本发明涉及生物，具体涉及一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒。
背景技术：
1、非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)引起的急性、烈性、高度接触性的传染病，给全球养猪业带来了巨大的威胁。2020年，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家非洲猪瘟专业实验室在开展非洲猪瘟流行病学监测及病原学研究中发现，我国部分省区出现了低致死率的非洲猪瘟2型自然变异流行株，如mgf基因缺失株，这些基因缺失株与典型强毒株相比，其致病力降低，但仍具有明显的残留毒力，较高剂量接种猪可引起亚急性、慢性病程和部分死亡，较低剂量感染则主要引起持续感染和慢性病程，具有很强的水平传播能力。2022年6月3日，越南中央动物药业股份公司生产的非洲猪瘟疫苗(asfv-g-δi177l)正式获得越南农业和农村发展部批准在越南上市，该疫苗存在严重的排毒现象，对育肥猪有残留毒性，对此，我们在严防越南疫苗毒传入的同时也要制定和采取应对策略，加强对疫苗毒的检测。
2、目前商品化的试剂盒大部分为p72单一基因的pcr扩增，并不能同时满足于p72、i177l和mgf三种基因的鉴别诊断，无法快速而又准确的监测非洲猪瘟疫情的发生。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明实施例的目的在于提供一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒，本发明提供的试剂盒针对非洲猪瘟病毒的p72基因、猪β-actin基因、i177l基因和mgf基因分别设计了荧光pcr引物和探针，建立了荧光pcr检测方法，可以快速鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株，本发明的pcr引物探针组包括seq id no.1所示的p72-f、seq id no.2所示的p72-r、seq id no.3所示的p72-探针，seq id no.4所示的内参-f、seq id no.5所示的内参-r、seq id no.6所示的内参-探针，seq id no.7所示的i177l-f、seq id no.8所示的i177l-r、seq id no.9所示的i177l-探针，seq id no.10所示的mgf-f、seq id no.11所示的mgf-r、seq id no.12所示的mgf-探针。将该引物探针组制备成试剂盒，可特异的同时检测非洲猪瘟p72基因、i177l基因和mgf基因，灵敏度可达到5拷贝/μl。本试剂盒的最低检测线可达5拷贝/μl，试剂盒提供的内参避免了假阴性的出现，提供的dutp/ung防污染系统避免了气溶胶污染、防止非特异性扩增，提供的抗pcr抑制物因子确保了扩增结果的准确性。因此，本发明在避免假阳性、假阴性、防止非特异性的基础上，建立了一种新的灵敏度更高、特异性更强、稳定性更优的鉴别非洲猪瘟野毒株及多种变异株的荧光定量pcr方法。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
3、一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒，包括asfv p72基因特异引物探针、内参猪β-actin的引物探针、asfv i177l基因特异引物探针和asfv mgf基因特异引物探针。
4、(1)针对p72基因的如下引物探针：
5、p72基因正向引物：5’-tacacgttcgctgcgtatca-3’(seq id no.1)
6、p72基因反向引物：5’-tatcggtggagggaaccagt-3’(seq id no.2)
7、p72基因探针：5’-fam-catcggtaagaataggtttgc-bhq1-3’(seq id no.3)
8、所述p72引物探针的5’端标记荧光报告基团fluorophore为fam，3’端标记荧光淬灭基团quencher为bhq1。所述p72引物能灵敏且特异的检测非洲猪瘟病毒感染；
9、(2)针对内参猪β-actin基因的如下引物探针：
10、内参基因正向引物：5’-agagcaagagaggcatcctg-3’(seq id no.4)
11、内参基因反向引物：5’-cacgcagctcgttgtagaag-3’(seq id no.5)
12、内参基因探针：5’-hex-catcgagcacggcatcgtcac-bhq1-3’(seq idno.6)
13、所述内参引物探针的5’端标记荧光报告基团fluorophore为hex，3’端标记荧光淬灭基团quencher为bhq1。所述内参引物能准确监控反应体系的稳定性；
14、(3)针对i177l基因的如下引物探针：
15、i177l基因正向引物：5’-atcctagcttgccggtaatgg-3’(seq id no.7)
16、i177l基因反向引物：5’-tgccaagcttcagccactaa-3’(seq id no.8)
17、i177l基因探针：5’-rox-ttggtaccagtaacactaat-bhq2-3’(seq id no.9)
18、所述i177l引物探针的5’端标记荧光报告基团fluorophore为rox，3’端标记荧光淬灭基团quencher为bhq2。i177l引物能灵敏且特异的检测非洲猪瘟病毒感染；
19、(4)针对mgf基因的如下引物探针：
20、mgf基因正向引物：5’-gatgtcacggctcccttcaa-3’(seq id no.10)
21、mgf基因反向引物：5’-ttgtttccttcctctcccgc-3’(seq id no.11)
