激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种激光直写石墨烯/普鲁士蓝纳米颗粒/pedot聚合物层/金纳米粒子复合电极及其制备方法和在超高灵敏无标记免疫电化学传感中的应用。
背景技术：2.石墨烯是一种单原子层的二维sp2杂化碳纳米片，由于具备大的比表面积、高的电子迁移率、热导率、生物相容性、超低密度和机械柔性，表现出优异的光学、电学、化学和物理性能。石墨烯的这些特殊特性使其在生物传感器、锂电池和超级电容器等领域具有广阔应用前景。因此，石墨烯的高效制备，如微机械剥离（hopg）、化学气相沉积（cvd）、外延生长、氧化石墨烯（go）的还原和有机合成等，均有较深入的研究和应用。但这些方法具有仪器昂贵、操作复杂、试剂污染环境等缺点，阻碍了其在一些领域的应用。
3.如何以可拓展的方式直接制备和加工石墨烯基材料是当前的研究热点之一。因此，激光直写技术以其制备简单、环境友好、易于图案化等优点被广泛应用于石墨烯基材料的制备。lig(laser-induced graphene，激光诱导石墨烯)技术可诱导聚酰亚胺(pi)衬底直接生成三维多孔结构的石墨烯，表现出大的比表面积和高的导电性，制备过程无需高温和溶剂。
4.近年来，lig电极因其具有电子转移速率高、比表面积大等特点，在电化学分析中得到了广泛的应用。lig电极的改性对于提高lig电极在自组装过程的灵敏度、稳定性和易化性方面的性能至关重要。用杂原子和纳米材料对lig电极进行改性是提高其电化学性能的有效途径。与杂原子掺杂相比，lig表面的自组装复合材料更易于电极的组装。
5.普鲁士蓝（prussian blue,pb），又名铁蓝，即亚铁氰化铁，化学式为fe4[fe(cn)6]3，由1740年柏林人diesbach首次发现，是存在历史最久的配位化合物之一。pb的结构中，拥有呈低自旋的fe
2+
和呈高度自旋的fe
3+
，而钠、钾、铵根等则作为平衡电荷。pb作为一种应用最早的电子媒介体，具有可逆的电极反应动力学，能够稳定存在的氧化和还原形式，以及较低的氧化还原电位等。pb在生物传感器方面，已经有过大量的研究。pb一般的修饰方法是先用化学法合成pb粉末，然后滴涂或机械研磨在电极表面。但此法操作复杂，耗时长效率低，制备的pb颗粒也分布不均匀。通过采用电化学沉积法（electrochemical deposition，ed），可以方便快捷得到颗粒分布均匀的pb修饰电极。研究表明，pb修饰的电极在酸性环境下，循环寿命很长，在中性和碱性溶液中稳定性较差，原因可能是fe
3+
易水解，当溶液的ph超过6.3以后，溶液中oh-会与fe
3+
反应，生成fe(oh)3，导致pb从电极表面脱落，减小电流信号。因此，在lig/pb电极表面沉积聚3,4-乙烯二氧噻吩（pedot）聚合物层，让pedot中的氨基和羧基和pb配位，增加pb在中碱性条件下的稳定性，此外，pedot聚合物的高亲水性和防污抗污能力，为其在免疫检测过程中，减小了非特异性结合带来的干扰。最后将具有高电催化活性和导电性的金纳米粒子通过恒电位沉积在lig/pb/pedot复合电极表面，增强了复合电极的电化学性能，同时为抗体的结合提供了可能。
[0006]
虽然为了控制甲型h1n1流感病毒的传播，以减轻临床症状和降低病死率，各个国家和地区分别大规模地在高危易感染人群中接种了疫苗。但是同一时期在不同国家和地区均存在着h1n1和h3n2等普通季节性流感病毒的人际传播，以及能感染人并且可能会在人际间扩散传播的高致病性h5n1禽流感病毒。为此如何对流感病毒的快速、灵敏、准确地检测，对人们及时控制流感病毒的大规模传播具有重要意义。
技术实现要素：[0007]
本发明的目的是提供一种激光直写石墨烯/普鲁士蓝纳米颗粒/pedot聚合物层/金纳米粒子复合电极的制备方法，及用于甲型h1n1流感病毒的无标记免疫传感。
[0008]
本发明首先自行设计好三电极图案，然后采用激光直写技术制备微型平面石墨烯电极，通过恒定电位于石墨烯电极工作界面依次沉积普鲁士蓝颗粒、pedot聚合物层和金纳米颗粒，实现石墨烯/pb/pedot/au复合电极的低成本、大批量制备。继而采用抗体作为识别元件，构建功能化微型无标记免疫传感器，利用lig的 3d介孔结构的高比表面积、普鲁士蓝尖锐的电化学信号峰、pedot聚合物层的防污抗污能力以及进一步稳定普鲁士蓝信号的能力和贵金属纳米颗粒的高导电性，在不牺牲灵敏度的条件下，大大提升检测限，简化免疫分析过程，实现无标记电化学甲型h1n1流感病毒的免疫传感。进一步推进简便、绿色、低成本生物传感器的研制。
