本发明涉及生物细胞培养，尤其涉及一种高表达的cho细胞培养方法。
背景技术：
1、cho细胞全称中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary，cho)，于1957年美国科罗拉多大学dr. theodore t. puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，是目前生物工程上使用最为广泛的细胞系之一。工业上最常用的cho细胞系主要分为chok1、chok1sv、chozn、chodg44、chos等，cho细胞在生物工程中常用于重组治疗性蛋白和单克隆抗体(mab)的制备，如阿达木单抗、贝洛托单抗等。相较于其他细胞类型，cho细胞具有（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长，（2）在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性，（3）能够表达与人相似的翻译后修饰等优点。最早的体外细胞培养培养基是由血清（人或者胎牛），血浆或者组织提取物营养样的组件，其提取过程复杂、批次间稳定性差且化学成分不明确，普通cho细胞培养通常需要10%胎牛血清，这会增加污染风险，不利于下游工艺中的蛋白纯化。因此，使用化学成分确定，无血清、无蛋白成分来源的细胞培养培养基对实际工业生产影响重大。
2、无动物源成分的化学限定培养基主要包含氨基酸，维生素，微量元素，无机盐，碳源，脂类及添加剂等成分，这些组分对细胞培养过程中细胞的生长和表达至关重要。脂类（lipid）亦称脂质，是一大类性质上不溶或微溶于水而溶于有机溶剂的有机化合物，脂肪酸和醇所形成的酯类及其衍生物，是人体需要的重要营养素之一，可为机体提供所需能量及必需脂肪酸。脂质是细胞膜的主要组成之一，细胞膜保证了细胞内环境的相对稳定，同时调节和选择相应物质进出细胞，是物质自由进出细胞的屏障，在物质运输和蛋白分泌过程中也起了很重要的作用。细胞膜组成十分复杂，主要含甘油磷脂、鞘磷脂、糖脂、胆固醇、蛋白质和碳水化合物等，其中甘油磷脂中以磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸含量最高，其合成的基本原料为甘油、脂肪酸、磷酸盐、胆碱、丝氨酸和肌醇等，而鞘磷脂的主要合成原料包括脂酰coa和丝氨酸，此外还需要吡哆醛等辅酶的参与。所以培养基中需要添加胆碱、乙醇胺、肌醇等等这些原料成分。脂肪酸和甘油主要由葡萄糖代谢转化而来，在培养基中可以添加适量浓度的脂质，对改善细胞生长、代谢，提高细胞蛋白表达效果显著。
3、目前，细胞在培养过程中仍然存在密度低、活率低、乳酸积累、蛋白产量低等问题。
技术实现思路
1、本技术实施例通过提供一种高表达的cho细胞培养方法，解决了细胞培养过程中细胞存在密度低、活率低、乳酸积累、蛋白产量低等问题，改善cho细胞的生长和表达，不仅降低了企业成本，也减少了实际工业生产过程由乳酸积累引发的技术问题。
2、本技术实施例提供了一种高表达的cho细胞培养方法，具体包括如下步骤：
3、s1：将冻存的cho细胞在培养基里复苏，将细胞置于37℃、8%二氧化碳、110-130rpm条件下的摇床中培养；
4、其中，所述培养基中额外添加混合脂类，混合脂类为吐温80、生育酚、亚麻酸、胆固醇中二至四种物质组合而成；
5、吐温80：0.025-0.75mg/l，生育酚：0.1-3mg/l，亚麻酸：0.225-6.75mg/l，胆固醇：0.15-4.5mg/l；
6、所述cho细胞为chok1细胞；
7、s2：每2-3天进行一次传代操作，保持细胞处于早期对数生长期，细胞接种密度为(0.3-1.0)-1.0×106cells/ml；
8、s3：当细胞密度达到4.5-6.0×106cells/ml，细胞活率≥95％，间隔2-3天时，再次传代；
9、s4：按照s2和s3方法传代2-4次，细胞群体倍增时间稳定后开始接种，将细胞接种至所述培养基，125ml摇瓶或5l搅拌罐式生物反应器中进行培养；
10、其中，摇床的温度为36.5-37℃，转速为130±20rpm，培养箱中co2浓度设置为5%-10%；生物反应器的温度为36.5-37℃，初始转速为180±20rpm，ph设置为7.0±0.3，do设置为40%；pdt稳定后偏差＜3h；接种密度在0.4-1.2×106cells/ ml；
11、s5：培养后使用补料培养基进行批次补料；
12、其中，补料3-8%，至培养结束前1-2天停止补料；
13、s6：培养14天-16天收获，检测蛋白浓度；
14、其中，蛋白为抗体。
15、进一步的，所述混合脂类的添加以分步的方式进行。
16、进一步的，分步的方式为，在培养基混合脂类的初始添加中，添加量按照各物质添加总量百分比计，吐温80为75%；生育酚为80%；亚麻酸为50%；胆固醇为50%；
17、剩余部分混合脂类在步骤s5，使用补料培养基进行批次补料的同时添加，补料补脂。
