本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用群体感应调控降低副干酪乳杆菌自溶率实现甜高粱汁合成乳酸的方法。
背景技术：
1、乳酸（2-羟基丙酸）是一种高价值的有机酸。乳酸有羟基和羧基官能团可以促进各种化学转化，如：脱水、脱羧、缩合、氧化、氢化和酯化。因此，乳酸是生产各种化学品的良好平台化学品，已被广泛应用于诸多领域。乳酸可聚合成可生物降解塑料聚乳酸，在包装、3d打印、农业和纺织品领域被不断使用，是乳酸工业应用的最大主导方向，2018年占乳酸市场收入的28.3%。其次，乳酸天然存在两种旋光异构体：l-乳酸和d-乳酸，人体仅有l-乳酸脱氢酶，因此d-异构体对人类新陈代谢有害。于是l-乳酸作为一种公认安全化学品，特别被食品、医疗、护肤品行业所青睐。乳酸在食品工业中常用作各种安全添加剂，如酸化剂、调味剂和防腐剂。此外还可以抑制加工食品中孢子的形成，保障食品安全。在医疗领域，因其良好的生物相容性和安全性，多用于制作无排斥反应、能够被人体完全重新吸收的销钉、夹具夹板等器材，如组织再生、手术缝合、骨折固定、植入物和韧带、半月板、软骨修复、骨置换等手术材料，在口腔手术中也多有应用。在化妆品行业，乳酸常用于嫩肤、ph调节，是保湿剂、皮肤美白剂、护发配方等的常见成分。
2、乳酸可以通过化学、生物发酵法合成。化学法合成乳酸最早是由威斯利克努斯在1863年发现。首先将氰化氢在碱性催化剂、高压条件下加到液体乙醛中生产得到乳腈，随后通过用硫酸水解并用甲醇酯化生产乳酸甲酯，最后通过蒸馏分离甲醇来回收纯化的乳酸。化学合成产生的是d/l-乳酸外消旋混合物，产物纯度低、不易分离。并且化学合成法的原料来自其他工业的化石燃料衍生的副产品，因此化学合成难以摆脱对昂贵的石油基原材料的依赖和产品杂质的影响。微生物发酵法生产乳酸不仅可以克服上述弊端，还具有如下优势：①发酵条件温和、成本较低、过程清洁、效率高；②通过选择适宜的菌种和底物，在一定的发酵条件下可得到特定的旋光异构体。因此，微生物发酵产乳酸的研究越来越受到关注。在众多产乳酸的微生物中，副干酪乳杆菌是目前最具发展前景的生产菌种之一。但目前微生物发酵法合成乳酸的生产成本偏高，影响了其产业化的进程。采用廉价或废弃的非粮生物质资源替代葡萄糖进行乳酸合成，不仅是对废弃的生物质资源再利用，而且可以有效降低乳酸生产原料成本，对促进乳酸生物发酵法生产具有重要的意义。
3、为了降低生产成本，避免与民争粮，工业化乳酸生产的研究工作越来越集中于寻找新的有效的营养来源，以实现l-乳酸的高底物转化和高浓度生产。在非谷物化合物的几种来源中，甜高梁汁作为一种农业废弃物，是一种富含高糖的生物能源，与其他低成本材料（如木质纤维素生物质）相比，更容易处理、成本更低。这是因为甜高粱种植能强，虽然甜高粱原产于热带地区，但很好地适应了温带气候，它具有很强的抗干旱和耐盐性，即使在恶劣环境中也具有显着的产量潜力。
4、在乳酸菌发酵的中后期，菌体量达到一定量时，开始出现od600下降、菌体量减少的问题，这对于产物积累来说是不利的。相关研究表明，菌群密度的调控主要与群体感应(quorum sensing，简称qs)相关。群体感应作为一种细胞间通讯过程，是细菌进行种内或种间信息交流的一种信号转导机制。qs调控细菌根据周围微生物群落的细胞密度和物种组成的变化来改变菌群行为。近几年的研究发现，群体感应系统中的二类信号分子(autoinducer-2，简称ai-2)在微生物细胞间交流中起到关键作用，广泛存在于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中。ai-2是一种呋喃酮类化合物，为对称的双五圆环结构的呋喃酮酰硼酸二酯，它是甲硫氨酸循环通路—甲基循环的一个副产品。据报道，一些g+细菌能够通过qs系统激活一些乳酸菌特异信号途径，增加细菌素(一种具有抑菌作用的多肽)产量，从而增加对同源种或近似种才有拮抗作用。除此之外，一些研究表明，ai-2群体感应系统或许对副干酪乳杆菌的自溶率有影响且利用qs调控乳酸菌生长代谢和产物合成的应用较少。本发明首次利用群体感应调控降低副干酪乳杆菌自溶率，实现了直接利用甜高粱汁高效合成乳酸。