[0009]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种激光直写石墨烯/普鲁士蓝/pedot/金纳米粒子（lig/pb/pedot/au）复合电极的制备方法，包括如下步骤：1）设计三电极系统微电极图案，采用激光器，在高绝缘pi膜上打印出石墨烯微电极；2）于石墨烯微电极末端涂上导电银浆，作为信号的输出接头，高绝缘pi膜钝化电极非工作区域。再在工作电极区域采用恒定电位，在铁氰化钾（k3[fe(cn)6]）、六水合氯化铁（fecl3·
6h2o）、氯化钾（kcl）和盐酸（hcl）的混合溶液中电沉积pb；3）以edot单体和柠檬酸三钠（na3c6h5o7·
2h2o）为电沉积液，在工作电极区域恒定电位下沉积pedot；4）将一定浓度和体积的四水合氯金酸（haucl4·
4h2o）溶液和硫酸钠（na2so4）溶液混合，得到au电沉积溶液，以恒定电位在工作电极区域沉积au nps；5）以导电银浆作为信号输出接头，pi膜固定工作区域面积，ag/agcl浆涂在参比电极上，从而形成激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极。
[0010]
上述步骤1）中采用nano pro
‑ⅲ
型激光打印机（天津嘉银纳米科技有限公司），激光打印或激光诱导的条件为：激光器波长450 nm, 激光器输出功率5.5 w，激光强度20～40%，打印深度10～30%。 pi膜厚度0.08 μm, 背面带粘胶，贴覆于pet基底表面，剪切成长25 mm，宽 14 mm，厚度180 μm的石墨烯电极衬底，电极工作区域直径5 mm。
[0011]
优选的，上述步骤1）激光打印或激光诱导的条件为：激光器波长450 nm, 激光器输出功率5.5 w，激光强度35%，打印深度20%。pi膜厚度0.08 μm, 背面带粘胶，贴覆于pet基底表面，剪切成长25 mm，宽 14 mm，厚度180 μm的石墨烯电极衬底，电极工作区域直径5 mm。
[0012]
上述步骤2）中pb电沉积溶液为k3[fe(cn)6]、fecl3·
6h2o、kcl和hcl的混合溶液，其摩尔浓度分别为3 mmol/l k3[fe(cn)6]、3 mmol/l fecl3·
6h2o、0.1 mol/l kcl和0.1 mol/l hcl。采用辰华chi-660电化学工作站，将we接头连接lig电极的工作电极末端，ce接头连外接的铂丝电极，re接头连外接的银-氯化银参比电极，电沉积电位为
ꢀ‑
0.6 v～0.6 v，沉积时间为100 s～600 s。
[0013]
优选的，上述步骤2）pb恒电位沉积条件为：电沉积电位0.4 v，沉积时间400 s。
[0014]
上述步骤3）中pedot电沉积溶液为edot单体和na3c6h5o7·
2h2o的混合溶液，其摩尔浓度为0.02 mol/l edot单体和0.15 mol/l na3c6h5o7·
2h2o。采用辰华chi-660d电化学工作站，we接头连接lig电极的工作电极末端，ce接头连外接的铂丝电极，re接头连外接的银-氯化银参比电极，电沉积电位为0.4～1.2 v，沉积时间为100～500 s。
[0015]
优选的，上述步骤3）pedot恒电位沉积条件为：电沉积电位1.1 v，沉积时间400 s。
[0016]
上述步骤4）中金纳米颗粒的电沉积溶液为haucl4·
4h2o和na2so4的混合溶液，haucl4·
4h2o的质量浓度为1～10%，体积为10～50μl，电介质溶液为5 ml 0.1 mol/l na2so4溶液。采用辰华chi-660d电化学工作站，we接头连接lig电极的工作电极末端，ce接头连外接的铂丝电极，re接头连外接的银-氯化银参比电极，电沉积电位为
ꢀ‑
0.6 ～0.2v，沉积时间为100～300 s。
[0017]
优选的，上述步骤4）金纳米颗粒恒电位沉积条件为：电沉积恒电位为
ꢀ‑
0.6 v，沉积时间为300 s。
[0018]
一种无标记电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）抗体的组装：将mua溶液滴加到权利要求1所制备的激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极的工作界面，孵化30 min，用无水乙醇溶液缓慢淋洗，再换用超纯水缓慢淋洗，注意不能破坏电极表面，晾干；接着于工作电极表面滴加edc/nhs混合液，室温静置1h；水洗晾干；工作电极表面滴加抗体溶液，尽可能保持溶液环境中过夜孵化，水洗晾干；接着滴加5 μl 0.1 wt％bsa溶液封闭非特异性结合位点, 室温静置1 h，水洗晾干，冷藏，获得组装抗体的复合电极；（2）将样品溶液滴加到步骤1）所制备组装抗体的复合电极的工作区域，孵化一段时间，取出电极，缓慢水洗晾干；（3）滴加氯化钾溶液，进行循环伏安扫描，监测峰电流的变化，从而构建无标记电化学免疫传感器。
