本发明涉及核酸检测，特别是涉及一种基于双链dna分支迁移的单链核酸荧光检测方法、系统及其应用。
背景技术：
1、生命活动依赖于核酸，包括dna和rna在内的核酸编码和调节了生物体内遗传信息的传递和表达，在许多基本生理过程中起着至关重要的作用。核酸序列的微小变化可导致深远的表型结果。常见的单碱基突变，如插入、缺失、单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,snp)，可引起蛋白质结构和功能的改变，构成人类许多疾病的基础，如癌症和遗传疾病等。近年来，单碱基突变在基因组学、代谢组学和遗传学等生物医学领域受到广泛关注。现有的鉴定单碱基突变的技术包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction,pcr)和核酸测序技术。然而，它们都面临着程序复杂、成本高、操作耗时长等局限。此外，突变序列的低丰度和微乎其微的热力学损失，以及核酸序列中二级结构引起的非特异性杂交，导致单碱基突变的检测仍然存在重大问题。因此，提出一种具有单碱基分辨率的高特异性核酸检测方法是一个重要的研究目标，具有很大的生物医学应用潜力。
2、单链核酸靶标具有序列设计或合成简单的优点，并且易于与分子信标、杂交链反应(hybridization chain reaction,hcr)和催化发夹组装(catalytic hairpinassembly,cha)等其他信号扩增方法相结合。许多研究采用简单的单链核酸，如单链dna(single-stranded dna,ssdna)和微小rna(microrna,mirna)作为检测靶点或模型输出最终信号。基于支点介导链位移反应(toehold-mediated strand displacement reaction,tsdr)的核酸杂交探针提供了一种检测单碱基突变的方法。近年来，不同探针的设计，如变构脚探针和脚交换探针，显著提高了链位移反应识别突变的选择性和反应性。双链dna分支迁移(dual-toehold branch migration,dtbm)是两个y型探针之间可逆的支点交换反应，通过互补的toehold序列触发反应过程。在y型探针上对双链结合区的单碱基突变具有极高的检测特异性。此外，目前尚未有将dtbm应用于单链核酸靶标的检测的报道。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于双链dna分支迁移的单链核酸荧光检测方法、系统及其应用，以开发出一种更加简单、快速且具有单碱基分辨率的高特异性核酸检测策略。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种基于双链dna分支迁移的单链核酸荧光检测方法，包括：
3、选择单链核酸检测模型：
4、选择随机序列的单链dna靶点l1和/或微小rna靶点let-7a作为单链核酸检测模型；
5、触发双链dna分支迁移反应：
6、当单链核酸检测模型为l1时，在dna聚合酶存在下，将l1通过延伸转化为y形反应探针l1p1，所述l1p1与另一y形荧光探针r1s1触发可逆的双链dna分支迁移反应；所述l1p1与r1s1之间存在互补的toehold序列，且所述r1s1带有荧光基团和淬灭基团；
7、当单链核酸检测模型为let-7a时，通过链位移扩增技术产生与let-7a序列互补且完整保存let-7a序列信息的单链dna l2，在dna聚合酶存在下，将所述l2通过延伸转化为y形反应探针l2p2，所述l2p2与另一y形荧光探针r2s2触发可逆的双链dna分支迁移反应；所述l2p2与r2s2之间存在互补的toehold序列，且所述r2s2带有荧光基团和淬灭基团；
8、荧光检测：
9、检测双链dna分支迁移反应液的荧光信号，比较基于待测核酸序列所得的双链dna分支迁移反应液输出的荧光信号强度f2、基于正确序列所得的双链dna分支迁移反应液输出的荧光信号强度f1与背景信号强度f0之间的大小，确定所述待测核酸序列的碱基突变情况；所述正确序列为与所述待测核酸序列相同且不存在突变位点的核苷酸序列
10、进一步，若f0＜f2＜f1，则所述待测核酸序列上存在突变位点。
11、进一步，所述l1与单链dna m1通过部分区域序列互补结合形成不稳定的双链复合物l1m1，在dna聚合酶存在下，所述l1m1扩展成稳定的l1p1。
12、进一步，所述l2与单链dna m2通过部分区域互补结合形成不稳定的双链复合物l2m2，在dna聚合酶存在下，所述l2m2扩展成稳定的l2p2。
