本发明属生物，涉及一种油菜类受体基因bnrlp41在菌核病防控中的应用。
背景技术：
1、1、植物基因功能分析技术
2、植物基因功能通常通过比较分析基因的超常规表达与正常表达情况下的表型(phenotype)或功能发挥情况来判断和明确。基因的超常规表达包括高于正常水平的表达和低于正常水平的表达两大类。高于正常水平的表达主要为超表达/过表达(over-expression)，主要通过连接一个强启动子来驱动目的基因表达的方式来达到。低于正常水平的表达主要通过rna干扰(rna interfering,rnai)、基因敲除(knock-out)等方式来达到。rnai通过构建和转化一个含有同一序列片段相反方向插入一个内含子或其它不表达的序列形成的发卡结构来实现，结果是目的基因表达的降低。基因敲除则通过在植物基因组中的目的基因中插入一个长的非植物序列或切除目的基因等方式来达到，结果是目的基因表达的完全或近乎完全的抑制。通过构建基因超表达植株和/或rnai植株、基因敲除突变体，比较分析其表型和性状与野生型/正常植株的差异，可明确目的基因对该性状的调节功能。
3、2、植物抗病遗传学调控技术
4、植物抗病性是由植物受体识别病原物配体激活抗病信号传导、活化系列防卫反应而产生的结果。从遗传学上看，受体-配体识别后，激活抗病信号传导，活化免疫抗病反应。植物面对病原菌入侵时，由植物细胞膜表面的模式识别受体特异性地识别病原菌保守的分子模式来启动第一层先天免疫系统。对病原的识别和信号转导并激活胞内抗病途径对于抗病反应产生至关重要。类受体蛋白(receptor-like protein,rlp)是目前已知的植物识别病原分子模式的两大类受体之一。利用rlp基因创制抗病性增强的作物种质预计效果好，但目前这方面的公开报告极少。
5、3、植物菌核病防控技术
6、植物菌核病由核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)侵染所致。核盘菌是坏死营养型(necrotroph)病原真菌，寄主范围极广，是油料作物以及蔬菜作物等的主要病害。每年造成巨大经济损失。由于缺乏高抗品种，化学防治仍然是重要手段。由于一些农药存在生态污染、人畜毒害、易使病原物产生抗药性等问题，鉴定重要抗菌核病调控基因，创制和利用抗病品种，对于菌核病的绿色防控至关重要。
7、4、植物抗病育种技术
8、植物抗病育种技术主要分为传统抗病育种和通过基因工程抗病育种两大类。传统抗病育种因为有天然遗传隔离现象使抗病资源可用范围受到显著限制，只能应用遗传关系较近的抗病资源，而且需要多次杂交和回交等，因此选育周期长，且需要大量人力物力。而基因工程育种方法是通过将外源的抗病调控基因通过农杆菌介导的方法等技术导入植物，使其获得原来不具有的抗病性。因此，基因工程育种方法打破了天然遗传隔离现象的限制，拓宽了抗病资源可用范围，而且具有操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力的特点。另外，可通过导入一个广谱抗病调控基因，或者多个不同抗病谱的基因，创制具有广谱抗病的品种。因此具有特别适宜培育广谱、持久抗病品种等优点。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种油菜(brassica napus)类受体基因bnrlp41在菌核病防控中的应用，所述油菜类受体基因bnrlp41对抗病性有调控功能，可应用于抗核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)作物种质的创制。
2、所述应用是通过创制转基因油菜来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用。是通过创制超表达bnrlp41的转基因油菜来获得增高菌核病抗性的油菜材料中的应用，或通过创制bnrlp41-crispr基因敲除转基因油菜来获得减弱菌核病抗性的油菜材料中的应用。
3、本发明以油菜(brassica napus)中双11品种cdna为模板，通过pcr克隆获得油菜基因bnrlp41，其核苷酸序列如seq id：1所示，该基因的开放阅读框(orf)长2655bp，编码的蛋白由884个氨基酸组成，其序列如seq id：2所示。bnrlp41蛋白包含lrr结构域。本发明克隆的核苷酸序列与ncbi数据库中油菜品种zs11的loc106447094核苷酸序列一致、蛋白序列与xp_013744403.2相同。
4、在本发明之前，该基因的功能没有任何公开报告。本发明首次通过构建该基因的超表达和crispr敲除转基因油菜及其抗病分析，阐明了该基因对油菜菌核病抗性的调控作用。结果显示，与野生型油菜植株相比，超表达转基因油菜植株显著更抗核盘菌，而敲除转基因植株显著更感核盘菌，说明bnrlp41正调控油菜对核盘菌的抗性。
5、基于以上本发明阐明的bnrlp41基因功能，本发明的应用目的是提供所述的油菜bnrlp41基因通过创制转基因油菜来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用，包括(1)在通过创制超表达bnrlp41的转基因油菜来获得增高对菌核病抗性的油菜材料中的应用(实施例1)；以及(2)在通过创制bnrlp41-crispr基因敲除的转基因油菜来获得减弱对菌核病抗性的油菜材料中的应用(实施例2)。