[0019]
上述步骤（1）中mua溶液，用乙醇和超纯水体积比为5：6的混合溶液溶解，浓度1～20 mmol/l，体积5～10 μl，分2次滴加，每次间隔15 min，共计孵化时间为30 min；edc和nhs摩尔比为4:1，浓度0. 1～10 mmol/l，体积5～20 μl，分3次滴加，每次间隔20 min，共计孵化时间1 h；所用抗体与目标抗原匹配，浓度为0.1～1 mg/ml。
[0020]
上述步骤（2）中所述样品为甲型h1n1流感病毒（h1n1）、新型冠状病毒抗原n蛋白（sars-cov-2 n）、癌胚抗原（cea）、细胞色素c（cyt-c）、牛血红蛋白（bhb）、溶菌酶（lz）的一种，浓度0.1 fg/ml～10 μg/ml，体积5～10 μl，孵化时间为30～90 min。
[0021]
上述步骤（3）中峰电流采用循环伏安法检测，电介质溶液为100 μl 0.1 mol/l氯化钾溶液, 扫描范围0～0.8 v，扫速0.05 v/s。
[0022]
一种上述方法制备所得的无标记电化学免疫传感器。
[0023]
上述无标记电化学免疫传感器在甲型h1n1流感病毒中的应用。
[0024]
本发明的显著优点在于：1）激光直写技术制备平面微电极，其操作简便，不需有机溶剂，绿色环保，成本极低，同时能在微尺度对电极进行图案化，能批量制备，为微米尺寸范围内的电极体系创造了特殊需求，利于设计小型化电化学传感器。
[0025]
2）电沉积普鲁士蓝颗粒、pedot聚合物层和金纳米颗粒对lig电极的组装：lig电极的修饰和自组装对提高lig电极的灵敏度、稳定性和便利性方面的性能至关重要。pb作为一种常见的电子媒介体，提供可逆的电极反应动力学，使氧化和还原的形式都能够稳定存在，且具有较窄的峰宽，在电化学分析中提供一个高灵敏的信号源。在lig/pb电极表面沉积一层pedot聚合物，进一步稳定pb电化学信号，同时制备的lig/pb/pedot电极具有较好的亲水性和防污抗污能力。最后将具有高导电性的金纳米粒子沉积在lig/pb/pedot电极表面，在改善lig/pb/pedot电极的电化学性能的同时便于引入羧基，进一步修饰抗体。
[0026]
3）本发明所采用的恒电位沉积技术相比于化学合成法，极大的缩短了修饰和自组装的时间，可以大批量制备，且通过电沉积可以得到结构均匀、性能稳定的lig修饰电极。
[0027]
4）无标记电化学免疫传感：无标记电化学免疫分析由于省略了标记步骤，简化了免疫分析的操作过程。高电导率和大比表面积的传感界面是改善无标记电化学免疫传感器性能的关键。采用lig技术制备的具有三维介孔结构的石墨烯大大增加了电极的表面积。此外，在石墨烯上电沉积普鲁士蓝纳米颗粒、pedot聚合物层和金纳米粒子，提高了lig电极的导电性、亲水性和防污抗污性能，有利于抗体的组装和抗原识别过程中非抗原物质的非特异性结合。实现在不牺牲灵敏度的条件下，制备无标记电化学甲型h1n1流感病毒的免疫传感。
[0028]
5）所构建的无标记免疫电化学传感器，特异性强，灵敏度极高，检测范围在0.0001 pg/ml～10 mg/ml，且有良好的重现性，该方法为甲型h1n1流感病毒的临床筛选和早期诊断提供了一个通用的、有前景的分析平台。
附图说明
[0029]
图1为lig/ pb/pedot/au复合电极的制备方法及免疫传感分析示意图；图2为lig、lig/ pb、lig/ pb/pedot和lig/ pb/pedot/au电极表面形貌的sem图；（a）lig电极；（b）lig/au lig/ pb电极；（c）lig/ pb/pedot电极；（d）lig/ pb/pedot/au电极；图3为lig、lig/ pb、lig/ pb/pedot和lig/ pb/pedot/au电极表面形貌的tem图；（a）lig电极；（b）lig/au lig/ pb电极；（c）lig/ pb/pedot电极；（d）lig/ pb/pedot/au电极；图4为lig、lig/ pb、lig/ pb/pedot和lig/ pb/pedot/au复合材料的xrd图；图5为lig、lig/ pb、lig/ pb/pedot和lig/ pb/pedot/au复合材料的拉曼谱图；图6为激光直写不同激光强度对lig电极的电化学性能的影响；图7为激光直写不同激光打印深度对lig电极的电化学性能的影响；图8为lig/pb和lig/pb/pedot 复合电极氯化钾溶液cv扫描50次cv曲线的变化；图9为lig/pb和lig/pb/pedot 复合电极氯化钾溶液cv扫描50次氧化峰电流值的