13、进一步，所述y形反应探针l1p1和r1s1经双链dna分支迁移反应产生y形生成探针l1r1和p1s1。
14、进一步，所述y形反应探针l2p2和r2s2经双链dna分支迁移反应产生y形生成探针l2r2和p2s2。
15、进一步，所述let-7a和与其部分互补的发夹结构h在dna聚合酶和限制性内切酶存在下触发链位移扩增反应，产生l2。
16、进一步，所述let-7a与发夹结构h、单链dna m2、dna聚合酶和限制性内切酶混合触发链位移扩增反应，产生l2p2，所述单链dna m2与l2部分区域互补。
17、进一步，所述r1s1由单链dna r1与单链dna s1混合反应形成，所述r2s2由单链dnar2与单链dna s2混合反应形成。
18、进一步，所述dna聚合酶选自kf聚合酶。
19、进一步，所述限制性内切酶选自nt.bsmai切刻内切酶。
20、进一步，所述h的用量为100～150nm，优选为120～130nm，最优选为125nm。
21、进一步，所述m2的用量为10～100nm，优选为50～70nm，最优选为62.5nm。
22、进一步，所述r2s2的用量为10～100nm，优选为50～70nm，最优选为62.5nm。
23、进一步，所述dna聚合酶的用量为1～10u，优选为1～5u，更优选为2～3u，最优选为2.5u。
24、进一步，所述限制性内切酶的用量为1～10u，优选为5～10u，更优选为5～7.5u，最优选为5u。
25、进一步，所述链位移扩增反应时间不低于60min，优选为60～120min，更优选为70～90min，最优选为80min。
26、进一步，所述链位移扩增反应孵育温度为37℃。
27、进一步，所述双链dna分支迁移反应时间不低于60min，优选为60～180min，更优选为90～150min，最优选为120min。
28、进一步，所述双链dna分支迁移反应孵育温度为37℃。
29、进一步，所述荧光测量所用参数如下：激发波长为490nm，发射波长为520nm，激发和发射狭缝均为5nm，荧光发射光谱为500nm～600nm。
30、进一步，所述l1的正确序列如seq id no.1所示，所述m1的核苷酸序列如seq idno.4所示，所述p1的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述r1s1由以下(ⅰ)至(ⅲ)任一组合的单链dna r1与单链dna s1混合反应形成：
31、(ⅰ)seq id no.8所示的r1，seq id no.9所示的s1；
32、(ⅱ)seq id no.10所示的r1，seq id no.9所示的s1；
33、(ⅲ)seq id no.11所示的r1，seq id no.12所示的s1；
34、优选地，所述r1s1由seq id no.11所示的单链dna r1与seq id no.12所示的单链dna s1混合反应形成。
35、进一步，所述let-7a的正确序列如seq id no.18所示，所述h的核苷酸序列如seqid no.19所示，所述l2的核苷酸序列如seq id no.20所示，所述m2的核苷酸序列如seqidno.22所示，所述p2的核苷酸序列如seq id no.21所示，所述r2的核苷酸序列如seq idno.23所示，所述s2的核苷酸序列如seq id no.24所示。
36、本发明还提供一种基于双链dna分支迁移的单链核酸荧光检测系统，包括第一双链dna分支迁移反应体系和/或第二双链dna分支迁移反应体系；
37、所述第一双链dna分支迁移反应体系包括l1p1反应体系和r1s1反应体系，所述l1p1反应体系包括单链dna l1、单链dna m1和dna聚合酶，所述r1s1反应体系包括单链dna r1和单链dna s1；所述m1与l1部分区域互补，所述l1与m1在dna聚合酶存在下通过延伸反应生成y形反应探针l1p1，所述r1与s1反应混合反应形成y形荧光探针r1s1，所述l1p1与r1s1触发可逆的双链dna分支迁移反应；
38、所述第二双链dna分支迁移反应体系包括链位移扩增反应体系和r2s2反应体系，所述链位移扩增反应体系包括微小rna靶点let-7a、与let-7a部分互补的发夹结构h、单链dnam2、dna聚合酶和限制性内切酶，所述r2s2反应体系包括单链dna r2和单链dna s2；所述let-7a与h在dna聚合酶和限制性内切酶存在下触发链位移扩增反应产生l2，所述h与let-7a部分区域互补，所述m2与l2部分区域互补；所述let-7a与h、m2在dna聚合酶和限制性内切酶存在下经链位移扩增反应生成y形反应探针l2p2，所述r2与s2反应混合反应形成y形荧光探针r2s2，所述l2p2与r2s2触发可逆的双链dna分支迁移反应；
