本发明涉及γδt细胞培养，尤其涉及一种γδt细胞培养基、培养方法及应用。
背景技术：
1、γδt细胞是免疫系统中的一类非经典t细胞，主要分布于肠道、呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，是构成表皮内淋巴细胞和黏膜组织上皮内淋巴细胞(iel)的主要成分之一。在健康的成年人中，γδt细胞占外周血t细胞的1％～5％。但是γδt细胞能直接杀伤癌细胞和肿瘤干细胞，识别癌胚抗原，也能通过穿孔素颗粒酶途径等方式直接杀伤肿瘤细胞。此外，γδt细胞在控制病毒感染和对自身免疫性疾病的调控方面也具有重要作用。
2、鉴于γδt细胞疗法在癌症和病毒性疾病中的显著治疗效果，能够在体外培养出高纯度有活性的γδt细胞是急需要解决的问题。但现有γδt细胞的培养方法存在扩增率较低问题，如何提高γδt细胞扩增率能一个亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本发明提供了一种γδt细胞培养基、培养方法及应用，本发明的主要目的旨在解决现有培养技术中γδt细胞培养扩增率低的问题。
2、本发明的内容如下：
3、本发明第一方面提供了一种γδt细胞培养基，包括：基础培养基、细胞因子、双膦酸盐及小檗碱，所述小檗碱的浓度为0.25～5μm。
4、在本发明的γδt细胞培养基中，基础培养基包括aim-v培养基、kbm-581培养基、rpmi-1640中的一种，基础培养基提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。本发明中，所选择的基础培养基为aim-v培养基。
5、其中，在所述培养基中，还加入有双磷酸盐、细胞因子及小檗碱，各组分在培养基中共同作用亦提高γδt细胞的扩增率。
6、小檗碱，亦称黄连素，是从中药黄连中分离的一种季铵生物碱，是黄连抗菌的主要有效成分。由于其抗菌作用，小檗碱在一些场合中可作为细胞培养的抗菌成分，因此其对于某些细胞的培养可提供其存活率。而本发明的发明人发现，将小檗碱作为本发明γδt细胞培养基的组分，对γδt细胞的增殖具有促进作用，不仅能提高其活率，还能较明显提高γδt细胞的扩增倍数。
7、在本发明第一方面一种可选的实施方式中，所述γδt细胞培养基还包括5～10％自体血浆。
8、自体血浆的加入可满足细胞培养中营养物质的需求，有助于细胞在培养环境中生长及增殖。
9、其中，自体血浆可仅在培养的前期进行，在培养后期则可不再额外添加自体血浆。
10、在本发明第一方面一种可选的实施方式中，在所述细胞因子中，包括100～1000u/ml il-2、10～50ng/ml il-7、10～50ng/ml il-15、10～50ng/ml il-18、10～20ng/ml il-21。
11、细胞因子组合能够刺激γδt细胞的增殖，改善γδt细胞的培养环境，提高培养效率和增强细胞质量，能够增强γδt细胞的多种功能，包括抗肿瘤、抗感染、免疫调节等。
12、在本发明第一方面一种可选的实施方式中，所述双磷酸盐为帕米磷酸二钠、唑来膦酸中的一种或两种。
13、在本发明中，双磷酸盐为促细胞增殖添加物中，双磷酸盐帕米磷酸二钠和/或唑来膦酸，帕米磷酸二钠和/或唑来膦酸在pbmc培养γδt细胞中具有显著的刺激扩增作用。通过扩增γδt细胞，帕米磷酸二钠和/或唑来膦酸有助于增强机体的免疫应答能力，从而在治疗肿瘤、感染等疾病中发挥重要作用。所述的双磷酸盐的浓度为1～10μg/ml。
14、在一个可选的实施例中，所述的双膦酸盐为5μg/ml唑来膦酸，其他实施例中，所述双磷酸盐可以为5μg/ml帕米磷酸二钠。
15、作为本发明的第二方面，本发明的γδt细胞培养基，包括：基础培养基、细胞因子、双膦酸盐、小檗碱及自体血浆，所述小檗碱的浓度为0.25～5μm；所述细胞因子包括100～1000u/ml il-2、10～50ng/ml il-7、10～50ng/ml il-15、10～50ng/ml il-18、10～20ng/ml il-21；所述双磷酸盐为1～10μg/ml帕米磷酸二钠、1～10μg/ml唑来膦酸中的一种；所述自体血浆的加入量为5～10％。