0.4 v，沉积时间为400 s。沉积完毕，用超纯水缓洗20s，注意不能破坏电极表面，自然晾干，从而形成lig/pb复合电极（图1c）。
[0035]
实施例3在实施例2中制备的lig/pb复合电极置于pedot电沉积液中浸泡5 min，电沉积液浸没电极工作区域，pedot电沉积液由edot单体和na3c6h5o7·
2h2o混合，其物质的量浓度为0.02 mol/l edot单体和0.15 mol/l na3c6h5o7·
2h2o，由于edot单体水溶性较差，建议使用磁子搅拌均匀溶解。采用辰华chi-660电化学工作站，we接头连接lig电极的工作电极末端，ce接头连外接的铂丝电极，re接头连外接的银-氯化银参比电极，电沉积恒电位为1.1 v，沉积时间为400 s。沉积完毕，用超纯水缓洗20s，注意不能破坏电极表面，自然晾干，从而形成lig/pb/pedot复合电极（图1d）。
[0036]
实施例4在实施例3中制备的lig/pb/pedot复合电极置于au纳米粒子电沉积液中浸泡1 min，电沉积液浸没电极工作区域，au纳米粒子电沉积液由haucl4·
4h2o和na2so4溶液混合，haucl4·
4h2o的质量浓度为10%，体积为50μl，电介质溶液为5 ml 0.1 mol/l na2so4溶液。采用辰华chi-660电化学工作站，we接头连接lig电极的工作电极末端，ce接头连外接的铂丝电极，re接头连外接的银-氯化银参比电极，电沉积恒电位为
ꢀ‑
0.6 v，沉积时间为300 s。沉积完毕，用超纯水缓洗20s，注意不能破坏电极表面，自然晾干，从而形成lig/pb/pedot/au复合电极（图1e）。
[0037]
采用扫描电子显微镜（sem）对lig、lig/pb、lig/pb/pedot和lig/pb/pedot/au 复合电极的表面形貌进行了表征（图2）。图2（a）可以清楚地看到呈3d蜂窝状结构的石墨烯，石墨烯的3d蜂窝状结构极大地提高了电极的比表面积，有利于电极表面的进一步修饰。图2（b）表明有较多的纳米颗粒较均匀地附着在石墨烯的表面，说明普鲁士蓝纳米颗粒已经成功沉积到石墨烯上，其粒径较大，形成石墨烯/pb复合材料。图2（c）中均匀分布的普鲁士蓝纳米颗粒近乎消失不见了，这是由于复合电极表面沉积的pedot聚合物层把大部分的纳米颗粒覆盖住了，从而形成了石墨烯/pb/pedot复合材料。图2（d）中原本较为平整的石墨烯介孔内壁，出现了尺寸较小的亮白纳米粒子，表明通过电沉积，au纳米粒子成功负载到复合电极表面，从而得到石墨烯/pb/pedot/au复合材料。
[0038]
实施例5在实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中所制备的电极工作界面用刮刀收集石墨烯、石墨烯/pb、石墨烯/pb/pedot和石墨烯/pb/pedot/au复合材料，研磨分散，采用透射电子显微镜（tem）对石墨烯、石墨烯/pb、石墨烯/pb/pedot和石墨烯/pb/pedot/au复合材料进行形貌表征（图3）。图3（a）表明石墨烯的片状结构，证明所采用的激光直写技术能制备出石墨烯。图3（b）片状石墨烯上出现了许多方块状物质，说明通过电沉积pb已经成功负载到石墨烯上。图3（c）沉积的pedot聚合物层覆盖了pb，导致方块状结构减少。图3（d）表明金纳米颗粒均匀地分散在石墨烯/pb/pedot材料的表面，au纳米颗粒的粒径大约为22.14 nm，形成石墨烯/pb/pedot/au复合材料。
[0039]
将实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中所制备的电极工作界面用刮刀收集石墨烯、石墨烯/pb、石墨烯/pb/pedot和石墨烯/pb/pedot/au复合材料，研磨分散，采用x射线衍射（xrd）对石墨烯、石墨烯/pb、石墨烯/pb/pedot和石墨烯/pb/pedot/au复合材料进行结
构分析（图4）。lig电极在2θ=25.92
°
处出现石墨烯特征峰，表明经激光直写处理的聚酰亚胺薄膜石墨化效果较好。lig/pb电极除了具有石墨烯特征峰外，还与17.38
°
、35.46
