本发明涉及微生物冷冻保藏，具体涉及一种微生物冷冻保护剂及其制备方法和应用。
背景技术：
1、益生菌是一种只要摄取足够数量就能对宿主产生有益作用的活性微生物。它们对宿主具有多种积极作用，如抑制肠道致病菌生长、调节宿主肠道稳态、调节宿主免疫反应等。目前公认定植于肠道活菌数量为106cfu/g甚至更高才能发挥益生菌的功效。目前市场上流通的益生菌或含有益生菌的产品大多需要经过一系列加工方式才能面对消费者。但是，益生菌容易受到加工条件尤其是极端的温度和人体胃肠道的影响而降低其活力甚至死亡。目前已经提出很多提高益生菌对不良环境抵抗力的方法，其中微胶囊化被认为是最简便有效的方法(deprisco&mauriello,2016)。
2、通过喷雾干燥法、冷冻干燥法、乳化法等，将核心材料包埋在壁材中的过程被称为微胶囊化，形成的物理屏障可以有效减少外界环境因素对芯材的损伤，从而延长活性成分的保存时间(mehtaetal.,2022)。与上述其他微胶囊技术相比，冷冻干燥法因其低温加工方式而特别适用于包埋益生菌或热敏性化合物。此外，冷冻干燥可以保持菌株原有的成分与性质，还具有运输方便，保质期较长的优点。例如，已有研究以果胶、海藻酸盐为包封材料，以冷冻干燥的方式对双歧杆菌进行微胶囊化，发现以果胶作为壁材的微胶囊表现出更高的包埋率。adriana(2023)等人研究了冻干魏斯氏菌微胶囊在不同温度和时间储存过程的存活率，发现在5℃储存六个月期间仍能保持益生菌的特性，说明了微胶囊化是提高益生菌忍耐力的有效手段。事实上，不管利用哪种方式对益生菌进行保护处理，微胶囊化大都涉及乳化这一关键步骤，选择具有良好乳化稳定性的材料有利于实现高效的微胶囊化。另一方面，作为最有效的保鲜技术之一，冷冻保存在维持食品的安全和质量方面发挥着关键作用。然而，冰晶的形成不可避免地会对微胶囊壁材造成损害(xie等人,2023)。因此，十分迫切需要寻求兼具良好乳化性与冻融稳定性的壁材用于提高对益生菌的保护作用。
3、目前微胶囊主要使用植物和动物提取的蛋白质(如乳清蛋白和大豆蛋白)、多糖(如果胶和阿拉伯糖)作为封装剂(yao等人，2020)。淀粉是一种具有无毒、成本低的天然多糖，因其生物相容性和生物可降解性而受到广泛关注，广泛存在于谷物、薯类等植物细胞壁中。然而，天然淀粉存在乳化稳定性差、糊化温度高等不足，无法满足生产者日益增长的严格需求。
4、十二烯基丁二酸酐(ddsa，c16h26o3)是琥珀酸酐的12碳烯基衍生物，目前关于ddsa改性大米淀粉(可作为食品风味成分的吸附剂)的报道较少，也未见将其应用于益生菌微胶囊化的冷冻保护剂的报道。
技术实现思路
1、本发明的目的是针对上述问题，提供一种微生物冷冻保护剂及其制备方法和应用。
2、本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
3、本发明的第一方面提供一种微生物冷冻保护剂，包括如下组分：1～6％％(w/v)(优选2～6％或者4～6％或者3～5％)改性淀粉、3～8％(v/v)(优选4～6％)植物油，余量为水；
4、所述改性淀粉是采用淀粉质量的1～9wt％(优选3～9wt％或5～9wt％或7～9wt％)的十二烯基丁二酸酐作为改性剂对淀粉进行改性得到的。
5、所述改性淀粉的制备方法为：
6、取淀粉与水混合，搅拌均匀得到淀粉悬浮液，调节ph调至6.5～8.5(优选ph7.5～8.5)备用；
7、称取淀粉质量1～9wt％的十二烯基丁二酸酐，采用无水乙醇稀释3～10倍(优选3～8倍或3～6倍或4～6倍)后加入淀粉悬浮液中进行反应，反应过程中调节、保持反应体系ph为7.5～8.0；充分反应，反应结束后调节混合物ph至6.5～8.5(优选ph6.5～7.5或6.5～7.0)，用60～80％乙醇溶液洗涤以除去未反应完全的改性剂，最后，将得到的湿产品干燥、粉碎制备为粉末，即得。
8、优选地，上述制备改性淀粉方法，取淀粉与水混合，搅拌均匀得到浓度为20～40％(w/v)(优选25～35％)的淀粉悬浮液；
9、优选地，所述十二烯基丁二酸酐的使用量为淀粉质量的3～9wt％或5～9wt％或7～9wt％；
10、调节ph值采用碱溶液或者酸溶液，所述碱溶液为浓度为1～5wt％(优选2～4wt％)的naoh或者koh溶液，所述酸溶液包括浓度为0.6～1.4m的盐酸溶液；
11、将湿产品在40～55℃干燥20～30h、粉碎制备为粉末。
