本发明属于动物基因工程，具体涉及以猪slc26a3基因作为调控肠上皮细胞屏障功能的靶基因，并提供干扰slc26a3基因的小干扰rna、过表达slc26a3基因的过表达载体的应用。
背景技术：
1、肥胖症等代谢性疾病的患病率在全球范围内日益剧增。代谢紊乱导致相关组织器官功能障碍，其中，坏死性结肠炎、炎症性肠病等不仅引起肠道代谢紊乱，还通过肠道代谢产物及营养物质吸收的改变影响机体健康。肠道不仅具有食物消化、营养吸收和激素分泌等多种功能，还作为含有大量免疫细胞的器官，广泛地参与免疫调节和代谢稳态维持。肠道功能是通过多种细胞的协同作用实现的，包括上皮细胞、间质细胞和免疫细胞。肠内的机械屏障是由上皮细胞形成的，其中，杯状细胞分泌的粘液负责形成肠道的化学屏障。肠道的黏液层将肠细胞与管腔内的细菌分开，黏液屏障的破坏导致微生物渗透上皮细胞并与之接触。入侵的微生物促进免疫细胞的募集和促炎细胞因子的分泌，导致上皮细胞的损伤。肠道屏障完整性的丧失被认为会导致无法控制的免疫反应或允许微生物群的无限制入侵，从而导致各种疾病，包括代谢紊乱，如肥胖和糖尿病。因此，针对肠道屏障完整性的研究有望预防和治疗代谢紊乱。
2、溶质相关载体26a3（slc26a3），是 slc26硫酸盐渗透/阴离子转运体家族的成员。该基因编码的蛋白质是肠上皮管腔膜中一种关键的cl--hco3-交换蛋白，预测分子量为85kda，主要在结肠上皮细胞的顶端膜表达，在空肠和回肠中表达较少。slc26a3作为阴离子交换剂，在肠道中发挥多种功能。研究发现slc26a3缺失会引起小肠中cl-和液体吸收减少，此外，小鼠胃肠道中缺乏slc26a3时，hco3-分泌显著减少。与正常小鼠相比，slc26a3敲除鼠表现出产后死亡率高，血清na+和cl-浓度显著降低、生长迟缓、肾衰竭和腹泻增加等特征，slc26a3-/-鼠偶尔还会出现直肠脱垂。slc26a3能促进大肠中短链脂肪酸吸收同时，还利于介导no3-转运。
3、slc26a3的调控主要包括在转录、转录后和翻译后3个水平上的调控。在转录水平上，研究发现肝细胞核因子 4 调控人结肠细胞ls174t中 slc26a3基因启动子的活性；singla 等人发现溶血磷脂酸处理 caco2 细胞可刺激 slc26a3基因的mrna 表达和启动子活性；kumar 等人发现肿瘤坏死因子-α通过激活 nf-κb下调肠上皮细胞中的slc26a3；tnf-α和slc26a3表达之间存在相互关系，并且 nf-κb介导tnf-α诱导的caco2细胞中slc26a3的减少；干扰素-γ(ifn-γ)可能通过jak-stat通路降低slc26a3的表达；全反式维甲酸（atra）也能增加slc26a3启动子活性，该活性依赖于维甲酸受体-β/肝细胞核因子-1β通路。在转录后水平上，目前已发现多种针对slc26a3基因的mirna，它们在slc26a3基因的合成中发挥重要功能。在翻译后水平上，slc26a3的一个重要调控区域是pdz结构域，位于该蛋白的c端，通过该结构域将slc26a3 与其他转运蛋白共同募集，从而介导蛋白质之间的互作。
4、现有技术还未报道过，靶向slc26a3基因从而调控肠上皮细胞屏障功能的小干扰rna及过表达slc26a3基因的核苷酸序列。
技术实现思路
1、本发明的第一个目的是以溶质相关载体26a3基因slc26a3作为靶基因，调控猪肠上皮细胞屏障功能。
2、本发明的第二个目的是提供针对所述溶质相关载体26a3基因slc26a3的干扰，以破坏肠上皮细胞的屏障功能。
3、本发明的第三个目的是提供针对所述溶质相关载体26a3基因slc26a3的过表达，以增强肠上皮细胞的屏障功能。
4、为实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
5、第一方面，本发明提供一种溶质相关载体26a3基因slc26a3的小干扰rna，所述小干扰rna命名为si-slc26a3-1，所述si-slc26a3-1的核苷酸序列如seq id no.4和seq idno.5所示。
6、本发明提供的所述小干扰rna的靶向基因为溶质相关载体26a3基因slc26a3，所述靶向基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、具体地，本发明针对slc26a3基因制备小干扰rna，转染猪小肠上皮细胞ipec-j2，沉默溶质相关载体26a3基因slc26a3。在小干扰rna转染猪小肠上皮细胞ipec-j248小时后，对sirna干扰效率进行评价，同时，利用荧光定量pcr检测肠上皮细胞屏障功能相关的muc2、muc13、tff3、ocln、cldn3、e-cadherin和slc15a1基因的表达量；以及用western blotting检测muc2、muc13和ocln的蛋白表达量，结果表明肠上皮细胞分泌的黏蛋白及肠上皮细胞紧密连接蛋白表达表达显著降低，具有破坏肠上皮细胞屏障功能的作用，可用于疾病模型的构建。