18、进一步的，所述补料补脂，具体为，混合脂类与补料同时添加，每2天添加一次，至培养结束前2天前停止添加，共添加6次，每次添加的混合脂类的总量相同；具体的，每次的添加量按照各物质添加总量百分比计，吐温80为4.2%，生育酚为3.3%，亚麻酸为8.3%，胆固醇为8.3%。
19、进一步的，所述补料补脂，混合脂类在不同细胞生长阶段的添加量不同；
20、其中，细胞生长阶段分为初期，中期和后期。
21、进一步的，所述初期为细胞培养的0-6天，添加3次；中期为细胞培养的6-10天，添加2次；后期为细胞培养的10-14天，添加1次。
22、进一步的，所述添加量按照各物质添加总量百分比计为：
23、初期，吐温80为6%，生育酚为2%，亚麻酸为7%，胆固醇为8%；
24、中期，吐温80为3%，生育酚为4%，亚麻酸为11.5%，胆固醇为9.5%；
25、后期，吐温80为1%，生育酚为6%，亚麻酸为6%，胆固醇为7%。
26、进一步的，进行大规模培养时，步骤s4中将细胞接种至3l转瓶培养。
27、进一步的，所述转瓶左端设置后盖，后盖密封，后盖左端连接气管，后盖中含有上下排布的3个注射器，注射器连接至转瓶内部，注射器的阻力不同；
28、上部注射器的阻力范围为0.5-1.0 n·s/m3，中部注射器的阻力范围为1.5-2.5n·s/m3，下部注射器的阻力范围为3-4 n·s/m3。
29、进一步的，每间隔12h抽样检测乳酸含量，当乳酸含量高于1.0g/l时，统一添加甲状腺激素0.1-0.3nm。
30、本技术实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
31、其一、本发明利于cho细胞表达目标蛋白，改善cho细胞生长、表达；采用本发明优化后的培养基，生长方面，细胞峰密度可达20.7×106 cells/ml，培养14天时的收获活率可提高至90.39%，乳酸0g/l，表达量可达7598mg/l；本发明在不改变培养基溶解度的前提下，通过添加混合脂类，以细胞生长、代谢、蛋白表达为评价指标，发现培养基中最佳脂类物质种类及浓度组合，解决了细胞培养过程中细胞存在密度低、活率低、乳酸积累、蛋白产量低等问题，不仅降低了企业成本，也减少了实际工业生产过程由乳酸积累引发的技术问题；
32、其二、通过分步添加混合脂类，改善了细胞的代谢途径，使得乳酸的生成和消耗更加平衡，在培养后期，由于细胞密度的稳定和高效的代谢调节，乳酸得到了有效的消耗，避免了乳酸的积累，且在培养后期乳酸得到了有效的消耗，避免了乳酸的回升现象，这种平衡的代谢状态能够促进细胞的健康生长和高产表达；分步的混合脂类添加方式提高了细胞的健康状态和代谢效率，促进了目标蛋白的合成和分泌，同时，细胞密度的提高和代谢环境的改善，促进了蛋白的高表达；
33、其三、通过分阶段调整混合脂类的添加量，初期的高浓度吐温80促进了细胞的分散和生长，中期增加的亚麻酸和胆固醇促进细胞膜的形成和稳定，后期增加的生育酚增强了细胞的抗氧化能力，从而在整个培养过程中维持了较高的细胞生长速率和密度；
34、其四、大规模培养中，通过在转瓶中设置不同阻力的注射器，并结合气压控制实现甲状腺激素的自动化添加，提高了大规模培养过程的效率和稳定性，通过转瓶的重新设计，能够实现自动化操作，显著提高甲状腺激素的添加效率，减少了人工干预，避免了人为错误，确保了每次添加甲状腺激素的效率，以及添加的准确性和一致性。
1.一种高表达的cho细胞培养方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的高表达的cho细胞培养方法，其特征在于，所述混合脂类的添加以分步的方式进行。
3.如权利要求2所述的高表达的cho细胞培养方法，其特征在于，分步的方式为，在培养基混合脂类的初始添加中，添加量按照各物质添加总量百分比计，吐温80为75%；生育酚为80%；亚麻酸为50%；胆固醇为50%；
4.如权利要求3所述的高表达的cho细胞培养方法，其特征在于，所述补料补脂，具体为，混合脂类与补料同时添加，每2天添加一次，至培养结束前2天前停止添加，共添加6次，每次添加的混合脂类的总量相同；具体的，每次的添加量按照各物质添加总量百分比计，吐温80为4.2%，生育酚为3.3%，亚麻酸为8.3%，胆固醇为8.3%。
5.如权利要求3所述的高表达的cho细胞培养方法，其特征在于，所述补料补脂，混合脂类在不同细胞生长阶段的添加量不同；
6.如权利要求5所述的高表达的cho细胞培养方法，其特征在于，所述初期为细胞培养的0-6天，添加3次；中期为细胞培养的6-10天，添加2次；后期为细胞培养的10-14天，添加1次。
7.如权利要求5所述的高表达的cho细胞培养方法，其特征在于，所述添加量按照各物质添加总量百分比计为：
8.如权利要求1所述的高表达的cho细胞培养方法，其特征在于，进行大规模培养时，步骤s4中将细胞接种至3l转瓶培养。
9.如权利要求8所述的高表达的cho细胞培养方法，其特征在于，所述转瓶左端设置后盖，后盖密封，后盖左端连接气管，后盖中含有上下排布的3个注射器，注射器连接至转瓶内部，注射器的阻力不同；
10.如权利要求9所述的高表达的cho细胞培养方法，其特征在于，每间隔12h抽样检测乳酸含量，当乳酸含量高于1.0g/l时，统一添加甲状腺激素0.1-0.3nm。
