本发明属于吡嗪类化合物分析，具体涉及一种同时分离多组同分异构体并定量检测24种吡嗪类化合物的方法。
背景技术：
1、吡嗪是含有两个氮原子于1,4位的六元环杂环化合物，可由某些生物化学反应如美拉德反应和微生物代谢合成。这些化合物具有低阈值、强香气渗透性，能与其他风味成分相互作用的特点，即使在低浓度下对可可、白酒和葡萄酒等食品的风味有显著影响。在白酒行业中，吡嗪化合物的种类和含量是评估产品感官品质的关键指标，通过分析这些化合物，可以鉴定白酒的年份、等级和产地。
2、吡嗪环上不同位置的不同取代基衍生出多种吡嗪类化合物，形成了众多结构类似物甚至是同分异构体，例如，2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪，2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪和2-乙基-6-甲基吡嗪以及3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和5-乙基-2,3-二甲基吡嗪，它们之间的差异主要体现在取代基的相对位置上。尽管这些同分异构体在风味特性和具体功能上存在细微差别，但它们相似的极性和相近的沸点使得在分析过程中的分离变得尤为困难。这种难度导致目标化合物的识别出现误差，影响其定量分析，进而对食品的风味评价、质量控制以及相关研究产生阻碍。
3、吡嗪类化合物具有一定挥发性，通常采用气相色谱法结合质谱和氮磷检测器进行分析。这种方法虽然广泛应用，但也面临一些挑战：例如，难以分离沸点相近的同分异构体，检测范围有限，以及样品预处理过程繁琐，这些都影响了其在液体样品检测和分析中的实用性。为了克服这些限制，液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)技术被引入，它特别适用于分析弱挥发性化合物。通过这种技术，目标成分在色谱环节得以分离，在质谱环节则进行特异性检测，从而实现对多组分的精确定性和定量。目前，lc-ms/ms技术已经逐渐在白酒中吡嗪类化合物的检测中发挥重要作用。
4、专利cn109917033a公开了一种测定酱香型白酒中羟基吡嗪类化合物的方法，该方法利用lc-ms/ms对酱香型白酒中3种羟基吡嗪类化合物进行了检测，包括2-羟丙基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-羟甲基-3,6-二乙基-5-甲基吡嗪、2-羟基-3,5-二甲基-6-丁基吡嗪。
5、专利cn104977370a公开了一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法，该方法以5mm甲酸铵水溶液和乙腈为流动相，在hypersil gold色谱柱(100mm×2.1mm,3μm)上对9种吡嗪类化合物进行分离，并使用质谱仪进行检测。该发明提供了一种快速、高效检测吡嗪类化合物的方法，在10min内完成分析，但未涉及到同分异构体的分离与检测，这极大地降低了分析难度。
6、专利cn104977370a公开了一种液质联用快速检测白酒中吡嗪类物质的方法，该方法使用苯基色谱柱geminic6-phenyllc column(250×4.6mm,5μm)，以含有0.1％甲酸和0.1％三氟乙酸水溶液和甲醇作为流动相，使用三重四极杆质谱仪进行检测，完成对包括2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪这组同分异构体在内的8种吡嗪类化合物分离与检测。该发明证明了苯基色谱柱分离吡嗪同分异构体的可行性。然而，在色谱端使用了三氟乙酸作为流动相，其中的氟离子会对质谱造成污染，且所检测的吡嗪类化合物种类仍然较少，难以对多组同分异构体进行有效分离。
7、当前，大多数对吡嗪类化合物的分析检测方法普遍存在局限性。这些方法通常检测的吡嗪类化合物种类有限，并且样品处理的通量较低。更为关键的是，没有涵盖多组吡嗪同分异构体的识别和测定，这对综合分析食品中吡嗪类化合物的量效关系时造成影响。
技术实现思路
1、针对现有技术之不足，本发明提供了同时分离多组吡嗪同分异构体并定量检测24种吡嗪类化合物的方法，本发明至少解决的技术问题为现有吡嗪类化合物的分析检测方法难以对多组同分异构体进行有效分离的问题。
2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：同时分离多组同分异构体并定量检测24种吡嗪类化合物的方法，包括如下步骤：
3、a.将24种吡嗪类化合物的标准品溶液配制成不同浓度梯度的混合标准品工作液，以备检测；
4、b.对待测样品进行前处理，得到样品溶液，以备检测；
5、c.将上述混合标准品工作液和样品溶液分别依次注入到lc-ms/ms中进行检测；
6、d.绘制色谱峰面积与对应吡嗪类化合物浓度的标准工作曲线，再将待测目标物的峰面积带入到对应的标准曲线中计算，获得待测目标物的浓度。
7、上述步骤a中，所述24种吡嗪类化合物分别是吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2-乙烯基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-丙基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-乙酰基-3-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、5-乙基-2,3-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2,6-二乙基吡嗪、2-异丁基-3-甲基吡嗪、2-乙酰基-3,5-二甲基吡嗪、2-乙酰基-3,6-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇和2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪。
8、上述步骤b中，所述待测样品为含有吡嗪类化合物的发酵液体。
9、进一步的是，上述待测样品为白酒、朗姆酒、葡萄酒、食醋中的任意一种。
10、上述步骤b中，所述前处理的方法为：将含酒精的待测样品与蒸馏水按1:1的体积比混合，过滤，收集滤液为样品溶液；将不含酒精的待测样品与萃取液按1:1的体积比混合，进行超声提取并离心，收集上清液为样品溶液。
11、进一步的是，采用0.22μm有机滤膜过滤；萃取液为乙醇、乙酸和水混合液，体积比为70:10:20。
