本发明涉及氨基酸检测领域，尤其是涉及一种基于非稳定同位素标记的氨基酸衍生化试剂对及其制备方法、应用。
背景技术：
1、手性氨基酸异常水平与很多疾病有关，生物样本中血清或尿样中d-氨基酸通常可以辅助诊断一些疾病。然而，生物样品中d-氨基酸的丰度相对于l-氨基酸较低，因此d-氨基酸定量方法要求较高的灵敏度和选择性。
2、化学衍生化可以实现d/l-氨基酸在色谱柱上的有效分离，还能实现d-氨基酸信号的增敏和较低的背景信号来实现d-氨基酸的痕量检测。因而，将化学衍生化和色谱技术相结合是目前较为常见的d/l-氨基酸检测技术。其中，同位素标记因具有良好的分析性能成为d/l-氨基酸的定量检测的首选，但其仍然存在以下问题：（1）分析物与内标物之间存在同位素干扰和相互电离抑制，能够分离的对象较少；（2）现有氨基酸衍生化试剂的合成过程复杂，成本高。
3、综上，开发新型的手性氨基酸衍生化试剂对减少检测成本、提高d/l-氨基酸在质谱上的超灵敏信号及快速定量检测具有重要的意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提出了一种非稳定同位素标记的氨基酸衍生化试剂对，还提供了一种基于非稳定同位素标记的氨基酸衍生化试剂对的制备方法和应用。
2、为实现上述目的，本发明采取下述技术方案：
3、本发明所述的基于非稳定同位素标记的氨基酸衍生化试剂，包括n,n-二甲基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯和n,n-二乙基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯，其结构式分别为：
4、。
5、本发明还提供了一种非稳定同位素标记的氨基酸衍生化试剂对的制备方法，所述制备方法包括以下内容：
6、将l-苯丙氨酸和多聚乙醛或多聚甲醛和混合在一起，加入tfe和nabh4，在回流条件下搅拌反应，反应结束后用甲醇-丙酮重结晶，得到白色粉末n,n-二乙基苯丙氨酸或n,n-二甲基苯丙氨酸；
7、以n,n-二甲基甲酰胺作为溶剂，将n,n-二乙基苯丙氨酸或n,n-二甲基苯丙氨酸与n-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐室温搅拌反应；待反应至澄清后纯化得到白色粉末状的n,n-二乙基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯或n,n-二甲基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯。
8、有益效果是：本发明采用两步合成法制成n,n-二乙基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯和n,n-二甲基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯，合成简单，成本低，有利于量化投产。
9、本发明还提供了氨基酸衍生化试剂在测定氨基酸中的应用，其中，所述应用是以n,n-二甲基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯衍生化的氨基酸作为内标。具体包括：
10、第一步，向样品中加入n,n-二乙基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯进行衍生化反应；
11、第二步，采用lc-mrm对衍生后的待测液进行定性拆分和定量检测，其中定量检测包括以下内容：用n,n-二乙基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯和n,n-二甲基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯分别将氨基酸标准品衍生化，将衍生化后的氨基酸按一定体积比混合，得到不同浓度比的混合衍生化氨基酸；
12、用lc-mrm对不同浓度比的混合衍生化氨基酸检测分析，以n,n-二乙基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯-氨基酸和n,n-二甲基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯-氨基酸的浓度比为横坐标，以n,n-二乙基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯-氨基酸和n,n-二甲基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯-氨基酸的面积比作为纵坐标，绘制标准曲线；
13、向衍生化后的样品中加入已知浓度的n,n-二甲基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯-氨基酸作为内标液，用lc-mrm对其检测分析，根据氨基酸的质谱参数进行定性，根据标准曲线和内标确定样品中氨基酸的含量；
14、其中，lc-mrm的液相色谱条件为流动相a为0.1%甲酸水，流动相b为0.1%甲酸乙腈，洗脱条件为：0-23 min 10%-90%b；质谱条件为：esi源为正离子模式，采用多反应监测扫描模式，isvf设置为5500 v，gs1设置为55psi，gs2为55 psi，cur设置25psi，tem设置为500℃。
15、优选的，所述内标液中的氨基酸包括包括d/l-ala、d/l-val、d/l-leu、d/l-ile、d/l-met、d/l-pro、d/l-trp、d/l-ser、d/l-tyr、d/l-phe、d/l-asn、d/l-gln、d/l-thr、d/l-asp、d/l-glu、d/l-lys、d/l-arg、d/l-his、d/l-homoser、d/l-cit、d/l-kynu、d/l-abu和gly。
16、有益效果是：本发明合成的衍生化试剂对，合成步骤简单，成本低，可在一定程度上降低手性氨基酸的检测成本；另外，本发明的试剂对能实现43种氨基酸（包括20对d/l-氨基酸）的拆分，能够实现51种氨基酸的定量，具有较高的灵敏度、准确度、精密度和稳定性，可用于复杂物样品中d/l-氨基酸的拆分和检测。
1.一种非稳定同位素标记的氨基酸衍生化试剂对，其特征在于：包括n,n-二甲基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯和n,n-二乙基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯，结构式分别为：
2.一种如权利要求1所述的基于非稳定同位素标记的氨基酸衍生化试剂对的制备方法， 其特征在于：所述制备方法包括以下内容：
3.权利要求1所述的氨基酸衍生化试剂对或权利要求2制备得到的氨基酸衍生化试剂对在拆分手性氨基酸中的应用，其中，所述应用是以n,n-二甲基苯丙氨酸琥珀酰亚胺酯衍生化的氨基酸作为内标。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用包括以下检测步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述内标液中的氨基酸包括包括d/l-ala、d/l-val、d/l-leu、d/l-ile、d/l-met、d/l-pro、d/l-trp、d/l-ser、d/l-tyr、d/l-phe、d/l-asn、d/l-gln、d/l-thr、d/l-asp、d/l-glu、d/l-lys、d/l-arg、d/l-his、d/l-homoser、d/l-cit、d/l-kynu、d/l-abu和gly。
