本发明涉及遗传工程，特别涉及一种香榧tgbmy基因的克隆方法及提高果实果糖含量的应用。
背景技术：
1、香榧为红豆杉科榧属多年生常绿乔木，主要分布在亚热带丘陵地区，是我国特有的经济树种。其种实一般呈椭圆形、卵圆形或倒卵形，含有丰富的脂肪、蛋白质、维生素和少量糖类等营养成分。淀粉是植物体内贮藏的高分子碳水化合物，在果实发育过程中作为碳同化物的一种过渡形式，贮存于活细胞内有生活力的叶绿体或质体中，其合成及降解代谢与果实发育密切相关。但目前尚无报道有调控相关基因以实现香榧种实淀粉的分解和/或合成。
技术实现思路
1、本发明的目的在于，提供一种香榧tgbmy基因的克隆方法及提高果实果糖含量的应用。本发明在香榧中发现的tgbmy基因可以直接调控淀粉分解途径，可以提高果实果糖含量。
2、本发明的技术方案：一种香榧tgbmy基因，该基因的核苷酸序列如序列表中seq idno.1所示。
3、一种香榧tgbmy基因的克隆方法，首先从鲜活的香榧植物中提取总rna；然后利用反转录试剂盒进行反转录，合成第一链cdna；而后以合成的第一链cdna为模板，利用引物进行pcr扩增；将pcr产物pcr产物连接载体，然后转化筛选载体，最后进行测序，获得tgbmy基因；
4、所述引物序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
5、上述的香榧tgbmy基因的克隆方法，所述香榧植物提取总rna的部位包括根、茎、叶和/或种实，提取后将材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用；所述香榧植物总rna提取采用vazyme公司试剂盒。
6、前述的香榧tgbmy基因的克隆方法，所述pcr扩增的条件如下：95℃下预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，72℃彻底延伸5min，35个循环。
7、前述的香榧tgbmy基因的克隆方法，在pcr扩增结束后，将反应液进行琼脂糖凝胶电泳，比对dnamarker割下对应大小条带，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收；线性化载体与得到的目的序列片段在一步克隆试剂盒体系下进行连接；连接完成后，加入到大肠杆菌感受态dh5α中转化，扩繁并在含抗性平板上筛选获得阳性克隆；使用2×rapid taqmaster mix高效率扩增酶对菌液进行菌检pcr，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序。
8、前述的香榧tgbmy基因的克隆方法，所示菌检pcr的条件如下：95℃下预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，72℃彻底延伸5min，35个循环。
9、前述的香榧tgbmy基因的克隆方法，所述克隆方法还包括目的基因质粒及空载体转化农杆菌感受态细胞，步骤如下：
10、步骤1.1、取储存于-80℃超低温冰箱的农杆菌gv3101感受态于冰上至半融化状态；
11、步骤1.2、使用移液枪吸取3-5μl质粒加gv3101感受态中，轻柔混匀；
12、步骤1.3、冰上静置5min，将感受态细胞立即放入液氮中5min，再立即置于37℃水浴锅水浴5min，然后放至于冰上静置5min；
13、步骤1.4、在超净台中向感受态细胞中加入400μl无抗lb液体，放置到28℃摇床中，培养2-3h；
14、步骤1.5、在超净台用移液枪吸取100-200μl培养后的菌液于卡那抗性与利福平抗性lb平板表面，涂布均匀，吹干，封口膜封闭后至28℃恒温培养箱培养24h；
15、步骤1.6、从菌板上分别挑取5个单独菌落放置到含有400μl卡那抗性与利福平抗性lb灭菌的1.5ml离心管中，置于28℃摇床培养12h以上；
16、步骤1.7、将培养起来的菌液作为模版，进行pcr反应，将产物于1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，选取产物条带大小符合预期的菌液样品进行标记。
