本发明属于肝星状细胞获取，具体涉及一种获取小鼠肝星状细胞的方法。
背景技术：
1、肝纤维化是由多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内细胞外间质成分过度异常的沉积，进而影响肝脏功能，是慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段。然而，目前临床上治疗肝纤维化的有效抗纤维化药物很少。在肝纤维化晚期，唯一的治疗方法就是肝移植。因此，需要探索新的治疗方法或治疗药物，以阻止早期肝纤维化的进一步发展，或逆转肝纤维化进程，实现肝纤维化的缓解。要找到新的治疗靶点和药物，就必须了解导致肝纤维化发展的机制。肝纤维化的复杂过程受到多种细胞和细胞因子的调控，其中，肝星状细胞(hsc)在肝纤维化的发生发展中扮演着重要角色，hsc的持续活化导致肝纤维化的进一步发展。hsc是肝脏常驻细胞，hsc通常处于静止、非增殖状态，然而，当肝脏受损时，hsc转变为增殖性hsc。来源于hsc的肌成纤维细胞(mfs)是随着肝硬化的发展而积累的纤维基质的主要生产者。因此，对肝纤维化的发生发展机制及治疗策略的研究大都集中在这一细胞类型上。
2、目前肝星状细胞分离的方法，主要是先通过对小鼠肝脏进行在体灌注，再摘取肝脏获取肝星状细胞。然而，在体灌注耗时较长，实验条件要求高且只能单只分离。因此，小鼠肝星状细胞的分离除受到实验条件的限制外，通常还会受到数量和时间的限制，较长的分离时间将影响星状细胞的活率、状态及基因的表达。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种获取小鼠肝星状细胞的方法，用以解决当前肝星状细胞分离方法实验条件要求高、耗时较长，且只能单只分离的技术问题。
2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
3、本发明的第一个方面，公开了一种获取小鼠肝星状细胞的方法，包括以下步骤：
4、1)对离体的小鼠肝脏进行灌流，直至肝脏变白，得到变白的肝脏；
5、2)在消化液中剪碎变白的肝脏，消化，得到消化后的肝脏组织；
6、3)过滤消化后的肝脏组织并收集滤液，离心，去除上清，洗涤细胞，密度梯度离心，取中间白色层细胞，得到小鼠肝星状细胞。
7、优选地，步骤1)之前，夹住离体的小鼠肝脏的肝动静脉丛。
8、优选地，步骤1)中，灌流位置为离体的小鼠肝脏的每叶肝的中间部位。
9、优选地，步骤1)中，使用注射器进行灌流，注射器刺入深度为肝叶厚度的1/2。
10、优选地，步骤1)中，灌流液为i型胶原酶消化液；i型胶原酶消化液的制备方法为：每500ml hbss缓冲液中添加1190mg的hepes和280mg的cacl2混匀，得到组织消化缓冲液；每10ml组织消化缓冲液中加入5mg胶原酶i，得到i型胶原酶消化液。
11、优选地，步骤1)中灌流时的灌流液与步骤2)中的消化液，使用前均在40℃预热。
12、优选地，步骤2)中，使用的消化液为胶原酶蛋白酶消化液；胶原酶蛋白酶消化液的制备方法为：每500ml hbss缓冲液中添加1190mg的hepes和280mg的cacl2混匀，得到组织消化缓冲液；每10ml组织消化缓冲液中加入5mg胶原酶i，得到i型胶原酶消化液；每10ml i型胶原酶消化液中加入4mg蛋白酶，得到胶原酶蛋白酶消化液。
13、优选地，步骤2)中，将剪碎变白的肝脏组织置于胶原酶蛋白酶dna酶消化液中于摇床进行消化；所述胶原酶蛋白酶dna酶消化液的制备方法为：每500ml hbss缓冲液中添加1190mg的hepes和280mg的cacl2混匀，得到组织消化缓冲液；每10ml组织消化缓冲液中加入5mg胶原酶i，得到i型胶原酶消化液；每10ml i型胶原酶消化液中加入4mg蛋白酶，得到胶原酶蛋白酶消化液；每20mg dna酶i加入10ml gbss混匀，得到dna酶i溶液；每10ml胶原酶蛋白酶消化液中加入100μl dna酶i溶液，得到胶原酶蛋白酶dna酶消化液。
14、优选地，步骤3)中，用70μm滤网过滤消化后的肝脏组织。
15、本发明的第二个方面，公开了上述方法在肝纤维化研究中的应用。
