本发明属于基因工程，涉及一种产异淀粉酶重组菌及其构建方法和应用。
背景技术：
1、异淀粉酶(ec 3.2.1.68)是淀粉脱支酶的一种，它可以水解糖原、支链淀粉和β-极限糊精中α-1,6糖苷键，对α-极限糊精具有部分水解作用，但不能水解普鲁兰多糖。异淀粉酶在淀粉加工工业中具有重要的应用价值，可以与糖化酶、β-淀粉酶、cgt酶、4-α-葡聚糖转移酶等淀粉酶复配生产葡萄糖、麦芽糖、环糊精、抗性淀粉等产品，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，降低其它糖化用酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。尽管异淀粉酶在工业上的应用范围越来越广，但是，迄今为止仅主要有来源于假单胞菌pseudomonas amyloderamosa的异淀粉酶实现了工业化生产。
2、中国作为全球重要的异淀粉酶市场，近年来行业供应量和需求量均呈现上升趋势。关于异淀粉酶的研究主要集中于菌株筛选、诱变改良、酶分离纯化以及酶学定性等。如有研究报道以t.fusca基因组dna为模板，通过pcr克隆得到了异淀粉酶编码基因，构建得到了产重组异淀粉酶的大肠杆菌，并优化了重组异淀粉酶摇瓶发酵产酶条件，重组菌摇瓶发酵36h胞内酶活力水平达到879.2u/ml。
3、目前关于异淀粉酶在大肠杆菌、毕赤酵母中表达的研究报道居多，但大肠杆菌并不是原则上认为安全的微生物，毕赤酵母也存在着甲醇诱导的食品安全问题和发酵时间较长的问题。地衣芽孢杆菌中虽有罕见报道，也是一种食品安全级菌株，但地衣芽孢杆菌生产异淀粉酶并没有投入实际生产应用当中。枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，具有非致病性、不产内毒素和致热致敏蛋白质的特点，作为一种食品级安全菌种，长期应用于制备发酵食品，如cn112980755a公开高效分泌异淀粉酶的基因工程菌，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主，敲除α淀粉酶的编码基因并分泌表达异淀粉酶，其中来源于枯草芽孢杆菌的糖苷水解酶家族5葡聚糖内切酶融合在异淀粉酶的n端，作为增强子促进异淀粉酶的分泌，所述异淀粉酶为来源于硫化叶菌的天然异淀粉酶或其突变体。
4、综上所述，目前已有关于生产异淀粉酶的工程菌的报道，但距进行工业化生产及应用仍有一定距离，因此，开发有效提高异淀粉酶产量以及生产高性能异淀粉酶的技术手段，对于推动异淀粉酶的应用具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种产异淀粉酶重组菌及其构建方法和应用，以期实现高效生产高性能异淀粉酶。
2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种产异淀粉酶重组菌，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为宿主，表达异淀粉酶，所述异淀粉酶还融合有信号肽，所述重组菌还缺失amye、amyl、srfc和spoiiac基因。
4、本发明中设计全新的遗传改造策略，在枯草芽孢杆菌敲除amye、amyl、srfc和spoiiac基因，同时利用信号肽介导分泌表达外源异淀粉酶，实现在枯草芽孢杆菌中高效生产异淀粉酶。
5、优选地，所述异淀粉酶的编码基因的核酸序列包括seq id no.1所示的序列。
6、优选地，所述重组菌还缺失npre、apre、nprb、epr、bpr、vpr、mpr或wpra基因中至少一种。
7、本发明中，设计特定的基因敲除策略，能够进一步提高异淀粉酶的产量。
8、本发明中，优化设计异淀粉酶的编码基因，能够进一步提高异淀粉酶的表达。
9、优选地，所述信号肽包括sacbss信号肽、ywtf信号肽或phrk信号肽中至少一种。
10、本发明中，设计使用特定的信号肽，能够进一步提高分泌表达异淀粉酶的酶活。
11、优选地，所述sacbss信号肽的编码基因的核酸序列包括seq id no.3所示的序列。
12、优选地，所述ywtf信号肽的编码基因的核酸序列包括seq id no.4所示的序列。
13、优选地，所述phrk信号肽的编码基因的核酸序列包括seq id no.5所示的序列。
14、seq id no.3：
15、atgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgcaactc aagcgtttgcgcatcatcatcatcatcat。
16、seq id no.4：
17、atggaagaacgatcacagcgcagaaagaaaaaaagaaaactaaaaaaatgggtgaaagttgttgccggattaatg gcttttttagtcattgcggcaggctctgtcggcgcctatgct。
18、seq id no.5：
19、atgaaaaaacttgtgctttgcgtatctattttagctgtgattttaagtggagtagctttaacgcaattgagtacagattcac catctaacatccaggtagctgaaaggccagtcggaggttaa。
20、可以理解，本发明针对枯草芽孢杆菌设计遗传改造策略，本领域通用枯草芽孢杆菌理论上均适用于本发明。
21、优选地，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌b.subtilis atcc 6051a。
22、第二方面，本发明提供用于在第一方面所述的产异淀粉酶重组菌中表达异淀粉酶的重组质粒，所述重组质粒含有启动子、信号肽编码序列、异淀粉酶编码基因和终止序列，其中信号肽编码序列和异淀粉酶编码基因融合在一个开放读码框中，并且与启动子序列操作性连接。
23、优选地，所述重组质粒的出发质粒包括phy300-plk质粒。
24、优选地，所述启动子包括木糖异构酶启动子。
25、优选地，所述木糖异构酶启动子的核酸序列包括seq id no.6所示的序列。
26、seq id no.6：