22、mgf基因探针：5’-cy5-taggagacgaccacatactc-bhq3-3’(seq id no.12)
23、所述mgf引物探针的5’端标记荧光报告基团fluorophore为cy5，3’端标记荧光淬灭基团quencher为bhq3。所述mgf引物能灵敏且特异的检测非洲猪瘟病毒感染。
24、作为本发明进一步的方案，所述试剂盒的荧光pcr反应体系为2×ex tag mix forqpcr 12.5μl，10μmol/l p72-f/p72-r各0.5μl，10μmol/l内参-f/内参-r各0.5μl，10μmol/li177l-f/i177l-r各0.5μl，10μmol/lmgf-f/mgf-r各0.5μl，加入3.5μl灭菌水使pcr体系为20μl，模板dna的体积为5μl，总体系为25μl。pcr反应体系中p72基因引物的浓度为0.4～0.8μm，p72基因探针的浓度为0.08～0.8μm；所述pcr反应体系中内参基因引物的浓度为0.4～0.8μm，内参基因探针的浓度为0.08～0.8μm；所述pcr反应体系中i177l基因引物的浓度为0.4～0.8μm，i177l基因探针的浓度为0.08～0.8μm；所述pcr反应体系中mgf基因引物的浓度为0.4～0.8μm，mgf基因探针的浓度为0.08～0.8μm。
25、作为本发明进一步的方案，所述试剂盒的pcr反应条件为：50℃2min，95℃预变性5min，95℃15s，60℃30s，此步采集荧光，同时采集fam、hex、rox和cy5四个通道的荧光值，共进行40个循环。
26、本发明还提供了引物探针组在制备用于鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失毒株的试剂盒中的应用；以及引物探针组在制备用于鉴别非洲猪瘟全病毒感染与非洲猪瘟基因缺失株的试剂盒中的应用。
27、本发明具有以下有益效果：
28、1、本发明可以在asfv鉴别诊断野毒感染或基因缺失毒株感染，当猪感染野毒时，p72基因、内参基因、i177l基因和mgf基因均有扩增曲线；而当猪为基因缺失毒感染时，p72基因、内参基因有扩增曲线，i177l基因或(和)mgf基因无扩增曲线。本发明采用荧光定量pcr方法，不但可以快速、简便的对猪体的感染情况进行确诊，还可以对病原进行定量分析。本发明设计的p72基因引物、i177l基因引物和mgf基因引物的最低检测限为5个拷贝数，且本发明设计的内参引物的应用可避免假阳性的产生，同时引入了dutp/ung防污染系统，可完全消除来自扩增产物的气溶胶污染，反应液中添加抗pcr抑制物因子，使本发明所提供的方法更适用于复杂的动物临床样本的检测。
29、2、本发明的非洲猪瘟病毒p72基因、i177l基因和mgf基因的荧光定量pcr检测方法与猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒均无交叉反应，结果表明，本发明具有较强的特异性。
30、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。
1.一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，包括asfv p72基因特异引物探针、内参猪β-actin的引物探针、asfv i177l基因特异引物探针和asfv mgf基因特异引物探针。
2.如权利要求1所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，其中针对asfv p72基因的如下引物探针：
3.如权利要求1所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，针对内参猪β-actin的引物和探针：
4.如权利要求1所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，针对asfv i177l基因的如下引物探针：
5.如权利要求1所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，针对mgf基因的如下引物探针：
6.如权利要求1所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，包括asfv p72基因特异引物探针、内参猪β-actin的引物探针、asfv i177l基因特异引物探针和asfv mgf基因特异引物探针。
7.如权利要求6所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，包括多重pcr反应扩增用试剂、阳性对照和阴性对照的一种或几种，所述阳性对照标准品为包含asfv p72基因核苷酸片段的重组质粒、包含内参基因核苷酸片段的重组质粒、包含asfvi177l基因片段的重组质粒和包含asfv mgf基因核苷酸片段的重组质粒；所述阴性对照为ddh2o；所述多重pcr反应扩增用试剂中含基于化学法修饰的热启动dna聚合酶、dutp/ung防污染系统、抗pcr抑制物因子。
8.如权利要求7所述的一种非洲猪瘟三重荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，pcr反应体系中p72基因引物的浓度为0.4～0.8μm，p72基因探针的浓度为0.08～0.8μm；所述内参基因引物的浓度为0.4～0.8μm，内参基因探针的浓度为0.08～0.8μm；所述pcr反应体系中i177l基因引物的浓度为0.4～0.8μm，i177l基因探针的浓度为0.08～0.8μm；所述pcr反应体系中mgf基因引物的浓度为0.4～0.8μm，mgf基因探针的浓度为0.08～0.8μm。
