等于或高于11ms/cm的洗脱溶液接触，从所述树脂洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含降低水平的碱性同种型种类的制剂。
40、在一个实施方案中，纯化的组合物包含约4％至约20％的碱性同种型。
41、在上述方面的一些实施方案中，所述洗脱溶液的电导率等于或高于12ms/cm。在其他实施方案中，所述洗脱溶液的电导率为约11-16ms/cm。在又一些其他实施方案中，所述洗脱溶液的电导率为约12-14ms/cm。
42、在上述方面的一些实施方案中，所述洗脱溶液的ph值为约ph 5至约ph6。在某些实施方案中，所述洗脱溶液的ph值为约ph 5.1至约ph 5.8。
43、在上述方面的一些实施方案中，所述抗α4β7抗体以每升树脂约25-70g抗体的浓度负载于所述cex树脂上。在某些实施方案中，所述抗α4β7抗体以每升树脂约30-60g抗体的浓度负载于所述cex树脂上。
44、在一些实施方案中，所述洗脱溶液包含氯化钠，例如70至110mm的氯化钠。
45、在上述方面的一些实施方案中，所述cex树脂为nuvia hr-s。
46、在上述方面的一些实施方案中，所述方法还包括使用混合模式色谱树脂纯化所述抗α4β7抗体。在一些此类实施方案中，所述混合模式色谱树脂以结合/洗脱模式操作。
47、在任何上述方面的一个实施方案中，所述抗体在中国仓鼠卵巢(cho)宿主细胞中产生。
48、在一个实施方案中，所述宿主细胞为gs-cho细胞。
49、在任何上述方面的一个实施方案中，所述抗α4β7抗体包含如seq id no:1中所示的重链可变区序列和如seq id no:5中所示的轻链可变区序列。
50、在任何上述方面的一个实施方案中，所述抗α4β7抗体为维多珠单抗。
51、另外，本发明还包括以下实施方案：
52、1.一种用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液获得包含少于1％hmw聚集体的组合物的方法，所述方法包括
53、使包含蛋白质a的基质与包含所述抗α4β7抗体和一种或多种杂质的所述液体溶液接触，由此使所述抗α4β7抗体结合至所述蛋白质a；
54、用洗涤溶液洗涤包含蛋白质a的所述基质；以及
55、通过使包含蛋白质a的所述基质与ph值为3.2至4的洗脱溶液接触，从所述基质洗脱所述抗α4β7抗体，由此获得包含少于1％ hmw聚集体的组合物，
56、其中所述抗α4β7抗体为人源化抗体，为igg1抗体，包含含有如seq id no:4中所示的cdr3结构域、如seq id no:3中所示的cdr2结构域和如seq id no:2中所示的cdr1结构域的重链可变区；并且包含含有如seq id no:8中所示的cdr3结构域、如seq id no:7中所示的cdr2结构域和如seq id no:6中所示的cdr1结构域的轻链可变区。
57、2.如项目1的方法，其中所述蛋白质a固定于固相上。
58、3.如项目2的方法，其中所述固相包含珠粒、凝胶和树脂中的一者或多者。
59、4.如项目1至3中任一项的方法，其中所述洗涤溶液的ph值为约7。
60、5.如项目1至4中任一项的方法，其中所述洗脱溶液包含柠檬酸。
61、6.如项目1至5中任一项的方法，其中所述洗脱溶液的ph值为3.2至3.7。
62、7.一种用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液获得包含抗α4β7抗体和少于0.6％ hmw聚集体的组合物的方法，所述方法包括
63、使包含抗α4β7抗体和至少一种杂质的溶液与疏水相互作用色谱(hic)树脂在允许所述抗α4β7抗体流动通过所述hic树脂的条件下接触，由此获得包含所述抗α4β7抗体和少于0.6％ hmw聚集体的组合物，
64、其中所述hic树脂被表征为高疏水性hic树脂，
65、其中所述抗α4β7抗体为人源化抗体，为igg1抗体，包含含有如seq id no:4中所示的cdr3结构域、如seq id no:3中所示的cdr2结构域和如seq id no:2中所示的cdr1结构域的重链可变区；并且包含含有如seq id no:8中所示的cdr3结构域、如seq id no:7中所示的cdr2结构域和如seq id no:6中所示的cdr1结构域的轻链可变区。
66、8.如项目7的方法，其中所述hic树脂用ph值小于约7.2的磷酸盐缓冲液平衡。
67、9.如项目8的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包含约0.35mm至约0.15mm的磷酸钾。
68、10.如项目7至9中任一项的方法，其中所述树脂负载量为约55至75mg/ml。
69、11.如项目7至10中任一项的方法，其中所述组合物包含少于约0.22ppm的残留蛋白质a。
70、12.如项目7至11中任一项的方法，其中所述组合物含有少于约0.3ppm的宿主细胞蛋白质(hcp)。
71、13.如项目7至12中任一项的方法，其中所述高疏水性hic树脂的平均孔径为约50至150μm。
72、14.如项目7至12中任一项的方法，其中所述高疏水性hic树脂的平均孔径为约100nm和/或孔径为约100μm。
73、15.如项目1至14中任一项的方法，其中所述抗体在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中产生。
74、16.如项目15的方法，其中所述宿主细胞为gs-cho细胞。
75、17.如项目1至16中任一项的方法，其中所述抗α4β7抗体包含如seq id no:1中所示的重链可变区序列和如seq id no:5中所示的轻链可变区序列。
76、18.如项目1至16中任一项的方法，其中所述抗α4β7抗体为维多珠单抗。
1.一种用于从包含抗α4β7抗体和一种或多种杂质的液体溶液产生包含抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括
2.如权利要求1所述的方法，其中包含所述抗α4β7抗体的所述组合物包含约1％或更少的hmw聚集体。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述洗脱溶液的电导率等于或低于14ms/cm。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述洗脱溶液的电导率为约11-16ms/cm。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述洗脱溶液的电导率为约12-14ms/cm。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述洗脱溶液包含浓度为约70mm至约110mm的nacl。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述洗脱溶液的ph值为约ph 5至约ph6。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述洗脱溶液的ph值为约ph 5.1至约ph 5.8。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述抗α4β7抗体以每升树脂约25-70g抗体的浓度负载于所述cex树脂上。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述抗α4β7抗体以每升树脂约30-60g抗体的浓度负载于所述cex树脂上。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述cex树脂为强cex树脂，任选地其中所述cex树脂为nuvia hr-s。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使用混合模式色谱树脂纯化所述抗α4β7抗体。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述混合模式色谱树脂以结合/洗脱模式操作。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述抗体在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中产生。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞为gs-cho细胞。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中获得的所述组合物包含纯化的抗α4β7抗体，并且其中所述方法还包括将所述抗α4β7抗体配制成适于人使用的制剂的后续步骤。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述纯化的抗α4β7抗体配制成干燥、冻干的制剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述方法还包括用液体使所述干燥、冻干的制剂复原，由此使所述制剂适于施用。
19.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法包括将纯化的抗α4β7抗体配制成液体制剂，由此使所述抗α4β7抗体适于通过皮下注射施用。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述抗α4β7抗体包含如seq id no:1中所示的重链可变区序列和如seq id no:5中所示的轻链可变区序列。
21.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述抗α4β7抗体为维多珠单抗。
22.一种组合物，所述组合物包含抗α4β7抗体，其中所述组合物能够通过权利要求1-21中任一项所述的方法获得。