技术实现思路
1、为了解决传统乳酸发酵方法以粮食或其他淀粉质副产品为原料生产成本过高的问题，本发明利用群体感应调控降低副干酪乳杆菌自溶率，实现了直接利用甜高粱汁高效合成乳酸。
2、本发明采用的技术方案为：
3、一种利用群体感应调控降低自溶率实现甜高粱汁合成乳酸的方法，包括以下步骤：
4、（1）将群体感应抑制剂添加到含有甜高粱汁的发酵培养基中；
5、（2）将活化的副干酪乳杆菌接种到步骤1）的发酵培养基中进行厌氧发酵生产乳酸；
6、步骤（1）所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌（ lactobacillus paracasei）lys2。
7、步骤（1）所述群体感应抑制剂为芒果苷、呋喃酮、黄芩素中的至少一种。
8、步骤（2）所述活化的副干酪乳杆菌的接种量为发酵培养基体积的1~10%。
9、步骤（2）所述发酵条件为：发酵温度35-37 ℃，发酵ph为5.5-6.5，转速180-220rpm。
10、步骤（1）所述含有甜高粱汁的发酵培养基配方为：含糖浓度为80-90 g/l的甜高粱汁，5-10 g/l玉米浆干粉，10-30 g/l caco3，溶剂为水，调节ph至6.0。
11、群体感应抑制剂的添加量为100-200 mg/l，所述的群体感应抑制剂添加到发酵培养基中，添加时间为在活化的副干酪乳杆菌接种到发酵培养基之前。优选群体感应抑制剂为黄芩素。
12、步骤（2）所述副干酪乳杆菌的活化条件如下：
13、取0.5-1.0 ml副干酪乳杆菌菌液涂覆于mrs培养基中于37 ℃培养12-24 h；用0.5-1.0 ml无菌水冲洗mrs培养基中的菌落，并接种于活化培养基于37 ℃，180 rpm培养12-18 h；
14、mrs培养基为：5-10 g/l蛋白胨，3-6 g/l牛肉膏粉，3-5 g/l酵母粉，10-20 g/l葡萄糖，1.0-2.0 g/l吐温-80，1.0-3.0 g/l k2hpo4，3.0-6.0 g/l乙酸钠，1.0-3.0 g/l柠檬酸三铵，0.1-0.3 g/l mgso4·7h2o，0.01-0.1 g/l mgso4·4h2o，10-20 g/l琼脂。
15、所述活化培养基为：3.0-5.0 g/l酵母粉，5-10 g/l nahco3，5-10 g/l nah2po4·2h2o，10-20 g/l k2hpo4·3h2o，2.0-3.0 g/l玉米浆，0-35 g/l caco3，溶剂为水。
16、本发明将活化的副干酪乳杆菌接种到含有甜高粱汁的发酵培养基中进行厌氧发酵生产乳酸；将群体感应抑制剂添加到发酵液中来抑制副干酪乳杆菌群体感应信号分子ai-2的产生，以此来降低副干酪乳杆菌的自溶率。
17、优选地，所述发酵时间为144 h，所述群体感应抑制剂黄芩素添加到发酵培养基中，添加时间为在活化的副干酪乳杆菌接种到发酵培养基之前。
18、所述发酵条件优选为：5l发酵罐，温度37 ℃，发酵时间为144 h，发酵ph为6.0，转速为180 rpm。
19、本发明通过添加群体感应抑制剂进行群体感应调控来降低副干酪乳杆菌自溶率，提高了菌体量，优选群体感应抑制剂为黄芩素；
20、所述的群体感应抑制剂添加到发酵培养基中，起始添加量为100-200 mg/l，优选为150 mg/l。
21、进一步优选地，在发酵24h和48h再次分别补加20~60 mg/l群体感应抑制剂，更优选地补加浓度为50 mg/l抑制剂。
22、加入抑制剂后，发酵过程中菌株生长量有显著提升，且48 h未出现下降，维持理想水平。
23、本发明添加群体感应抑制剂黄芩素的实验组的细胞壁相对完整，细胞饱满圆润，几乎未出现细长细胞，活性较好，黄芩素具有促进副干酪乳杆菌生长和降低自溶的作用，便于后续连续化或者高密度发酵的进行。