16、作为本发明的第三方面，本发明还提供了一种γδt细胞的培养方法，包括：
17、获取待处理细胞；
18、根据预设的培养时长，基于如本发明第一发明所提供的γδt细胞培养基，培养所述待处理细胞；
19、收集培养后的细胞。
20、具体的，在本发明的γδt细胞的培养方法中，待处理细胞为pbmc。将分离的pbmc接种于培养容器中并加入所述的γδt细胞培养基以进行培养，其中pbmc接种密度为3～8×106个/ml。
21、进一步的，在培养的过程中，根据培养情况进行添加培养基，以使细胞浓度维持在2.0～3.5×106个/ml。
22、进一步的，γδt细胞所述培养时长为14天，在培养前9天，添加自体血浆，选的，所加入的自体血浆浓度为5～10％，优选为10％，在9天后可不再额外添加自体血浆培养结束后，收集细胞，进行γδt细胞纯度、扩增倍数等检测。
23、本发明所指的培养容器包括培养瓶或培养袋，如可以为t25或t75培养瓶、t175培养瓶、t225培养瓶及1l培养袋等，依据实际的培养基体积，可进行转移或更换，以保证有足够的空间进行培养。
24、在本发明的第四方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一发明所提供的γδt细胞培养基，所述试剂盒用于γδt细胞的培养或/和外泌体制备。
25、有益效果：本发明提供了一种γδt细胞培养基、培养方法及应用，所述细胞培养基包括基础培养基、细胞因子、双膦酸盐及小檗碱，所述小檗碱的浓度为0.25～5μm。所述培养基以小檗碱结合其他组分，对γδt细胞的增殖具有促进作用，不仅能提高γδt细胞存活率，还能较明显提高γδt细胞的扩增率。
1.一种γδt细胞培养基，其特征在于，包括：基础培养基、细胞因子、双膦酸盐及小檗碱，所述小檗碱的浓度为0.25～5μm。
2.根据权利要求1所述的γδt细胞培养基，其特征在于，所述γδt细胞培养基还包括5～10％自体血浆。
3.根据权利要求1所述的γδt细胞培养基，其特征在于，在所述细胞因子中，包括100～1000u/ml il-2、10～50ng/ml il-7、10～50ng/ml il-15、10～50ng/ml il-18、10～20ng/ml il-21。
4.根据权利要求1所述的γδt细胞培养基，其特征在于，所述双磷酸盐为帕米磷酸二钠、唑来膦酸中的一种或两种，所述双磷酸盐的浓度为1～10μg/ml。
5.根据权利要求4所述的γδt细胞培养基，其特征在于，所述双膦酸盐为5μg/ml唑来膦酸。
6.根据权利要求1所述的γδt细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基包括aim-v培养基、kbm-581培养基、rpmi-1640中的一种。
7.一种γδt细胞培养基，其特征在于，包括：基础培养基、细胞因子、双膦酸盐、小檗碱及自体血浆，所述小檗碱的浓度为0.25～5μm；所述细胞因子包括100～1000u/ml il-2、10～50ng/ml il-7、10～50ng/ml il-15、10～50ng/ml il-18、10～20ng/ml il-21；所述双磷酸盐为1～10μg/ml帕米磷酸二钠、1～10μg/ml唑来膦酸中的一种；所述自体血浆的加入量为5～10％。
8.一种γδt细胞的培养方法，其特征在于，包括：
9.根据权利要求8所述的γδt细胞的培养方法，其特征在于，所述待处理细胞为pbmc，所述培养时长为14天。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～6中任意一项培养基，所述试剂盒用于γδt细胞的培养或/和外泌体制备。
