本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗angptl3人源化单抗稳转株及其应用。
背景技术：
1、血管生成素样蛋白3(angiopoietin-like protein-3，angptl3)是1999年由conklin等首次提出，其属于血管紧张素样蛋白家族中的一员，该蛋白家族因其结构与血管紧张素相似而得名。angptl基因家族编码一类分泌性蛋白，即angptl1～8，它们具有相似的结构且一系列研究证实部分成员在血脂代谢中发挥重要作用(mattijssen f,kersten s,regulation of triglyceride metabolism byangiopoietin-like proteins,biochimbiophys acta,2012,1821(5):782-789.)。angptl3是一种具有独特信号肽分子结构的序列，较多研究证实其主要表达在肝细胞，是脂蛋白代谢的关键调节因子，抑制脂蛋白脂肪酶、内皮脂肪酶的活性(kersten s.angptl3 as therapeutie target[j].curr opin li-pidal,2021.32(6):335-341.)，显著性增加血清极低密度脂蛋白的表达水平，最终导致甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)的分解明显减少，血脂水平明显升高，进而引起胰岛素抵抗、血管生成紊乱。angptl3参与多种代谢相关性疾病发生发展过程，已被研究人员认为是调控机体内血脂生理代谢过程中的关键因子(kersten s.angiopoietin-like 3in lipoproteinmetabalism[j].nat rev enlocrinol,2017,13(12):731；graham mj,lee rg,branit ta,etal.candiovascular andmetabolie eleets of angptl3 antisense oligonueleolides[j].engi jmed,2017,377(3):222；xu yx,redon v,yu h,et al.role ofangiopoietin-like 3(angptl3)in regulating plasa level of low-densitylipoproteincholesderol[j].atherasclensis,2018,58(268):196.)。angptl3异常高表达会增加血浆血脂水平，进一步诱导泡沫细胞的形成和血管平滑肌细胞的增殖和迁移，从而导致动脉粥样硬化(sun t,zhan w,wel l,et al.cireulating angptl3 andangptl4levels prediet cornary artery atheraselerasis severily[j].lipids healthdis.2021.20(1):154-162.)。
2、目前为止，三类angptl3抑制剂药物在开发中，分别是单抗、反义寡核苷酸(aso)和crispr/cas9基因编辑，它们可促进vldl的水解。evinacumab是再生元制药公司研发的一种全人源靶向angptl3的igg4亚型的的单克隆抗体，当与其他降脂疗法联合使用时，可将家族性高胆固醇血症患者中危险的高胆固醇水平降至正常水平，于2021年2月11日由fda批准上市，用于治疗12岁及以上儿童或成人家族性纯合子高胆固醇血症患者(张月，李玥，王丽，等.angptl3与动脉粥样硬化[j].中国医药生物技术,2022,17(02):158-163.)。目前，礼来公司研发靶向angptl3/8的单克隆抗体ly3475766正处于i期临床试验阶段，可显著降低血脂异常病人血浆中的tg和残存胆固醇含量。靶向angptl4的药物主要有再生元开发的单克隆抗体regn-1001和lexicon医药开发的14d12单抗，均用于降血脂。另外，还有一些开发靶向angptl3的创新疗法的药物，比如辉瑞作为angptl3的反义寡核苷酸的vupanorsen，该药物能够通过抑制angptl3合成，提高脂蛋白脂肪酶(lpl)的活性，从而降低富含tg脂蛋白(trl)水平。
3、随着生物药物的发展，各种重组蛋白表达平台也在发展，其中cho细胞是表达重组蛋白(特别是融合蛋白和基因工程抗体)最常用的宿主之一(haimanti dorai,subinayganguly.mammalian cell-produced therapeutic proteins:heterogeneity derivedfrom protein degradation[j].curr opin biotechnol,2014,30:198-204；wuest dm,harcum sw,lee kh.genomics in mammalian cell culture bioprocessing[j].biotechnoladv,2012,30(3)629-638.)，而重组蛋白基因在宿主细胞内的高效表达，最关键的步骤便是基因的转染。目前常用的转染方法主要有电转染、脂质体转染、显微注射法、磷酸钙共沉淀法等(王月丽，魏继楼，程红蕾，等.外源基因转染细胞技术的研究进展[j].现代生物医学进展,2014,14(7):1382-138)。既往抗angptl3人源化单抗的表达依靠瞬时转染技术，需要每次抽提和转染质粒流程繁杂且表达量不稳定，不利于大规模工业化生产。而电转染法相比其他转染技术，具有操作简便、重复性好和转染效率高等优点，电转染几乎适用于所有细胞，但是不同的电转染条件，会导致外源基因的转染效率不同，即便在最优条件下转染相同细胞，不同的外源基因，转染效率也会有所差别(邓晓芬，杨晓佳，易天红，等.融合蛋白基因与抗体基因电转染cho-s细胞的条件摸索优化[j].生物技术通报,2019,35(04):223-228.)。