8、本发明以seq id no.1所示的溶质相关载体26a3基因slc26a3作为靶点，设计了四条小干扰rna，即si-slc26a3-1（正义核苷酸序列seq id no.4和反义核苷酸序列seq idno.5），si-slc26a3-2（正义核苷酸序列seq id no.6和反义核苷酸序列seq id no.7），si-slc26a3-3（正义核苷酸序列seq id no.8和反义核苷酸序列seq id no.9），si-slc26a3-4（正义核苷酸序列seq id no.10和反义核苷酸序列seq id no.11），以及对照组si-nc（正义核苷酸序列seq id no.2和反义核苷酸序列seq id no.3）。最终发现，si-slc26a3-1的干扰效率最高。
9、第二方面，本发明提供了溶质相关载体26a3基因slc26a3靶向干扰效率鉴定的引物对，包括：si-slc26a3-f和si-slc26a3-r，其核苷酸序列分别为seq id no.12和seq idno.13所示。
10、第三方面，本发明提供一种slc26a3基因的过表达载体，所述过表达载体中slc26a3基因cds区的核苷酸序列如seq id no.30所示。
11、第四方面，本发明提供扩增上述slc26a3基因的过表达载体中slc26a3基因cds区的引物对，其包括：slc26a3-cds-f和slc26a3-cds-r，其核苷酸序列分别为seq id no.31和seq id no.32。
12、第五方面，本发明提供一种过表达溶质相关载体26a3基因slc26a3的方法，所述方法中，使用上述的过表达载体提高细胞中溶质相关载体26a3基因slc26a3的表达水平。
13、具体地，本发明通过pcr扩增，将kozak强启动子序列连接到溶质相关载体26a3基因slc26a3的cds序列上，所用的扩增引物为slc26a3-cds-kozak-f和slc26a3-cds-kozak-r，其核苷酸序列为seq id no.33和seq id no.34；其次，通过pcr扩增，将piggybac载体同源臂序列连接到上述携带kozak强启动子的溶质相关载体26a3基因slc26a3的cds序列上，所用的扩增引物为slc26a3-cds-kozak-tyb-f和slc26a3-cds-kozak-tyb-r，其核苷酸序列为seq id no.35和seq id no.36；最后，将携带kozak强启动子及piggybac载体同源臂的溶质相关载体26a3基因slc26a3的cds序列，及线性化的piggybac载体共转上皮细胞ipec-j2。
14、第六方面，本发明提供上述小干扰rna或上述的过表达载体在调控猪肠上皮细胞屏障功能中的应用。在本发明所提供的应用中，使用小干扰rna干扰溶质相关载体26a3基因slc26a3，减弱肠上皮细胞屏障功能；
15、使用过表达载体转染细胞，增强肠上皮细胞屏障功能。
16、在本发明所提供的应用中，使用muc2、muc13、tff3、ocln、cldn3、e-cadherin和slc15a1基因检测肠上细胞屏障功能完整性。
17、具体地，本发明针对slc26a3基因制备过表达载体，转染猪小肠上皮细胞ipec-j2，过表达溶质相关载体26a3基因slc26a3。过表达载体转染猪小肠上皮细胞ipec-j2，48小时后，对转染效率进行评价，同时，利用荧光定量pcr检测肠上皮细胞屏障功能相关的muc2、muc13、tff3、ocln、cldn3、e-cadherin和slc15a1基因的表达量；以及用western blotting检测muc2、muc13和ocln的蛋白表达量，结果表明肠上皮细胞分泌的黏蛋白及肠上皮细胞紧密连接蛋白表达表达显著上调表达，具有增强肠上皮细胞屏障功能的作用，可用于上皮细胞屏障功能受损的治疗。
18、具体地，采用引物对检测muc2、muc13、tff3、ocln、cldn3、e-cadherin和/或slc15a1基因的表达量；检测muc2的引物对序列如seq id no.14和seq id no.15所示，检测muc13的引物对序列如seq id no.16和seq id no.17所示，检测tff3的引物对序列如seqid no.18和seq id no.19所示，检测slc15a1的引物对序列如seq id no.20和seq idno.21所示，检测ocln的引物对序列如seq id no.22和seq id no.23所示，检测cldn3的引物对序列如seq id no.24和seq id no.25所示，检测e-cadherin的引物对序列如seq idno.26和seq id no.27所示。
