本申请涉及生物制剂的，具体涉及一种病毒冻干保护剂、乙型脑炎病毒冻干制剂及其制备方法。
背景技术：
1、乙型脑炎病毒(japanese encephalitis virus，简称jev)简称乙脑病毒，是流行性乙型脑炎的病原病毒，当人体感染乙型脑炎病毒后，病毒会在血管内皮细胞、淋巴结、肝、脾等吞噬细胞内增殖，并经血液循环到达脑部，从而引起脑膜及脑组织发炎，神经元细胞变性坏死、脑组织软化等疾病。
2、目前，接种乙型脑炎灭活疫苗是预防乙脑病毒感染的主要手段。在乙型脑炎灭活疫苗生产过程中，乙脑病毒毒株的主要保存方式为液体冷冻保存，即通过将乙脑病毒毒株与保护剂混合并置于低温设备中长期保存，上述方法虽然能够保证乙脑病毒的活性与感染性，但该方法需要长期使用专门的低温设备，如超低温冰箱或液氮罐，因此保存成本较高；此外，利用上述液体冷冻保存方法保存乙脑病毒1年时，乙脑病毒的滴度会出现明显下降趋势，无法满足2年或2年以上的保存要求。
3、因此，降低乙脑病毒的保存成本、延长乙脑病毒的保存时间成为目前的主要研究方向。
技术实现思路
1、为了克服现有技术存在的乙脑病毒保存成本高、保存时间短、乙脑病毒滴度下降等问题，本申请提供一种病毒冻干保护剂、乙型脑炎病毒冻干制剂及其制备方法。
2、第一方面，本申请提供一种病毒冻干保护剂，采用如下的技术方案：
3、一种病毒冻干保护剂，包括以下含量的组分：脱脂牛奶1-5％、山梨醇5-10％、精氨酸0.2-1.2％、谷氨酸钠0.4-1.2％和聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮0.1-0.8％，余量为水。
4、本申请利用脱脂牛奶、氨基酸类物质和聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮等制备出一种病毒冻干保护剂，其中，脱脂牛奶一方面属于大分子物质，其能够在冻干过程中形成冻干支架，这种构架能增强对病毒的保护作用；另一方面，脱脂牛奶能够形成弱玻璃，对冻干过程中的病毒有很好的保护作用。谷氨酸钠、精氨酸可以抑制体系ph的微小改变，从而阻止蛋白质变性。山梨醇具有多个羟基，在冻干过程中可取代水分子与细胞膜磷脂中的磷酸基团或与蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮能够与病毒颗粒的特定部位结合，稳定病毒的构象，防止冻干过程中病毒发生不可逆的构象变化；而且聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮还能够在细胞病毒表面形成保护层，避免病毒在冻干过程中的损伤，保持病毒的完整性和活性；此外，在乙型脑炎病毒冻干制剂在重新水化的过程中，聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮能够快速吸收和保持水分，为病毒提供湿润的环境，帮助病毒快速恢复其感染性与活性。因此，本申请提供的病毒冻干保护剂通过在病毒颗粒表面形成保护层、稳定ph环境、氢键结合及维持病毒构象等等方面共同作用于病毒的冻干过程，保证病毒在冻干后能够保持其完整性、感染性及活性。
5、可选地，所述病毒冻干保护剂包括以下含量的组分：脱脂牛奶2-4％、山梨醇5-10％、精氨酸0.2-1.2％、谷氨酸钠0.4-1.2％和聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮0.2-0.6％，余量为水。
6、在一些实施方案中，所述脱脂牛奶的重量份可以为1-2份、1-3份、1-4份、1-5份、2-3份、2-4份、2-5份、3-4份、3-5份或4-5份。
7、在一个具体的实施方式中，所述脱脂牛奶的重量份还可以为1份、2份、3份、4份
8、或5份。
9、在一些实施方案中，所述聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的重量份可以为0.1-0.2份、1-0.4份、0.1-0.6份、0.1-0.8份、0.2-0.4份、0.2-0.6份、0.2-0.8份、0.4-0.6份、0.4-0.8份或0.6-0.8份。
10、在一个具体的实施方式中，所述聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的重量份还可以为0.1份、0.2份、0.4份、0.6份或0.8份。
11、可选地，所述病毒冻干保护剂包括以下含量的组分：脱脂牛奶3％、山梨醇5％、精氨酸1％、谷氨酸钠1％和聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮0.4％，余量为水。
12、可选地，所述聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的分子量为8k-20k g/mol。
13、在一些实施方案中，所述聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的分子量可以为8k-10k g/mol、、8-15kg/mol、8-18kg/mol、8-20kg/mol、10-15kg/mol、10-18kg/mol、10-20kg/mol、15-18kg/mol、15-20kg/mol或18-20kg/mol。
14、在一个具体的实施方式中，所述聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的分子量还可以为8kg/mol、10kg/mol、15kg/mol、18kg/mol或20kg/mol。