°
和42.76
°
处的衍射峰共同对应于面心立方的pb晶平面，但是由于pb沉积的量少，衍射峰强度低。pedot聚合物层对lig/pb电极衍射峰较小。lig/pb/pedot/au电极在38.24
°
、44.38
°
、64.62
°
和77.68
°
处出现面心立方晶体结构的au反射峰，在2θ=26.5
°
处出现石墨特征峰，表明au已成功地负载在lig电极上。
[0040]
将实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中所制备的电极工作界面用刮刀收集石墨烯、石墨烯/pb、石墨烯/pb/pedot和石墨烯/pb/pedot/au复合材料，研磨分散，采用拉曼光谱对石墨烯、石墨烯/pb、石墨烯/pb/pedot和石墨烯/pb/pedot/au复合材料进行结构分析。图5 lig的拉曼谱图表明其中在1339 cm-1
处的d峰表示结构缺陷和无序，在1577 cm-1
处的g峰表示c-c键晶格引起的一阶声子振动，在2678 cm-1
处2d峰表示c-c键晶体引起的二阶声子振动。石墨烯/pb/pedot/au复合电极修饰过程中，d峰和g峰都没有发生位移，表明石墨烯结构并未发生改变，g峰与d峰的强度比值和2d峰都发生了改变，说明修饰的材料会对石墨烯的电化学性能产生影响。
[0041]
实施例6设计三电极系统微电极图案，采用450 nm激光器，电源电压12 v，固定激光强度为35%，打印深度分别为10、15、20、25、30%，在高绝缘pi膜上打印出石墨烯微电极，电极依次水、乙醇淋洗，晾干。电极尾部涂上银胶，参比电极涂上银/氯化银浆，再用pi膜来固定工作区域面积，从而形成lig电极，用电化学工作站连接三电极末端，电极工作区域上滴加100 μl 5 mmol/l铁氰化钾含1.0 mol/l氯化钾混合溶液, 采用循环伏安扫描，扫描范围0～0.8 v，扫速0.1 v/s。结果如图3（a）所示，打印深度为25%和30%时，由于石墨烯被激光打飞，而当打印深度为10%和15%时，打印的石墨烯电极泛白，表明石墨化程度低，并且峰电流都低于打印深度为20%时，因此20%为最佳打印深度，石墨化和电化学性能俱佳。同理，固定打印深度20%，激光强度分别为20、25、30、35、40%，结果如图3（b），激光强度为20、25和30%时，打印的石墨烯泛白，石墨化程度低，故峰电流较小。而强度调至40%时，石墨烯被激光打飞，峰电流也不如强度为35%，因此最佳激光强度应为35%。综上，激光打印深度为20%、强度为35%时，可以得到石墨化程度高、电化学性能好的石墨烯电极。
[0042]
实施例7将实施例2和实施例3中制备的 lig/pb和lig/pb/pedot复合电极的工作界面滴加100 μl 0.1 mol/l氯化钾溶液，采用循环伏安扫描，扫描范围0～0.8 v，扫速0.05 v/s，两种电极分别先循坏扫描50次，用超纯水淋洗干净后再循坏扫描25次。得到图8、图9、图10和图11的结果，说明在lig/pb复合电极上沉积pedot聚合物层可以稳定pb的电化学信号，原因在于pedot中的氨基和羧基可以与pb配位，增加pb在中碱性条件下的稳定性。
[0043]
实施例8在实施例4中制备的lig/pb/pedot/au 复合电极的工作区域上滴加5 μl 5 mm 11-巯基十一烷酸（mua）溶液，mua由乙醇和超纯水体积比为5：6的混合溶液溶解，滴加两次，间隔15 min，预计孵化30 min，然后用超纯水和乙醇的混合溶液缓慢淋洗，再换用超纯水缓慢淋洗，注意不能破坏电极表面，晾干；接着于工作电极表面滴加5 μl 0.5 mmol/l 摩尔比为4:1的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐/ n-羟基琥珀酰亚胺（edc/nhs）混
合液，滴加三次，间隔20 min，室温静置1小时；电极水洗晾干；接着滴加5 μl 0.1 mg/ml 的h1n1抗体溶液（ab），尽可能保持溶液环境中过夜孵化，水洗晾干；最后滴加5 μl 0.1 wt％牛血清白蛋白（bsa）溶液封闭非特异性结合位点, 室温静置1 h，水洗晾干，待测。制备过程中得到的不同电极，在工作界面滴加100 μl 0.1 mol/l氯化钾溶液，采用循环伏安扫描，扫描范围0～0.8 v，扫速0.05 v/s；水洗晾干后，再滴加100 μl 5 mmol/l铁氰化钾含1.0 mol/l氯化钾混合溶液，进行循环伏安扫描，扫描范围0～0.8 v，扫速0.1 v/s。
[0044]