24、副干酪乳杆菌分类命名为副干酪乳杆菌（ lactobacillus paracasei），菌株号为lys2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏编号为cctcc no：m 20211178，保藏日期为2021年9月15日。该菌株具有转化率高、光学纯度高、收率高、副产物少等优点，其具有较宽的底物利用谱，可以高效利用果糖合成乳酸。
25、有益效果：与现有技术相比，本发明的技术优势如下：
26、本发明中使用的发酵培养基中以甜高粱汁作为唯一碳源和低成本玉米浆干粉作为部分氮源，成本低廉，营养物质充足，操作简便，有较高的应用价值。通过添加群体感应抑制剂进行群体感应调控来降低副干酪乳杆菌自溶率，从而提升产物合成能力。这是首次通过添加群体感应抑制剂降低副干酪乳杆菌自溶率，提高副干酪乳杆菌发酵的菌体量，从而提升产物合成能力的方法。
27、通过添加群体感应黄芩素降低了菌体自溶率，提高菌体量。本发明在5l发酵罐中发酵结果为乳酸产量206.1 g/l，收率达0.93 g/g。该方法是目前利用甜高粱汁为唯一碳源发酵得到的最高乳酸产量，极大降低了工业生产乳酸的底物成本，具有重要的应用价值。
1.一种利用群体感应降低自溶率实现甜高粱汁合成乳酸的方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌（lactobacillus paracasei）lys2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述群体感应抑制剂为芒果苷、呋喃酮、黄芩素中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述活化的副干酪乳杆菌的接种量为发酵培养基体积的1~10%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述发酵条件为：发酵温度35-37℃，发酵ph为5.5-6.5，转速180-220 rpm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述含有甜高粱汁的发酵培养基配方为：含糖浓度为80-90 g/l的甜高粱汁，5-10 g/l玉米浆干粉，10-30 g/l caco3，溶剂为水，调节ph至6.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，群体感应抑制剂的添加量为100-200 mg/l，所述的群体感应抑制剂添加到发酵培养基中，添加时间为在活化的副干酪乳杆菌接种到发酵培养基之前。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述副干酪乳杆菌的活化条件如下：取0.5-1.0 ml副干酪乳杆菌菌液涂覆于mrs培养基中于37 ℃培养12-24 h；用0.5-1.0ml无菌水冲洗mrs培养基中的菌落，并接种于活化培养基于37 ℃，180 rpm培养12-18 h。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，mrs培养基为：5-10 g/l蛋白胨，3-6 g/l牛肉膏粉，3-5 g/l酵母粉，10-20 g/l葡萄糖，1.0-2.0 g/l吐温-80，1.0-3.0 g/l k2hpo4，3.0-6.0 g/l乙酸钠，1.0-3.0 g/l柠檬酸三铵，0.1-0.3 g/l mgso4·7h2o，0.01-0.1 g/lmgso4·4h2o，10-20 g/l琼脂。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述活化培养基为：3.0-5.0 g/l酵母粉，5-10 g/l nahco3，5-10 g/l nah2po4·2h2o，10-20 g/l k2hpo4·3h2o，2.0-3.0 g/l玉米浆，0-35 g/l caco3，溶剂为水。
