本发明涉及生化试剂测定，特别涉及一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒，还涉及所述抗链球菌溶血素o测定试剂盒制备方法和应用。
背景技术：
1、链球菌溶血素 o(streptolysino，slo) 是多种溶血性链球菌都会表达的一种含-sh基的蛋白质，易被氧化形成-ss基，并暂时失去溶血能力，借助还原剂可恢复活力并重新具有溶血作用，溶血毒素“o”能溶解红细胞，具有很强的抗原性，并对机体多种细胞有毒性作用。人体感染了a组溶血性链球菌后，“o”溶血素在体内作为一种抗原物质存在，引起人体产生slo特异抗体，血清中出现大量抗链球菌溶血素o抗体。
2、抗链球菌溶血素o (anti-streptolysin o，简称aso)亦称抗链球菌溶血素“o”(aso)，人受溶血链球菌感染后数月内可查到抗链球菌溶血素“o”，血清中的aso抗体与溶血毒素“o”结合，不出现溶血，若被检血清中有相应抗体表示机体曾受过溶血性链球菌感染侵害。因此aso测定对于诊断链球菌感染很有价值，其存在及含量可反映感染的严重程度。
3、健康成人aso正常值因地区、年龄、季节、气候、链球菌流行情况有所差别，一般不高于200iu/ml。风湿热、猩红热、结节性红斑、急性肾小球肾炎、急性扁桃体炎等检测时aso明显升高，另外少数结核病、肝炎、结缔组织病及多发性骨髓瘤病的患者体内aso含量也会增高。故依据抗链球菌溶血毒素“o”抗体效价高低可辅助风湿热、急性肾小球肾炎等链球菌性反应引起的疾病诊断。
4、目前胶乳凝集法、溶血抑制法、酶联免疫法、免疫比浊法等检测方法都可用于抗链球菌溶血素o的检测。以上检测方法中，胶乳免疫比浊法拥有操作简单、特异性强、成本较低，可兼顾检测灵敏度和线性范围，且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定等优点。其检验原理是采用化学偶联法将抗原结合于胶乳颗粒上，与相应标本中抗体发生免疫反应聚集形成网状结构，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，在特定的波长下测定聚集物所产生的浊度，获得样本中被检物的含量。
5、目前市面上免疫比浊法的抗链球菌溶血素“o”的测定试剂盒包括试剂一、试剂二；其中试剂一为试剂缓冲液，试剂二为乳胶微球包被抗原试剂；该部分是通过化学偶联法将抗原共价结合于胶乳颗粒上，但实际操作过程中活化后的微球与slo抗原混合后会有出现聚集现象且产生沉淀，为解决该步骤问题试剂偶联中多采用超声波处理及离心与重悬，操作繁琐，制备时间较长，试剂均一性和稳定性较难控制。另外血清中胆红素、血红蛋白和乳糜等组分对aso试剂盒的影响较大，试剂盒抗干扰能力差，因此检测灵敏度较低。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供一种aso测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，灵敏度高，线性好，成本低的液体试剂盒。
2、本发明的技术方案：首先将微球与标记缓冲液混合，然后再将抗原加入混合液中，应用化学方法偶联，通过水溶性碳化二亚胺(edc) 活化羧化胶乳微球与溶血素“o”以羧基与氨基共价结合形式，维持了活化后微球的表面静电排斥力，防止团聚现象的发生，将抗原包被到乳胶微球上获得胶乳试剂，制备抗链球菌溶血素“o”检测试剂盒。
3、本检测试剂盒包括试剂r1与r2，具体成分如下：
4、试剂r1中含有以下成分：
5、tris缓冲液 10-100mmol/l；
6、增敏剂 10-20g/l；
7、nacl 9-15g/l；
8、表面活性剂
9、海藻酸钠 0.01%-2%；
10、dtpa 0.01%-2%；
11、防腐剂 0.5-1 ml/l；
12、试剂r2中含有以下成分：
13、混合缓冲液：
14、标记缓冲液 10-100mmol/l；
15、保存缓冲液 20-100mmol/l；
16、sds 0.1-0.25g/l；
17、季戊四醇 0.1-0.25g/l；
18、slo抗原包被胶乳微球 10-50mg/l；
19、保护剂 10-25g/l；
20、封闭剂 1.5-40ml/l；
21、表面活性剂 0.01%-2%；
22、防腐剂 0.5-1ml/l；
23、其中所述百分比为体积比。
24、优选地，所述试剂r1的ph 为7.0-7.4。
25、优选地，所述试剂r2 的ph为6.8-7.4。
26、优选地，标记缓冲液为甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、mes缓冲液、tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、mops缓冲液、dipso缓冲液中的任意一种。更优选为磷酸盐缓冲液。
27、优选地，所述试剂r1中，增敏剂为 peg2000、peg4000、peg6000、peg8000、peg10000中的任意一种，更优选为peg4000。