39、所述r1s1与r2s2均带有荧光基团和淬灭基团。
40、进一步，所述dna聚合酶为kf聚合酶。
41、进一步，所述限制性内切酶为nt.bsmai切刻内切酶。
42、进一步，所述l1p1反应体系、r2s2反应体系、链位移扩增反应体系和r2s2反应体系均还包括以下组分中的至少一种：脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate,dntp)、无酶水(rnase-free water)、缓冲液，所述缓冲液例如可选自tmbuffer、te buffer、ne buffer、cutsmart buffer中的至少一种，但不局限于此。
43、本发明还提供如上所述的基于双链dna分支迁移的单链核酸荧光检测方法和/或系统在制备单链核酸检测试剂、单碱基突变检测试剂和/或与单碱基突变相关的疾病的诊断试剂中的应用。
44、进一步，所述与单碱基突变相关的疾病包括肿瘤和遗传性疾病。
45、如上所述，本发明的基于双链dna分支迁移的单链核酸荧光检测方法、系统及其应用，具有以下有益效果：
46、本发明开发了一种基于dtbm构建的具有单碱基分辨率的超特异性单链核酸荧光检测策略，用于检测ssdna靶点l1和mirna靶点let-7a，其主要技术方案如下：选择随机序列的ssdna靶点l1和mirna靶点let-7a分别作为单链核酸检测模型。在聚合酶存在的情况下，l1通过延伸转化为y形探针，然后触发特异性的dtbm反应。为了检测let-7a，本发明进一步提出了一种利用sda触发的dtbm。通过sda工艺产生与let-7a序列互补的ssdna链l2，并将l2转化为y形探针触发dtbm。
47、上述过程中，dna聚合酶介导的延伸和sda实现了单链靶标向y型探针的转化，随后的dtbm保证了检测的特异性。经实验验证，该荧光检测策略对l1和let-7a均具有较高的检测特异性，平均鉴别因子(dfs)分别为31.62和19.75；同时，在let-7a和let-7b的混合体系中，它可以检测出1％丰度的let-7a，并且在稀释的人血清中也表现出优异的分析性能。
48、本发明提供的荧光检测策略不仅对l1和let-7a都具有极高的检测特异性，还不需要变温步骤或复杂的样品添加，对用户友好，荧光信号输出方式简单，为进一步开发利用智能手机进行实时分析提供了便利和可能，有望成为一种具有很大实际应用前景的单链核酸靶点检测平台，为单链核酸检测等生物医学应用提供巨大潜力。
1.一种基于双链dna分支迁移的单链核酸荧光检测方法，所述方法非疾病诊断和治疗目的，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：若f0＜f2＜f1，则所述待测核酸序列上存在突变位点。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述l1与单链dna m1通过部分区域序列互补结合形成不稳定的双链复合物l1m1，在dna聚合酶存在下，所述l1m1扩展成稳定的l1p1；
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述dna聚合酶选自kf聚合酶。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述h的用量为100～150nm；
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光测量所用参数如下：激发波长为490nm，发射波长为520nm，激发和发射狭缝均为5nm，荧光发射光谱为500nm～600nm。
7.一种基于双链dna分支迁移的单链核酸荧光检测系统，其特征在于，包括第一双链dna分支迁移反应体系和/或第二双链dna分支迁移反应体系；
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：所述dna聚合酶为kf聚合酶。
9.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：所述l1p1反应体系、r2s2反应体系、链位移扩增反应体系和r2s2反应体系均还包括以下组分中的至少一种：脱氧核糖核苷三磷酸、无酶水、缓冲液。
10.根据权利要求1～6任一项所述的方法和/或根据权利要求7～9任一项所述的系统在制备单链核酸检测试剂、单碱基突变检测试剂和/或与单碱基突变相关的疾病的诊断试剂中的应用。