16、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17、本发明提供了一种获取小鼠肝星状细胞的方法，1)先摘取小鼠肝脏，再在肝脏离体的状态下进行小鼠原代肝星状细胞的灌注式分离。这样的方式灌流耗时短，不易出现长时间的实验操作导致细胞活力降低的问题，可在短时间内获得高产的单细胞悬液，从而为原代肝星状细胞的体外长时间离体培养提供基础。2)由于肝星状细胞含有大量脂滴，在对肝脏组织进行消化后，基于密度梯度离心的方法，可以从其他肝细胞群中轻松分离肝星状细胞。整个方法操作简便、易行，相较常规在体灌注分离获得肝星状细胞需要4个小时以上才能完成，本方法大约需要两小时完成，缩短了一半及以上的时间，并可连续或同时对多只小鼠进行此操作，这使得在实验所需动物较多时，可对小鼠肝星状细胞进行快速分离，便于其后进行的分析及培养等试验。通过将本方法获得的肝星状细胞培养至其贴壁后检测，证明可以成功分离小鼠的肝星状细胞，分离所得的肝星状细胞纯度较高，产量较高，细胞生长状态良好，贴壁的细胞，大部分为肝星状细胞，有望成为实验样本较多时的快速、高效分离小鼠肝星状细胞的方法，可进行其后的分析和培养等相关实验，以供相关科研推广使用，极大地扩展原代肝星状细胞的运用领域。
18、进一步地，灌注前，夹住小鼠的肝动静脉丛，能够减少液体回流。
19、进一步地，在离体的肝脏的每叶肝的中间部位进行注射，能够保证灌流液均匀分布到整个器官，利于彻底消化。
20、进一步地，通过向肝脏注射i型胶原酶消化液，能够保证冲洗肝脏红细胞的同时，肝脏组织疏松，易于肝星状细胞从窦内皮细胞和肝细胞之间disse腔中消化出来。
21、进一步地，在胶原酶蛋白酶消化液中剪碎变白的肝脏，同时使用蛋白酶与胶原酶联合酶解法使肝星状细胞从肝脏中分离出来，在缩短实验耗时的同时，获得产量及纯度较高的肝星状细胞，操作简单、高效。
1.一种获取小鼠肝星状细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种获取小鼠肝星状细胞的方法，其特征在于，步骤1)之前，夹住离体的小鼠肝脏的肝动静脉丛。
3.根据权利要求1所述的一种获取小鼠肝星状细胞的方法，其特征在于，步骤1)中，灌流位置为离体的小鼠肝脏的每叶肝的中间部位。
4.根据权利要求1所述的一种获取小鼠肝星状细胞的方法，其特征在于，步骤1)中，使用注射器进行灌流，注射器刺入深度为肝叶厚度的1/2。
5.根据权利要求1所述的一种获取小鼠肝星状细胞的方法，其特征在于，步骤1)中，灌流液为i型胶原酶消化液；i型胶原酶消化液的制备方法为：每500ml hbss缓冲液中添加1190mg的hepes和280mg的cacl2混匀，得到组织消化缓冲液；每10ml组织消化缓冲液中加入5mg胶原酶i，得到i型胶原酶消化液。
6.根据权利要求5所述的一种获取小鼠肝星状细胞的方法，其特征在于，步骤1)中灌流时的灌流液与步骤2)中的消化液，使用前均在40℃预热。
7.根据权利要求1所述的一种获取小鼠肝星状细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，使用的消化液为胶原酶蛋白酶消化液；胶原酶蛋白酶消化液的制备方法为：每500ml hbss缓冲液中添加1190mg的hepes和280mg的cacl2混匀，得到组织消化缓冲液；每10ml组织消化缓冲液中加入5mg胶原酶i，得到i型胶原酶消化液；每10ml i型胶原酶消化液中加入4mg蛋白酶，得到胶原酶蛋白酶消化液。
8.根据权利要求1所述的一种获取小鼠肝星状细胞的方法，其特征在于，步骤2)中，将剪碎变白的肝脏组织置于胶原酶蛋白酶dna酶消化液中于摇床进行消化；所述胶原酶蛋白酶dna酶消化液的制备方法为：每500ml hbss缓冲液中添加1190mg的hepes和280mg的cacl2混匀，得到组织消化缓冲液；每10ml组织消化缓冲液中加入5mg胶原酶i，得到i型胶原酶消化液；每10mli型胶原酶消化液中加入4mg蛋白酶，得到胶原酶蛋白酶消化液；每20mg dna酶i加入10ml gbss混匀，得到dna酶i溶液；每10ml胶原酶蛋白酶消化液中加入100μl dna酶i溶液，得到胶原酶蛋白酶dna酶消化液。
9.根据权利要求1所述的一种获取小鼠肝星状细胞的方法，其特征在于，步骤3)中，用70μm滤网过滤消化后的肝脏组织。
10.权利要求1～9任意一项所述的方法在肝纤维化研究中的应用。