6、油菜bnrlp41基因在通过创制超表达bnrlp41的转基因油菜来获得增高对菌核病抗性的油菜材料中的应用，具体通过以下步骤实现：
7、(1)bnrlp41基因超表达结构的构建和获取：将bnrlp41基因开放阅读框(orf)克隆入一个植物表达载体，使其受强启动子的驱使表达；
8、(2)转化bnrlp41基因超表达结构的农杆菌的获取：将构建好的bnrlp41基因超表达结构通过电击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株；
9、(3)超表达bnrlp41的转基因油菜创制和获取：通过农杆菌介导法将bnrlp41基因超表达结构导入油菜，获取转bnrlp41基因超表达结构的油菜；
10、(4)超表达bnrlp41的转基因油菜纯合系的获取：分别以抗生素抗性和bnrlp41基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的超表达bnrlp41的转基因油菜纯合系；
11、(5)菌核病抗性增高的超表达bnrlp41的转基因油菜纯合系筛选鉴定和获取：以超表达bnrlp41的转基因油菜纯合系为材料，检测分析对菌核病的抗性，获取抗病性增高的转bnrlp41基因油菜。
12、油菜bnrlp41基因在通过创制bnrlp41-crispr基因敲除的转基因油菜来获得减弱菌核病抗性的油菜材料中的应用。通过以下步骤实现：
13、(1)bnrlp41基因crispr敲除结构的构建和获取：根据bnrlp41基因组序列预设3个20bp的敲除靶标，将靶点序列克隆入植物表达载体pbsbdcas9i，经过菌落pcr鉴定和测序获得重组结构pbsbdcas9i-bnrlp41；
14、(2)转化bnrlp41基因crispr敲除结构的农杆菌的获取：将bnrlp41基因crispr敲除结构(pbsbdcas9i-bnrlp41)通过电击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株；
15、(3)转bnrlp41基因crispr敲除结构油菜的创制和获取：通过农杆菌介导法将bnrlp41基因crispr敲除结构导入油菜，获取转bnrlp41基因crispr敲除结构的油菜；
16、(4)转bnrlp41基因crispr敲除结构油菜纯合系的获取：以抗生素抗性筛选，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的转bnrlp41基因crispr敲除结构的油菜纯合系；
17、(5)菌核病抗性减弱的转bnrlp41基因crispr敲除结构油菜纯合系的筛选鉴定和获取：以转bnrlp41基因crispr敲除结构(pbsbdcas9i-bnrlp41)的油菜纯合系为材料，检测分析对菌核病的抗性，获取菌核病抗性减弱的bnrlp41基因crispr敲除油菜。
18、本发明的优点：(1)本发明提供的bnrlp41基因是优质抗菌核病基因资源，利用该基因获取的抗病材料具有抗病性较强等优点。油菜菌核病抗性是数量性状抗性，由多基因控制。一般而言，单个基因对该抗性的调控程度较低。因此，全世界范围内，油菜菌核病抗性材料都很匮乏，尚无高抗材料。bnrlp41基因编码类受体蛋白，是识别病原分子模式的受体基因，抗性激发效果好，因而是优质抗病基因资源。利用rlp创制抗病品种和种质是病害绿色防控的经济有效和安全的途径。因此，bnrlp41基因是一种适用于创制和选育抗菌核病油菜新材料和新品种的全新基因资源。(2)获取抗病材料周期短。获取抗病植物材料和品种的方法主要有常规的传统育种方法和利用抗病调控基因的基因工程育种方法。传统育种方法具有可用抗病资源范围受天然遗传隔离限制，选育周期长，需要大量人工物力等缺点。而基因工程育种方法则具有可用抗病资源范围广、操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力、特别适宜培育广谱、持久、高抗病性品种等优点。本发明利用抗病调控基因bnrlp41，采用基因工程方法，创制培育高抗菌核病的油菜材料，具有周期短，选育快速等特点。
1.一种油菜(brassica napus)类受体基因bnrlp41在菌核病防控中的应用，其特征在于，所述基因bnrlp41的核苷酸序列如seq id：1所示，其编码的蛋白序列如seq id：2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是通过创制转基因油菜(brassica napus)来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在通过创制超表达bnrlp41的转基因油菜来获得增高菌核病抗性的油菜材料中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，在通过创制bnrlp41-crispr基因敲除转基因油菜来获得减弱菌核病抗性的油菜材料中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现获得增高菌核病抗性的油菜材料中的应用：
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现获得减弱菌核病抗性的油菜材料中的应用：