28、优选地，所述试剂r1中，无机盐为kcl、 cacl2、nacl、bacl2、mgcl2、alcl3中的任意一种，更优选为 nacl。
29、优选地，试剂r1、r2中表面活性剂选自tween-20、span-20、triton x-100、tx-10、op-10、on-870、 f68、brij35、十六烷基氯化铵、海藻酸钠、甘油、dtpa（二甲基三胺五乙酸）中的至少一种。试剂r1中表面活性剂更优选海藻酸钠与dtpa，试剂r2中表面活性剂更优选为tween-20。
30、优选地，试剂r2中封闭剂选自bsa、明胶、乙醇胺、血清、甘氨酸、脱脂奶粉中的至少一种，更优选为乙醇胺、明胶。
31、优选地，试剂r2中保护剂选自bsa、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇中的至少一种，更优选为海藻糖。
32、优选地，所述r1与r2中防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、proclin300、异噻唑啉酮中的任意一种，更优选为proclin300。
33、试剂r2中，抗原slo为重组蛋白，所述slo抗原包被胶乳微球平均粒径为140nm。
34、测定试剂盒的使用方法包括如下步骤：血清样品与试剂r1混匀孵育后，加入r2混匀孵育20s后，在主波长546nm及副波长800下检测吸光度值，5min后，再次检测获取吸光度值，通过血清标准品数据计算aso的含量。
35、本发明的有益效果
36、1）本发明稳定的抗链球菌溶血素o测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。
37、2）本发明的抗链球菌溶血素o测定试剂盒及其检测方法，采用胶乳免疫比浊法，通过添加原料及偶联时改变加入原料的顺序，避免了加入抗体沉淀现象，具体的将微球与含有0.015%的sds及0.01%的季戊四醇的偶联缓冲液与slo抗原优先混匀孵育，通过edc活化羧基将抗原包被到微球表面，缓冲液中的sds与季戊四醇协同作用维持了活化后微球的表面静电排斥力，避免聚沉及团聚现象的发生，该偶联方案无需超声、离心与重悬处理，即可获得稳定的胶乳试剂，操作简便，减少偶联时间，提高了试剂的灵敏度，保证试剂的均一性和稳定性，可适用于各类全自动生化分析仪进行分析。
38、3）本发明试剂盒特地添加了复合封闭剂乙醇胺与明胶更好的结合活化微球上的未结合抗原的羧基位点，小分子与大分子相互协调封闭多余的位点，够有效降低抗原抗体结合的空间位阻问题，有利于抗原决定簇的暴露，保证抗原空间构象稳定减少封闭对结合表位的影响，提高试剂的灵敏度；表面活性剂海藻酸钠与dtpa的螯作用与界面活性特性能与乳糜微粒形成聚合物且分散和掩蔽乳糜微粒，避免了因聚合物过多造成的非特异性反应。在复合封闭剂以及表活剂协同作用下提高了抗干扰能力有效提高试剂盒的灵敏度、稳定性和特异性；
39、4）本发明试剂盒可在具备有400-800nm波长的全自动生化分析仪上检测血液中抗链球菌溶血素o的含量，直接上机使用，快速精准，自动化程度高，大大提高工作效率。且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。
1.一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒，试剂盒包括试剂r1与r2，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒，其特征在于，试剂r1的ph为7.0-7.4；所述试剂r2 的ph为6.8-7.4。
3.根据权利要求1所述的一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒，其特征在于，标记缓冲液为甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、mes缓冲液、tris-hcl缓冲液、hepes缓冲液、mops缓冲液、dipso缓冲液中的任意一种，更优选为磷酸盐缓冲液；
4.根据权利要求1所述的一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒，其特征在于，试剂r1、r2中表面活性剂选自tween-20、span-20、triton x-100、tx-10、op-10、on-870、 f68、brij35、十六烷基氯化铵、海藻酸钠、甘油、dtpa中的至少一种；试剂r1中表面活性剂更优选海藻酸钠与dtpa，试剂r2中表面活性剂更优选为tween-20。
5.根据权利要求1所述的一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒，其特征在于，试剂r2中封闭剂选自bsa、明胶、乙醇胺、血清、甘氨酸、脱脂奶粉中的至少一种，更优选为乙醇胺、明胶；
6.根据权利要求1所述的一种抗链球菌溶血素o测定试剂盒，其特征在于，slo抗原包被胶乳微球的平均粒径为140nm。
7.一种权利要求1-6任一项所述的抗链球菌溶血素o测定试剂盒制备方法，其特征在于，