图12为铁氰化钾混合液扫描所得循环伏安曲线，相对于lig电极，lig/pb电极氧化还原峰电流强度显著增强，这是因为lig电极电化学响应信号是由扫描溶液铁氰化钾中的电化学活性物质[fe(cn)6]
3-所产生，而pb即fe4[fe(cn)6]3在溶液体系中可以产生大量的fe
3+
和[fe(cn)6]
4-作为电子媒介体，放大了[fe(cn)6]
3-的电化学信号，表明pb纳米颗粒已成功沉积到电极表面。而后面沉积的pedot和au纳米粒子虽然都是导电性物质，可以增强电极表面电子传递，但是它们会覆盖在pb上，抑制pb的电子媒介体作用，故电流信号略有下降。当电极表面修饰结合抗体、bsa和检测完h1n1抗原后，电流显著下降，说明修饰的物质通过共价键合或静电吸附已经结合到了电极表面，对电子的转移有阻碍作用。图中也能看出，h1n1抗原结合到免疫传感器上，电流值变化不大。由于pb作为电子媒介体，自身可直接产生电化学信号，氧化还原形式都能稳定存在，峰型窄灵敏度高。因此后续采用kcl溶液扫描复合电极，以pb的电化学信号为信号源，对h1n1抗原进行检测，结果如图13。裸lig电极未沉积pb，所以无氧化还原峰，其余复合电极峰电流变化和铁氰化钾扫描基本一致。加入过量的bsa，氧化还原电流变化较小，表明pedot对非特异性结合具有抑制作用，最后结合h1n1抗原，峰电流变化明显，这说明本发明所制备的lig/pb/pedot/au电化学免疫传感器能够通过监测免疫反应固定抗原后电流响应的变化值对h1n1浓度进行测定。
[0045]
实施例9在实施例4中制备的lig/pb/pedot/au 复合电极的工作区域上滴加5 μl 5 mm 11-巯基十一烷酸（mua）溶液，mua由乙醇和超纯水体积比为5：6的混合溶液溶解，滴加两次，间隔15 min，预计孵化30 min，然后用超纯水和乙醇的混合溶液缓慢淋洗，再换用超纯水缓慢淋洗，注意不能破坏电极表面，晾干；接着于工作电极表面滴加5 μl 0.5 mmol/l 摩尔比为4:1的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐/ n-羟基琥珀酰亚胺（edc/nhs）混合液，滴加三次，间隔20 min，室温静置1小时；电极水洗晾干；接着滴加5 μl 0.1 mg/ml 的h1n1抗体溶液（ab），尽可能保持溶液环境中过夜孵化，水洗晾干；最后滴加5 μl 0.1 wt％牛血清白蛋白（bsa）溶液封闭非特异性结合位点, 室温静置1 h，水洗晾干。工作电极表面滴加5 μl 不同浓度（0.0001、0.001、0.01、0.1、1.0、10、100、103、104、105、106和10
7 pg/ml）的h1n1溶液，室温静置1 h，水洗晾干，表面滴加100 μl 0.1 mol/l氯化钾溶液，采用循环伏安扫描，扫描范围0～0.8 v，扫速0.05 v/s。从图14 cv曲线可以看出氧化还原峰型很好，尖锐且电位差小。随着h1n1浓度的增加，氧化还原峰电流逐渐减小，最低浓度达0.0001 pg/ml，说明所制备的h1n1免疫传感器具有超高的灵敏度和极低的检测限。图15 表明h1n1在浓度范围1：0.0001～1 pg/ml和浓度范围2：1～107pg/ml之间峰电流（氧化峰电流：i
pa
）的变化值（）与h1n1浓度对数值呈良好的线性关系，其氧化峰电流线性方程为：
；线性方程为两条，是因为随着h1n1检测的浓度增加，特异性结合位点越来越少，pb电化学信号逐渐趋于饱和。表明所制备的lig/pb/pedot/au 复合电极用于无标记免疫传感器，可以对极低浓度的待测物质做出极大地电化学响应，且检测线性范围很宽，灵敏度超高、检测限极低，适用于甲型h1n1流感病毒无标记免疫传感。
[0046]
实施例10将实施例7中结合了0.01 pg/ml h1n1抗原的电极置于冰箱冷藏保存，连续六天每天在其表面滴加100 μl 0.1 mol/l氯化钾溶液，采用循环伏安扫描，扫描范围0～0.8 v，扫速0.05 v/s。40天后，再连续三天重复以上操作，以验证免疫传感器的稳定性。实验结果如图16和图17，峰电流值随着时间的推进逐渐减小，平均偏差为2.8009，可能是复合电极末端银胶被逐渐氧化，导电性变差。总体而言，所制备的lig/pb/pedot/au 复合电极稳定性良好，可以较长时间保存，为其实际应用提供了可能。
[0047]