12、上述步骤c中，所述lc-ms/ms为高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪，检测方法为使用水相为甲酸水和有机相为甲醇的流动相对待测目标物在苯基柱上进行梯度洗脱，在电喷雾正离子条件下使用多反应监测模式对待测目标物进行测定。
13、进一步的是，高效液相色谱条件：色谱柱柱温为35～45℃；流速为0.3～0.6ml/min；水相为0.5％～1％的甲酸水溶液，有机相为甲醇；梯度洗脱程序为0～22min，有机相为15％～7％；22～28min，有机相为7％～15％；28～38min，有机相为15％～7％；38～48min，有机相为7％～30％；48～52min，有机相为30％～15％；52～57min，有机相为15％～80％；57～65min，有机相为80％～15％；65～75min，有机相为15％。
14、更进一步的是，色谱柱柱温为40℃；水相为0.7％的甲酸水溶液。
15、进一步的是，质谱分析条件：离子喷雾电压4.0kv；雾化气流：氮气3.0l/min；干燥气流：氮气10l/min；加热气流：空气10l/min；碰撞气：氩气；脱溶剂管温度220～260℃；加热模块温度300～500℃；接口温度270～330℃。
16、更进一步的是，脱溶剂管温度250℃；加热模块温度400℃；接口温度30℃。
17、本发明的有益效果是：
18、1.本发明通过高效液相色谱串联三重四极杆质谱法，对吡嗪类化合物进行了特异性分离，确保了分析的精准度。一次性完成对24种吡嗪类化合物的全面分析，极大提高了检测通量和实验效率。为深入研究和精确监测吡嗪类化合物的生成水平提供技术支撑。
19、2.本发明通过优化高效液相色谱条件，显著提升了吡嗪类化合物的分离效率。面对质谱分析中因前体离子和产物离子分子量相同导致的同分异构体难以区分的挑战，本发明采用了特定的流动相和梯度洗脱程序，成功区分了2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪，以及2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等关键同分异构体。此外，3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和5-乙基-2,3-二甲基吡嗪，以及2,3-二乙基吡嗪和2,6-二乙基吡嗪这些同分异构体也得到了有效的分离，从而显著提高了定性分析的准确性。
20、3.本发明通过优化质谱条件，包括离子对的选择和碰撞电压的设定，显著提升了分析性能。优化后的质谱条件不仅大幅降低了检出限，还增强了灵敏度，扩大了检测范围，使其能够覆盖从μg/l到mg/l的吡嗪类化合物含量，进而确保了对吡嗪类化合物含量的精确测定，为相关领域的研究和应用提供了可靠的分析工具。
1.同时分离多组同分异构体并定量检测24种吡嗪类化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述24种吡嗪类化合物分别是吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2-乙烯基-6-甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-丙基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-乙酰基-3-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、5-乙基-2,3-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2,6-二乙基吡嗪、2-异丁基-3-甲基吡嗪、2-乙酰基-3,5-二甲基吡嗪、2-乙酰基-3,6-二甲基吡嗪、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、(3,5,6-三甲基吡嗪-2-基)甲醇和2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述待测样品为含有吡嗪类化合物的发酵液体；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述前处理的方法为：将含酒精的待测样品与蒸馏水按1:1的体积比混合，过滤，收集滤液为样品溶液；将不含酒精的待测样品与萃取液按1:1的体积比混合，进行超声提取并离心，收集上清液为样品溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤b中，采用0.22μm有机滤膜过滤；萃取液为乙醇、乙酸和水混合液，体积比为70:10:20。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中，所述lc-ms/ms为高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪，检测方法为使用水相为甲酸水和有机相为甲醇的流动相对待测目标物在苯基柱上进行梯度洗脱，在电喷雾正离子条件下使用多反应监测模式对待测目标物进行测定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：高效液相色谱条件：色谱柱柱温为35～45℃；流速为0.3～0.6ml/min；水相为0.5％～1％的甲酸水溶液，有机相为甲醇；梯度洗脱程序为0～22min，有机相为15％～7％；22～28min，有机相为7％～15％；28～38min，有机相为15％～7％；38～48min，有机相为7％～30％；48～52min，有机相为30％～15％；52～57min，有机相为15％～80％；57～65min，有机相为80％～15％；65～75min，有机相为15％。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：色谱柱柱温为40℃；水相为0.7％的甲酸水溶液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：质谱分析条件：离子喷雾电压4.0kv；雾化气流：氮气3.0l/min；干燥气流：氮气10l/min；加热气流：空气10l/min；碰撞气：氩气；脱溶剂管温度220～260℃；加热模块温度300～500℃；接口温度270～330℃。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：脱溶剂管温度250℃；加热模块温度400℃；接口温度300℃。