19、在本发明提供的应用中，黏蛋白muc2、小肽转运蛋白tff3和slc15a1、紧密连接蛋白ocln、钙黏蛋白e-cadherin显著下调，表明肠上皮细胞屏障功能受损；黏蛋白muc2、小肽转运蛋白slc15a1、紧密连接蛋白ocln和cldn3显著上调，表明肠上皮细胞屏障功能增强。
20、本发明的有益效果在于：
21、本发明公开提供了一种调控细胞肠上皮细胞屏障功能的小干扰rna、过表达载体及其应用。本发明根据溶质相关载体26a3基因slc26a3在机体酸碱平衡、肠上皮屏障、肠道微生物菌群和免疫调节中的作用均可能导致和/或加剧肠道炎症，以及作为治疗靶点的作用，提供一种靶向溶质相关载体26a3基因slc26a3的干扰和过表达调控猪肠上皮细胞屏障功能的方法，基于猪与人在解剖、生理和遗传等方面的相似性，将为猪及人ibd模型构建及靶向治疗奠定基础。并且，本发明所提供的以溶质相关载体26a3基因slc26a3为靶基因的小干扰rna，具备较高的干扰效率。
1.一种以溶质相关载体26a3基因slc26a3为靶基因的小干扰rna，其特征在于，所述小干扰rna命名为si-slc26a3-1，所述si-slc26a3-1的核苷酸序列如seq id no.4和seq idno.5所示。
2.根据权利要求1所述的小干扰rna，其特征在于，所述小干扰rna的靶向基因为溶质相关载体26a3基因slc26a3，所述靶向基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
3.溶质相关载体26a3基因slc26a3靶向干扰效率鉴定的引物对，包括：si-slc26a3-f和si-slc26a3-r，其核苷酸序列分别为seq id no.12和seq id no.13所示。
4.一种slc26a3基因的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体中slc26a3基因cds区的核苷酸序列如seq id no.30所示。
5.扩增权利要求4所述slc26a3基因的过表达载体中slc26a3基因cds区的引物对，其特征在于，包括：slc26a3-cds-f和slc26a3-cds-r，其核苷酸序列分别为seq id no.31和seqid no.32。
6.一种过表达溶质相关载体26a3基因slc26a3的方法，其特征在于，所述方法中，使用权利要求4所述的过表达载体提高细胞中溶质相关载体26a3基因slc26a3的表达水平。
7.权利要求1所述小干扰rna或权利要求4所述的过表达载体在调控猪肠上皮细胞屏障功能中的应用；使用小干扰rna干扰溶质相关载体26a3基因slc26a3，减弱肠上皮细胞屏障功能；
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，使用muc2、muc13、tff3、ocln、cldn3、e-cadherin和slc15a1基因检测肠上细胞屏障功能完整性。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，采用引物对检测muc2、muc13、tff3、ocln、cldn3、e-cadherin和/或slc15a1基因的表达水平；检测muc2的引物对序列如seq id no.14和seq id no.15所示，检测muc13的引物对序列如seq id no.16和seq id no.17所示，检测tff3的引物对序列如seq id no.18和seq id no.19所示，检测slc15a1的引物对序列如seqid no.20和seq id no.21所示，检测ocln的引物对序列如seq id no.22和seq id no.23所示，检测cldn3的引物对序列如seq id no.24和seq id no.25所示，检测e-cadherin的引物对序列如seq id no.26和seq id no.27所示。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，黏蛋白muc2、小肽转运蛋白tff3和slc15a1、紧密连接蛋白ocln、钙黏蛋白e-cadherin显著下调，表明肠上皮细胞屏障功能受损；黏蛋白muc2、小肽转运蛋白slc15a1、紧密连接蛋白ocln和cldn3显著上调，表明肠上皮细胞屏障功能增强。