实施例11在实施例4中制备的lig/pb/pedot/au 复合电极得工作区域上滴加5 μl 5 mm mua溶液，mua由乙醇和超纯水体积比为5：6的混合溶液溶解，滴加两次，间隔15 min，预计孵化30 min，然后用超纯水和乙醇的混合溶液缓慢淋洗，再换用超纯水缓慢淋洗，注意不能破坏电极表面，晾干；接着于工作电极表面滴加5 μl 0.5 mm 摩尔比为4:1的edc/nhs混合液，滴加三次，间隔20 min，室温静置1小时；电极水洗晾干；接着滴加5 μl 0.1 mg/ml 的h1n1抗体溶液（ab），尽可能保持溶液环境中过夜孵化，水洗晾干；最后滴加5 μl 0.1 wt％牛血清白蛋白（bsa）溶液封闭非特异性结合位点, 室温静置1 h，水洗晾干。工作电极表面滴加5 μl 10 ng/ml不同的蛋白质溶液，分别为甲型h1n1流感病毒（h1n1），牛血红蛋白（bhb），细胞色素c(cyt-c)，新型冠状病毒抗原n蛋白(sars-cov-2 n)，溶菌酶（lz），癌胚抗原(cea)；室温静置1 h，水洗晾干，表面滴加100 μl 0.1 mol/l氯化钾溶液，采用循环伏安扫描，扫描范围0～0.8 v，扫速0.05 v/s。图17和图19表明与h1n1相比，结合其他蛋白的氧化还原峰电流未发生明显变化，而识别h1n1之后的cv曲线的峰电流变化显著。表明本免疫传感器对h1n1有良好的特异性。
[0048]
实施例12选择胎牛血清(fbs)，人工汗液，人工尿液作为生物样本，以磷酸盐缓冲溶液（pbs）为溶剂，pbs可以起到平衡溶液ph保护试剂的作用，将各生物样本进行稀释，分别用稀释20倍的胎牛血清溶液、稀释2倍的人工汗液和稀释2倍的人工尿液作为基底溶液，分别添加h1n1 溶液，使其终浓度依次为0.0001、0.1 和100 pg/ml，按照实施例7步骤，识别各类生物样本中添加不同浓度的样品溶液，进行电化学测试（循环伏安法），记录的氧化峰电流，结果如表1所示。图8为各生物样本和pbs中添加h1n1浓度的对数与电流变化值δi之间的线性关系，从表1和图20可以看出此电化学传感器在空白的磷酸盐缓冲溶液中会受到一定的干扰，这是由于磷酸盐缓冲溶液中存在磷酸二氢根离子，故沉积在电极上的亚铁氰化铁会有部分溶解。那么除去pbs带来的干扰，人工汗液和fbs受到的干扰都比较小，人工汗液98~99% 都是水，因此对峰电流信号影响最小。而人工尿液中含有磷酸根等复杂离子存在，会加剧普鲁
士蓝颗粒的溶解，峰电流下降加快，干扰较大。总体而言，各生物样本添加回收率都在可接受范围之内，这一结果表明，该方法所制备的石墨烯/pb/pedot/au电化学免疫传感器可适用于较复杂的生物样品分析。
[0049]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
技术特征：1.一种激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：设计三电极系统微电极图案，采用激光器，在高绝缘聚酰亚胺膜上激光打印出石墨烯微电极；在步骤（1）得到的石墨烯微电极末端涂上导电银浆，作为信号的输出接头，高绝缘聚酰亚胺膜钝化电极非工作区域，再在工作电极区域采用恒定电位，在k3[fe(cn)6]、fecl3·
6h2o、kcl和hcl的混合溶液中电沉积普鲁士蓝颗粒；以3,4-乙烯二氧噻吩单体和柠檬酸钠的混合溶液为电沉积液，在工作电极区域恒定电位下沉积pedot；将haucl4·
4h2o溶液和na2so4溶液混合，得到au电沉积溶液，以恒定电位在工作电极区域沉积au nps；以导电银浆作为信号输出接头，pi膜固定工作区域面积，ag/agcl浆涂在参比电极上，形成激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极。2.根据权利要求1所述的激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极的制备方法，其特征在于：步骤1）中激光打印的条件为：激光器为连续半导体激光器，激光器波长450 nm, 激光器输出功率5.5 w，激光相对强度20～40%，打印相对深度10～30%，电极工作区域直径5 mm。3.根据权利要求1所述的一种激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极的制备方法，其特征在于：步骤2）的k3[fe(cn)6]、fecl3·
6h2o、kcl和hcl的混合溶液中各成分摩尔浓度分别为3 mmol/l k3[fe(cn)6]、3 mmol/l fecl3·
6h2o、0.1 mol/l kcl和0.1 mol/l hcl；电沉积的电位为
ꢀ‑