15、可选地，所述聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的分子量为10k-18k g/mol。
16、本申请中，聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的分子量会影响病毒冻干保护剂对乙脑病毒的保0护效果。通过实验探究发现，进一步将聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的分子量控制在上述范围内，获得的病毒冻干保护剂对乙脑病毒的保护作用更好，乙脑病毒在冻干前后的滴度基本无变化。
17、可选地，所述聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮中，乳酸与n-乙烯基吡咯烷酮的摩尔比为(65-75)：(25-35)。
18、第二方面，本申请提供的病毒冻干保护剂在制备病毒冻干产品中的应用。
19、第三方面，本申请提供一种包含乙型脑炎病毒和病毒冻干保护剂的乙型脑炎病毒冻干制剂。
20、可选地，所述乙型脑炎病毒冻干制剂的制备方法，包括以下步骤：将乙型脑炎病毒收获液与病毒冻干保护剂按照4：(0.8-1.2)的体积比混合，经真空冷冻干燥，获得乙型脑炎病毒冻干制剂。
21、可选地，所述真空冷冻干燥的程序为：首先在-42±5℃下预冻200-250min，接着在120min内将温度升高至-3±2℃，在上述温度下一次恒温干燥13-15h；然后在190min内将温度升高至28±2℃，并在上述温度下二次恒温干燥8-9h。
22、综上所述，本申请具有以下有益效果：
23、1.本申请利用脱脂牛奶、氨基酸类物质和聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮等制备出一种病毒冻干保护剂，该病毒冻干保护剂通过在病毒颗粒表面形成保护层、稳定ph环境、氢键结合及维持病毒构象等等方面共同作用于病毒的冻干过程，保证病毒在冻干后能够保持其完整性、感染性及活性。
24、2.本申请进一步采用分子量为10-18k的聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮来制备病毒冻干保护剂，并通过将聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的添加量控制在0.2-0.6份范围内，获得的病毒冻干保护剂对乙脑病毒的保护作用更好，乙脑病毒在冻干前后的滴度基本无变化。
1.一种病毒冻干保护剂，其特征在于，包括以下含量的组分：脱脂牛奶1-5%、山梨醇5-10%、精氨酸0.2-1.2%、谷氨酸钠0.4-1.2%和聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮0.1-0.8%，余量为水。
2.根据权利要求1所述的病毒冻干保护剂，其特征在于，包括以下含量的组分：脱脂牛奶2-4%、山梨醇5-10%、精氨酸0.2-1.2%、谷氨酸钠0.4-1.2%和聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮0.2-0.6%，余量为水。
3.根据权利要求1所述的病毒冻干保护剂，其特征在于，包括以下含量的组分：脱脂牛奶3%、山梨醇5%、精氨酸1%、谷氨酸钠1%和聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮0.4%，余量为水。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的病毒冻干保护剂，其特征在于，所述聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的分子量为8k-20k g/mol。
5.根据权利要求1所述的 病毒冻干保护剂，其特征在于，所述聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮的分子量为10k-18k g/mol。
6.根据权利要求1所述的病毒冻干保护剂，其特征在于，所述聚乳酸-聚乙烯基吡咯烷酮中，乳酸与n-乙烯基吡咯烷酮的摩尔比为（65-75）：（25-35）。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的病毒冻干保护剂在制备病毒冻干产品中的应用。
8.一种乙型脑炎病毒冻干制剂，其特征在于，包含乙型脑炎病毒及权利要求1-6中任一项所述的病毒冻干保护剂。
9.如权利要求8所述的乙型脑炎病毒冻干制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将乙型脑炎病毒收获液与病毒冻干保护剂按照4：（0.8-1.2）的体积比混合，经真空冷冻干燥，获得乙型脑炎病毒冻干制剂。
10.根据权利要求9所述的乙型脑炎病毒冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥的程序为：首先在-42±5℃下预冻200-250min，接着在120min内将温度升高至-3±2℃，在上述温度下一次恒温干燥13-15h；然后在190min内将温度升高至28±2℃，并在上述温度下二次恒温干燥8-9h。