27、ttaaaatctctcattcataaaccgttccagaaaatgcccgatcaccagggaggacatgccgagcgatgaggcagtgcggccaagtgaggagattttcaaatgataattagacaaggcttctgcagcacttcttgaggcaatcgtttttttaatcgcatcgacgatgatcggataggattccacaatggtattccgcaagataatcgtatcgggattcaacgtcttcaagatgttgagaagtccgatgccgatatgaaaaccgaatctttcaaacgtctccatcatccccggatcactgcggtctgcaagttctttaacggtttcgtaaagcgaggcttcggaattcgctccatagtgagagaagacggctttttccgaagcgtaaagctcccagcagcctctattcccgcaccggcacaatgggccgtcaaagtgaatggacatgtgcccggcttctccggaaaaaccttgcacacctctaaacagttttccattcattgaaatccttaaaccaatcccggtattaatgctgacaaacacggcatgctccagctgtccggcttctccgtatttcttctcgccaacggcgccggcgtttgcttcgttttcaattaaaatgggaacgccgaacctttcttccagtttttcctttaacggaatcaaatggattggcttatttggcgtaaacaccacctgccgttcgttgtctaccaagccgggtacgcaaacgccgattccggtcaatccgtatggggaaggcggtattttgtcaacggctagccctgtcaattcgattaatgcctcttctgtcgcctgaatgtcttcttcatccagcgtccgttcgaattgttcaatcaaatgcccttcaagatcggttaacacaacaatcagataattggttccgatatctataccgaccgcatagccggcttttcgattgaatttcagcatcacgggcctcctgccgccgcttgactcgccggggccggtttcataaatgatgtccttttgaagcaaggaagatacttgggaggaaacggtcgctttatttaatcccgttatttccgaaagttttgctcttgaaatgggtgcgttctcaataatctgctcaagaatcagagctttgttcattttttttacaagggcttgatccgctgtattcaatgtcaatcactccattgttttgaagctgtgaatttattatagtataacaaatttagaaaactcaattttttccttcgtttccattgaaagcggttgattcatcttgtaaaataaatacaaggaagttagttta。
28、第三方面，本发明提供第一方面所述的产异淀粉酶重组菌的构建方法，所述构建方法包括：
29、以枯草芽孢杆菌为宿主，敲除其中amye、amyl、srfc和spoiiac基因，并导入第二方面所述的重组质粒，得到产异淀粉酶重组菌。
30、优选地，还敲除npre、apre、nprb、epr、bpr、vpr、mpr或wpra基因中至少一种。
31、可以理解，本领域通用的基因敲除，载体构建以及转导的方法均适用于本发明，能实现本发明遗传改造策略即可。
32、第四方面，本发明提供第一方面所述的产异淀粉酶重组菌在生产异淀粉酶中的应用。
33、本发明中，设计构建产异淀粉酶重组菌，实现高效生产耐高温异淀粉酶，具有广阔的应用前景，如用于生产β-环糊精等，提高相关生产转化率，降低生产成本。
34、第五方面，本发明提供一种生产异淀粉酶的方法，所述方法包括：
35、发酵培养第一方面所述的产异淀粉酶重组菌，进行产物纯化，得到异淀粉酶。
36、可以理解，本领域通用的适合菌株分泌异淀粉酶的培养方法以及产物纯化方法均适用本发明。
37、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
38、本发明基于枯草芽孢杆菌，设计全新的遗传改造策略，在枯草芽孢杆菌敲除amye、amyl、srfc和spoiiac基因，同时利用信号肽介导分泌表达外源异淀粉酶，实现在枯草芽孢杆菌中高效生产异淀粉酶；此外，通过对异淀粉酶编码基因进行优化以及设计特定的信号肽，能够进一步提高异淀粉酶的表达，摇瓶发酵培养胞外酶活可达24.3u·ml-1以上，如56.2u·ml-1，为异淀粉酶的放大生产奠定了基础。
1.一种产异淀粉酶重组菌，其特征在于，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为宿主，表达异淀粉酶，所述异淀粉酶还融合有信号肽，所述重组菌缺失amye、amyl、srfc和spoiiac基因。
2.根据权利要求1所述的产异淀粉酶重组菌，其特征在于，所述异淀粉酶的编码基因的核酸序列包括seq id no.1所示的序列；
3.根据权利要求1或2所述的产异淀粉酶重组菌，其特征在于，所述信号肽包括sacbss信号肽、ywtf信号肽或phrk信号肽中至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的产异淀粉酶重组菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌b.subtilis atcc 6051a。
5.用于在权利要求1-4任一项所述的产异淀粉酶重组菌中表达异淀粉酶的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有启动子、信号肽编码序列、异淀粉酶编码基因和终止序列，其中信号肽编码序列和异淀粉酶编码基因融合在一个开放读码框中，并且与启动子序列操作性连接。
6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的出发质粒包括phy300-plk质粒。
7.根据权利要求5或6所述的重组质粒，其特征在于，所述启动子包括木糖异构酶启动子。
8.一种权利要求1-4任一项所述的产异淀粉酶重组菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
9.权利要求1-4任一项所述的产异淀粉酶重组菌在生产异淀粉酶中的应用。
10.一种生产异淀粉酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