0.6 v～0.6 v，电沉积的时间为100 s～600 s。4.根据权利要求1所述的激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极的制备方法，其特征在于：步骤3）中pedot电沉积溶液中edot单体和na3c6h5o7·
2h2o的摩尔浓度分别为0.02 mol/l和0.15 mol/l；电沉积的电位为0.4～1.2 v，电沉积的时间为100～500 s。5.根据权利要求1所述的激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极的制备方法，其特征在于：步骤4）中金纳米颗粒的电沉积溶液中haucl4·
4h2o的质量浓度为1～10%，体积为10～50μl，na2so4溶液浓度为0.1 mol/l，体积为5ml，电沉积恒电位为
ꢀ‑
0.6～0.2v，电沉积时间为100～300 s。6.一种如权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极。7.一种利用权利要求6的激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极制备无标记电化学免疫传感器的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）抗体的组装：将11-巯基十一烷酸（mua）溶液滴加到激光直写石墨烯/pb/pedot/au复合电极的工作界面，孵化30 min，先用无水乙醇溶液缓慢淋洗，再换用超纯水缓慢淋洗，晾干；接着于工作电极表面滴加1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐/ n-羟基琥珀酰亚胺混合液，室温静置1h；水洗晾干；工作电极表面滴加抗体溶液，水洗晾干；接着滴加牛血清白蛋白溶液封闭非特异性结合位点, 室温静置1 h，水洗晾干，冷藏，获得组装抗体的复合电极；（2）将样品溶液滴加到步骤1）所制备组装抗体的复合电极的工作区域，孵化后取出电极，缓慢水洗晾干；
（3）滴加氯化钾溶液，进行循环伏安扫描，监测峰电流的变化，从而构建无标记电化学免疫传感器。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中11-巯基十一烷酸溶液是用乙醇和超纯水体积比为5：6的混合溶液溶解，浓度1～20 mmol/l，体积5～10 μl，分2次滴加，每次间隔15 min，共计孵化时间为30 min；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐/ n-羟基琥珀酰亚胺混合液中1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为4:1，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐/ n-羟基琥珀酰亚胺混合液的浓度0.1～10 mmol/l，体积5～20 μl，分3次滴加，每次间隔20 min，共计孵化时间1 h；所用抗体与目标抗原匹配，浓度为0.1～1 mg/ml。9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤2）中样品为甲型h1n1流感病毒、新型冠状病毒抗原n蛋白、癌胚抗原、细胞色素c、牛血红蛋白、溶菌酶的一种，样品溶液的浓度0.1 fg/ml～10 μg/ml，体积5～10 μl，孵化的时间为30～90 min。10.一种如权利要求7所述的方法制得的无标记电化学免疫传感器在检测甲型h1n1流感病毒中的应用。
技术总结本发明公开了一种激光直写技术制备石墨烯/PB/PEDOT/Au复合电极的方法，及在超高灵敏无标记免疫电化学传感的应用。本发明结合激光直写技术制备微型平面石墨烯电极，采用恒电位法于石墨烯电极工作界面依次电沉积PB、PEDOT和金纳米粒子，得到LIG/PB/PEDOT/Au复合电极。继而采用抗体作为识别元件，构建功能化微型无标记电化学免疫传感器，利用LIG 3D介孔结构的高比表面积和导电性，以PB作为灵敏的电子媒介体，PEDOT聚合物层进一步稳定PB信号以及防污抗污能力，结合Au NPs的导电性和易组装性，通过Au-S键引入羧基，共价交联抗体，从而构建H1N1流感病毒无标记免疫传感器。H1N1流感病毒无标记免疫传感器。H1N1流感病毒无标记免疫传感器。
技术研发人员：李艳霞 汪广源 陈芳如 陈佳怡 张兆康
受保护的技术使用者：闽江学院
技术研发日：2022.07.22
技术公布日：2022/11/1