技术实现思路
1、本技术通过电转染将抗angptl3人源化单抗表达载体引入宿主细胞，经过多次筛选最终筛选出一系列高表达量和稳定可控的细胞株，据此完成了本发明。
2、第一方面，本发明提供一株杂交瘤细胞，所述细胞可以稳定表达抗angptl3人源化单抗，所述细胞名称为：抗angptl3人源化单抗稳转细胞株(fd36-a44)，保藏号为：cgmccno.46049，向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)提供了生物保藏。
3、第二方面，本发明提供一种筛选稳定表达抗angptl3人源化单抗的细胞的方法，所述筛选方法包括如下步骤：
4、s1.根据抗angptl3人源化单抗序列设计引物，并以此基因组为模板，扩增获得angptl3基因片段，将angptl3基因片段克隆至载体，获得重组质粒pks001-fd36；
5、s2.将s1所得重组质粒与宿主细胞混合后转染，将转染后的细胞置于a培养基中培养，两天后稀释至b培养基；
6、s3.利用无谷氨酰胺组份的培养基和msx进行表达抗angptl3人源化单抗细胞株的筛选，最终筛选出本发明所述高表达和稳定可控的抗angptl3人源化单抗的细胞株。
7、进一步，在步骤s1中，所述抗angptl3人源化单抗的序列为其氨基酸序列。
8、更进一步，所述抗angptl3人源化单抗的重链氨基酸序列如seq id no：1所示，轻链氨基酸序列如seq id no：2所示。
9、进一步，在步骤s1中，所述引物是将抗angptl3人源化单抗的氨基酸序列转化为对应核苷酸序列后设计的。
10、进一步，在步骤s1中，所述克隆方式为in-fusion技术。
11、进一步，在步骤s2中，所述宿主细胞是真核细胞。
12、优选的，所述宿主细胞为cho-k1q。
13、进一步，在步骤s2中，所述a培养基为cho cd02+谷氨酰胺培养基，所述b培养基为cho cd02+蛋氨酸亚砜酰亚胺培养基。
14、进一步，在步骤s3中，所述筛选方法包括无gln培养筛选、msx加压筛选、批培养筛选、摇瓶流加工艺筛选和二次亚克隆筛选五个步骤。
15、第三方面，本发明提供一种angptl3人源化单抗，所述单抗由第一方面所述杂交瘤细胞分泌。
16、第四方面，本发明提供一种抗体偶联物，所述偶联物包含第三方面所述单抗。
17、第五方面，本发明提供第三方面所述单抗在制备检测angptl3的试剂中的应用。
18、第六方面，本发明提供一种检测angptl3的试剂盒，所述试剂盒包含第三方面所述单抗。
19、进一步，所述试剂盒可以为elisa检测试剂盒、胶体金检测试剂盒、免疫组化试剂盒、免疫荧光试剂盒和/或原位杂交染色试剂盒中的一种或多种。
20、更进一步，所述试剂盒诊断方法包括直接法、间接法、双抗夹心法和/或竞争法中的一种或多种。
21、第七方面，本发明提供第三方面所述单抗或第四方面所述抗体偶联物在制备预防和/或治疗肾脏病或代谢相关性疾病的药物中的应用。
22、进一步，所述肾脏病包括但不限于伴随蛋白尿及足细胞损伤的各类肾脏疾病如微小病变、局灶节段肾小球硬化、糖尿病肾病、iga肾病、过敏性紫癜性肾病和狼疮性肾病等。
23、进一步，所述代谢相关性疾病包括但不限于糖尿病以及高胆固醇血症和高甘油三酯血症等血脂代谢异常疾病。
24、本发明中的高表达量和稳定可控的细胞株，名称为：抗angptl3人源化单抗稳转细胞株(fd36-a44)，保藏号为：cgmcc no.46049，已于2024年9月23日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)提供了生物保藏，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
25、有益效果
26、本发明制备了一系列表达抗angptl3人源化单抗的细胞，进而筛选出一株具有高表达量和稳定可控优势的抗angptl3人源化单抗细胞株。
1.一株杂交瘤细胞，所述细胞可以稳定表达抗angptl3人源化单抗，所述细胞名称为：抗angptl3人源化单抗稳转细胞株(fd36-a44)，保藏号为：cgmcc no.46049，已向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)提供了生物保藏。
2.一种筛选稳定表达抗angptl3人源化单抗的细胞的方法，所述筛选方法包括如下步骤：
3.如权利要求2所述筛选方法，在步骤s1中，所述抗angptl3人源化单抗的序列为其氨基酸序列；所述抗angptl3人源化单抗的重链氨基酸序列如seq id no：1所示，轻链氨基酸序列如seq id no：2所示；所述引物是将抗angptl3人源化单抗的氨基酸序列转化为对应核苷酸序列后设计的；
4.一种angptl3人源化单抗，所述单抗由权利要求1所述杂交瘤细胞分泌。
5.一种抗体偶联物，所述偶联物包含权利要求3所述单抗。
6.权利要求3所述单抗在制备检测angptl3的试剂中的应用。
7.一种检测angptl3的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求3所述单抗。
8.如权利要求7所述试剂盒，所述试剂盒可以为elisa检测试剂盒、胶体金检测试剂盒、免疫组化试剂盒、免疫荧光试剂盒和/或原位杂交染色试剂盒中的一种或多种。
9.权利要求3所述单抗或权利要求4所述抗体偶联物在制备预防和/或治疗肾脏病或代谢相关性疾病的药物中的应用。
10.如权利要求9所述应用，所述肾脏病包括但不限于伴随蛋白尿及足细胞损伤的各类肾脏疾病如微小病变、局灶节段肾小球硬化、糖尿病肾病、iga肾病、过敏性紫癜性肾病和狼疮性肾病等；所述代谢相关性疾病包括但不限于糖尿病以及高胆固醇血症和高甘油三酯血症等血脂代谢异常疾病。