17、前述的香榧tgbmy基因的克隆方法，所述克隆方法还包括亚细胞定位；所述亚细胞定位的过程是将构建好的目的基因载体与带相应marker基因载体的农杆菌各吸取100μl分别接菌到4ml含有卡那抗性与利福平抗性lb中，于28℃摇床，转速200rpm培养至od600为0.6；室温下，在6000rpm的转速下离心菌液6min，将得到的菌液沉淀用同体积的溶液重悬；将上述重悬液室温进行暗处理并静置2小时后，用1ml无菌注射器注射到培养45天的本氏烟草叶片背面，继续培养72h。
18、前述的香榧tgbmy基因的克隆方法，所述克隆方法还包括瞬时表达香榧自身转基因；所述瞬时表达香榧自身转基因的过程是取阳性单克隆农杆菌及空载体菌液于100ml含卡那利福平培养基中，28℃摇床过夜培养，使培养液od600的数值于0.8-1.0之间。将菌液在6000rpm转速下，离心8min，倒上清，加入适量重悬液悬浮农杆菌，然后将悬浮好的菌液注射到香榧种实中。
19、一种香榧tgbmy基因在提高果实果糖含量中的应用。
20、与现有技术相比，本发明在香榧中发现的tgbmy基因在糖代谢过程中对香榧种实淀粉的分解和/或合成具有调控作用，进而可以通过该基因的调控来实现提高果实果糖含量的效果。本发明为阐明香榧种实发育机制奠定基础，同时为提高种实品质、开展良种选育等提供理论支撑。
1.一种香榧tgbmy基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示。
2.一种如权利要求1所述的香榧tgbmy基因的克隆方法，其特征在于：首先从鲜活的香榧植物中提取总rna；然后利用反转录试剂盒进行反转录，合成第一链cdna；而后以合成的第一链cdna为模板，利用引物进行pcr扩增；将pcr产物pcr产物连接载体，然后转化筛选载体，最后进行测序，获得tgbmy基因；
3.根据权利要求2所述的香榧tgbmy基因的克隆方法，其特征在于：所述香榧植物提取总rna的部位包括根、茎、叶和/或种实，提取后将材料迅速投入液氮中冷冻，保存于-80℃冰箱备用；所述香榧植物总rna提取采用vazyme公司试剂盒。
4.根据权利要求2所述的香榧tgbmy基因的克隆方法，其特征在于：所述pcr扩增的条件如下：95℃下预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，72℃彻底延伸5min，35个循环。
5.根据权利要求1所述的香榧tgbmy基因的克隆方法，其特征在于：在pcr扩增结束后，将反应液进行琼脂糖凝胶电泳，比对dnamarker割下对应大小条带，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收；线性化载体与得到的目的序列片段在一步克隆试剂盒体系下进行连接；连接完成后，加入到大肠杆菌感受态dh5α中转化，扩繁并在含抗性平板上筛选获得阳性克隆；使用2×rapid taq master mix高效率扩增酶对菌液进行菌检pcr，送含有目的基因片段大小条带的菌液测序。
6.根据权利要求5所述的香榧tgbmy基因的克隆方法，其特征在于：所示菌检pcr的条件如下：95℃下预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，72℃彻底延伸5min，35个循环。
7.根据权利要求2所述的香榧tgbmy基因的克隆方法，其特征在于：所述克隆方法还包括目的基因质粒及空载体转化农杆菌感受态细胞，步骤如下：
8.根据权利要求7所述的香榧tgbmy基因的克隆方法，其特征在于：所述克隆方法还包括亚细胞定位；所述亚细胞定位的过程是将构建好的目的基因载体与带相应marker基因载体的农杆菌各吸取100μl分别接菌到4ml含有卡那抗性与利福平抗性lb中，于28℃摇床，转速200rpm培养至od600为0.6；室温下，在6000rpm的转速下离心菌液6min，将得到的菌液沉淀用同体积的溶液重悬；将上述重悬液室温进行暗处理并静置2小时后，用1ml无菌注射器注射到培养45天的本氏烟草叶片背面，继续培养72h。
9.根据权利要求8所述的香榧tgbmy基因的克隆方法，其特征在于：所述克隆方法还包括瞬时表达香榧自身转基因；所述瞬时表达香榧自身转基因的过程是取阳性单克隆农杆菌及空载体菌液于100ml含卡那利福平培养基中，28℃摇床过夜培养，使培养液od600的数值于0.8-1.0之间。将菌液在6000rpm转速下，离心8min，倒上清，加入适量重悬液悬浮农杆菌，然后将悬浮好的菌液注射到香榧种实中。
10.一种香榧tgbmy基因在提高果实果糖含量中的应用。