12、优选地，所述淀粉选自大米淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉、豆类淀粉；
13、所述植物油选自玉米油、花生油、大豆油、葵花子油、菜籽油、亚麻籽油、橄榄油、椰子油、棉籽油、芝麻油、食用调和油。
14、本发明的第二方面提供上述的微生物冷冻保护剂的制备方法，包括如下步骤：制备上述的改性淀粉，保存备用；准备植物油，改性淀粉和植物油分开储藏备用。
15、本发明的第三方面提供上述的微生物冷冻保护剂在微胶囊化微生物中的应用。
16、优选地，上述的应用技术方案中，所述微生物包括益生菌；所述益生菌包括乳酸菌、双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌；所述乳酸菌包括乳酸片球菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌以及拉曼乳杆菌。
17、优选地，上述的应用技术方案中，应用方法为：以所述冷冻保护剂为壁材将所述微生物包裹住得到微胶囊。
18、优选地，上述的应用技术方案中，应用方法为：
19、取改性淀粉加入水中制备为1～6％(w/v)的淀粉悬浮液，对其进行糊化，冷却后加入微生物菌体，混合均匀，菌体与淀粉糊的质量比为1:5～10(优选1:5～7)；
20、然后加入3～8％(v/v)植物油进行均质乳化，乳化后离心去掉上清、收集残留物进行冷冻干燥，完成对微生物的微胶囊化。
21、优选地，上述的应用技术方案中，加入植物油后均质乳化，均质速度为10000～20000r/min；
22、乳化后5000～10000rpm下离心10～20分钟，去掉上清、收集残留物进行冷冻干燥；
23、冷冻干燥的方法为：在-80℃～-50℃预冻2～4h后转移至冷冻干燥机进行冷冻干燥。
24、本发明的有益效果是：
25、冷冻干燥是乳酸菌产业化的主流方法，但低温处理会降低乳酸菌的存活率。为提高其在冷冻过程的存活率，本发明提供了一种具有优越抗冻能力的淀粉衍生物，其可作为冷冻保护剂提高益生菌在冷冻干燥过程中的存活率。
26、本发明以十二烯基丁二酸酐(ddsa)作为改性剂，获取了一系列不同取代度的ddsa改性大米淀粉。傅里叶红外光谱与核磁共振图谱表明酯化反应成功地将ddsa基团引入至大米淀粉原有结构之中，xrd结果表明酯化反应破坏了淀粉的长程有序性同时降低了淀粉的相对结晶度。扫描电镜结果表明酯化反应主要发生在淀粉颗粒表面，改性后的淀粉表明更加粗糙。上述结构的变化导致淀粉理化性质改变，也就是说改性后的大米淀粉糊化特性、回生特性发生显著改变，且随着取代度的增加，大米淀粉的糊化温度、弹性模量与黏性模量降低但最终粘度升高。此外，相比于原大米淀粉，改性后的大米淀粉冻融稳定性显著提高且与取代度呈正相关。考虑到改性后的大米淀粉乳乳化能力(包括乳化能力与乳化稳定性)显著改善，本发明将改性大米淀粉作为壁材，应用于乳酸菌的微胶囊化，结果表明以ddsa-5为壁材的微胶囊包埋率高达94.57％。在-40℃保存2个月后，其活菌数为11.17log cfu/g，模拟胃肠消化实验表明微胶囊化具有良好的缓释效果。
1.一种微生物冷冻保护剂，其特征在于，包括如下组分：1～6％(w/v)改性淀粉、3～8％(v/v)植物油，余量为水；
2.根据权利要求1所述的微生物冷冻保护剂，其特征在于：所述改性淀粉的制备方法为：取淀粉与水混合，搅拌均匀得到淀粉悬浮液，调节ph调至6.5～8.5备用；
3.根据权利要求2所述的微生物冷冻保护剂，其特征在于：
4.根据权利要求1所述的微生物冷冻保护剂，其特征在于：
5.权利要求1至4任一项所述的微生物冷冻保护剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：制备权利要求1至4任一项所述的改性淀粉，保存备用；准备植物油，改性淀粉和植物油分开储藏备用。
6.权利要求1至4任一项所述的微生物冷冻保护剂在微胶囊化微生物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：应用方法为：以所述冷冻保护剂为壁材将所述微生物包裹住得到微胶囊。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：应用方法为：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
