本发明涉及生物医药材料，特别涉及一种基于生物3d打印的人源工程化细胞外基质的制备方法。
背景技术：
1、细胞外基质（extracellular matrix，ecm）是一种动态而错综复杂、由细胞外大分子和矿物质组成的三维网络微环境，具有优异的生物物理、生物力学和生物化学特性，可直接或间接调控细胞的增殖、黏附、迁移和分化，并在组织和器官的稳态和再生中发挥关键作用。随着组织工程学在再生医学领域的迅速发展，ecm引起了人们的广泛关注。动物组织来源的ecm及重组胶原蛋白材料已在医美领域得到了广泛应用，但它们存在安全性上的潜在风险，且产量低、批次与批次之间的差异大，在功能上也无法完美还原人源ecm的生物学特性。
2、因此，现代材料科学正在努力解决这些局限性，例如通过开发更先进的生物兼容材料来实现更安全、更有效的治疗效果。与动物组织来源的ecm支架类似，人细胞来源的ecm支架也具有高度优势的生物物理和生物化学特性，特别是它们能够在体外由多种不同的细胞类型产生。此外，人细胞来源的ecm支架更接近于天然的ecm微环境。目前，生产人源化细胞外基质还停留在2d、2.5d培养水平，无法实现人源工程化细胞外基质的高效量产。所以如何开发能够高效生产活性更高、功能更强大、更安全、更稳定的人源工程化细胞外基质，成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
1、本发明目的在于公开了一种基于生物3d打印的人源工程化细胞外基质的制备方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
2、本发明第一方面在于提供一种利用3d培养载体实现的人源工程化细胞外基质的制备方法。
3、本发明第二方面在于提供由本发明第一方面所述制备方法制得的人源工程化细胞外基质。
4、本发明第一方面所述制备方法包括以下步骤：
5、1）将人源细胞与生物3d打印墨水混合，打印成3d培养载体，在培养装置中添加诱导剂，诱导细胞分泌细胞外基质；
6、2）去除所述3d培养载体中的支架并进行脱细胞处理，获得人源工程化细胞外基质。
7、利用生物3d打印技术将人源细胞与支架结合，形成3d培养载体，能够实现大规模、高效率生产高质量的人源工程化细胞外基质，并且规避动物来源材料的病毒传输和免疫排异问题以及异体蛋白带来的免疫和过敏风险。
8、在进一步的应用实施方式中，在步骤1）前还包括要利用3d生物反应器进行混合扩增培养，具体步骤包括：
9、a）将微球载体按1:10~30的体积比浸入pbs缓冲液中，浸泡1~3小时后弃去上清液，用新的pbs洗涤3次，弃去pbs缓冲液，加入新的pbs缓冲液，灭菌，加入含青链霉素和胎牛血清的dmem完全培养基润洗置换，4℃放置过夜；
10、b）将预处理后的微球载体与人源细胞共同接种至3d生物反应器中，混合培养；所述微球载体用量为3~10 ml/30 ml，接种细胞量为500~1000万/30 ml。
11、进一步，步骤b）所述混合培养包括细胞贴壁期和细胞培养期，所述细胞贴壁期的搅拌参数设置为每个循环以20~40 rpm的速率搅拌5~10分钟后停止30~60分钟，重复循环20~30次；所述细胞培养期的搅拌参数设置为40~60 rpm持续搅拌；待微球载体长满细胞，裂解微球，收获细胞。
12、经过扩增培养所述人源细胞可以由初始约3000万细胞扩增至3~5亿，有助于批量化实现后续的3d培养载体的制备。
13、在进一步的应用实施方式中，步骤1）所述诱导剂是含有0.1~10%胎牛血清、10~50μg/ml抗坏血酸、10~50 μg/ml硫酸葡聚糖和1~5 ng/ml tgf-β的dmem培养基。诱导剂中的组成对于人源细胞的细胞外基质分泌具有明显影响，经反复优化测试后，优选为含有1%青链霉素、2.5~10%胎牛血清、40~50 μg/ml抗坏血酸、40~50 μg/ml硫酸葡聚糖和3~5 ng/mltgf-β的dmem培养基。
14、在进一步的应用实施方式中，步骤1）所述培养装置每2天更换一次新鲜的所述诱导剂，诱导培养7~14天，待细胞充分分泌细胞外基质后再进行所述支架的去除。
15、在进一步的应用实施方式中，步骤1）所述打印是采用同轴打印技术；所述3d培养载体包括内芯和包裹内芯的外层，所述内芯为含有人源细胞的水凝胶材料，所述外层为生物高分子材料。优选地，所述水凝胶材料选自透明质酸、明胶中的至少一种，所述生物高分子材料选自明胶、胶原、透明质酸、纤维蛋白、壳聚糖或聚乳酸中的至少一种。
16、在进一步的应用实施方式中，步骤2）所述去除支架的方法是水解或酶解所述3d培养载体，在4℃下1000~1500×g离心3~5分钟，弃去上清，加入pbs缓冲液清洗，得到细胞-细胞外基质沉淀。
17、在进一步的应用实施方式中，向所述细胞-细胞外基质沉淀加入预热的细胞裂解液，37℃裂解，4℃，1000~1500×g离心3~5分钟，弃去上清，得到细胞外基质。
18、在进一步的应用实施方式中，所述pbs缓冲液ph为7.4，不含钙离子和镁离子。
19、本发明第二方面所述人源工程化细胞外基质是由人皮肤来源成纤维细胞通过前述制备方法制得。所获得的人源工程化细胞外基质的红外光谱图的特征峰有位于3440 cm-1处酰胺a，位于2930 cm-1处的酰胺b、位于1640 cm-1处的酰胺i、位于1539 cm-1处的酰胺ii和位于1250 cm-1处的酰胺iii带，1450 cm-1处的峰面积与酰胺iii带的吸收峰面积比接近1:1，说明所述人源工程化细胞外基质保持了胶原蛋白完整的三螺旋结构。
1.一种人源工程化细胞外基质的制备方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，在步骤1）前还包括利用3d生物反应器进行混合扩增培养，具体步骤包括：
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤b）所述混合培养包括细胞贴壁期和细胞培养期，所述细胞贴壁期的搅拌参数设置为每个循环以20~40 rpm的速率搅拌5~10分钟后停止30~60分钟，重复循环20~30次；所述细胞培养期的搅拌参数设置为40~60 rpm持续搅拌；待微球载体长满细胞，裂解微球，收获细胞。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1）所述诱导剂是含有0.1~10%胎牛血清、10~50 μg/ml抗坏血酸、10~50 μg/ml硫酸葡聚糖和1~5 ng/ml tgf-β的dmem培养基。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1）所述培养装置每2天更换一次新鲜的所述诱导剂，诱导培养7~14天。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1）所述打印是采用同轴打印技术；所述3d培养载体包括内芯和包裹内芯的外层，所述内芯为含有人源细胞的水凝胶材料，所述外层为生物高分子材料。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2）所述去除支架的方法是水解或酶解所述3d培养载体，在4℃下1000~1500×g离心3~5分钟，弃去上清，加入pbs缓冲液清洗，得到细胞-细胞外基质沉淀。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，向所述细胞-细胞外基质沉淀加入预热的细胞裂解液，37℃裂解3~5分钟，4℃下1000~1500×g离心3~5分钟，弃去上清，得到细胞外基质。
9.根据权利要求3或7所述制备方法，其特征在于，所述pbs缓冲液ph为7.4，不含钙离子和镁离子。
10.一种人源工程化细胞外基质，其特征在于，由权利要求1至9任一项所述制备方法制得。
