本发明属于药物敏感性检测领域，具体涉及一种利用流式细胞术测定抗菌药物对结核分枝杆菌体外杀菌效果的方法。
背景技术：
1、结核病（tuberculosis，tb）这一由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，mtb）感染引起的古老的慢性传染病至今依然严重危害人类健康，尤其影响到最贫穷和脆弱的群体。在过去的2000年中，tb已造成超过10亿人死亡，全球每年依然有约150万人死于tb。因此，对于结核病的防治，一直都受到高度重视。
2、抗菌药物的非临床药效动力学的研究，可以间接反映抗菌药物进入机体后再感染病灶内达到抑菌或杀菌效果的动态过程，预测药物在人体内的杀菌或抑菌效果，对临床研究及给药方案制定具有重要的参考价值。传统技术中，对结核分枝杆菌药物敏感性的研究一般是采用菌落培养计数的方式，培养周期一般28天左右。研究周期过长，严重影响了抗菌药物对结核分枝杆菌治疗药物的杀菌效果的测试周期。
技术实现思路
1、本发明为了解决现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供了一种流式细胞术在鉴定结核分枝杆菌体外药物敏感性的方法及应用，不但可以大大减少非临床药物敏感性的检测周期，而且准确度高，方便快捷。
2、为解决上述技术问题，本发明提供一种利用流式细胞术测定抗菌药物对结核分枝杆菌体外杀菌效果的方法，经过梯度浓度的抗菌药物作用后的结核分枝杆菌，利用流式细胞术对杀菌效果进行分析，得到对结核分枝杆菌体外最佳杀菌效果的用药浓度。
3、进一步，包括以下步骤：
4、s1待测菌液准备；
5、s2结核分枝杆菌药物敏感性检测：利用比例法，数菌落确定结核分枝杆菌的最小抑菌浓度mic；
6、s3不同浓度药物的杀菌试验：以步骤s2获得的最小抑菌浓度mic为基础，设定不同的药物浓度：0.5×mic、1×mic、2×mic、4×mic、8×mic、16×mic、32×mic、64×mic，不同浓度的药物溶液加入37℃预温的m7h10肉汤中，涡匀；将对数期的结核分枝杆菌菌落加入肉汤中，37℃，5%co2培养箱培养，分别于第0、1、3、7、10、14天取样，低温保存、待用；
7、s4阴性对照组：取步骤s3的菌液加入缓冲液，混匀，作为阴性对照组；
8、s5补偿调节组：取步骤s3经药物孵育过的菌液2组，其中1组加入dmao染色工作液，另外1组加入pi染色工作液，作为补偿调节组；
9、s6实验组双重荧光染色：取步骤s3的菌液加入dmao和pi染色工作液，混匀，作为实验组；
10、s7流式细胞仪检测：将步骤s4、s5、s6各组样本置于37ºc避光孵育15min，然后置于流式细胞仪，对待测菌液进行计数，获得待测菌液中活菌的计数数据；
11、s8拟合杀菌曲线确定最佳抑菌浓度：根据待测菌液中活菌的计数数据，拟合药物浓度-结核分枝杆菌的杀菌曲线，从而获得药物对结核分枝杆菌的最佳杀菌效果对应的药物浓度。
12、其中，步骤s1的具体过程如下：
13、s11将解冻的菌株在带有玻璃珠的磨菌瓶中加入 1～2 滴 10%吐温-80 溶液；
14、s12用无菌接种环刮取 2～3 周的新鲜菌落，置于磨菌瓶中；
15、s13旋紧瓶盖，在涡旋振荡器上振荡 10～20 秒；
16、s14静置 30 分钟，小心打开瓶盖，加入约 2ml 灭菌生理盐水，静置片刻，使菌液中的大块物质沉淀；
17、s15用无菌吸管吸取中上部的菌液，约 1ml，转移到另一无菌试管中，与麦氏1号标准比浊管比浊；
18、s16逐渐滴加灭菌生理盐水，直至菌液浊度与麦氏 1号标准比浊管一致，即得到1mg/ml 的菌液。
19、步骤s7的具体过程如下：
20、s71参数设置：在流式细胞仪上采集阴性对照组样本，设置前向散射和侧向散射参数，移动阴性对照组至合适的区域，圈出目标细胞。调整pi和dmao通道中的电压，使得阴性对照组的荧光直方图位于荧光对数标度的第一阶内；
21、s72利用调节补偿组样本，进行荧光补偿调节：使dmao阳性样本的荧光直方图位于荧光对数标度的第二阶内，pi阳性样本的荧光直方图位于荧光对数标度的第四阶内；对第一阶内阴性峰设门， 第二阶内阳性峰设门，第四阶内阳性峰设门；然后计算补偿并应用到样本管；
22、s73实验组样本分析，使用二维fl1（533/30 bp）与 fl3 （610/20 bp）对数刻度散点图查看荧光检测结果；创建两参数散点图；使用多边形门p2圈出pi阳性细胞群，p4圈出pi阳性+dmao阳性细胞群，画出统计表，分别计算出细胞总数，及p2阳性百分比。取3次实验的平均值并记录。
23、进一步，流式细胞仪的激发波长为488nm。
24、进一步，dmao和pi染色工作液的浓度为100x。
25、本发明所达到的有益技术效果：本发明提供的一种流式细胞术在测试抗菌药物对结核分枝杆菌治疗药物的杀菌效果的方法，结合流式细胞术和计数方法，在3小时内就可以完成检测样本中结核分枝杆菌存活状态，相较于传统方法的28天，速度有极大的提升。该方法不但在非临床的药代动力学上具有重要的意义，而且为临床上测试抗菌药物对结核分枝杆菌的杀菌效果提供了坚实的理论基础。
1.利用流式细胞术测定抗菌药物对结核分枝杆菌体外杀菌效果的方法，其特征在于：经过梯度浓度的抗菌药物作用后的结核分枝杆菌，利用流式细胞术对杀菌效果进行分析，得到对结核分枝杆菌体外最佳杀菌效果的用药浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在在于，步骤s1的具体过程如下：
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在在于，步骤s7的具体过程如下：
5.根据权利要求4所述的采用流式细胞术确定结核分枝杆菌最佳用药量的方法，其特征在在于：流式细胞仪的激发波长为488nm。
6.根据权利要求2所述的采用流式细胞术确定结核分枝杆菌最佳用药量的方法，其特征在在于：dmao和pi染色工作液的浓度为100x。
