本发明涉及分段核酸，它们的合成及作为治疗性成分的用途。每个分段核酸包括至少两个通过非核苷酸连接子连接在一起的片段，并可选地与其他分子结合以提高药物性能，如细胞选择性递送。特别地，本披露涉及分段核酸和分段核酸缀合物，它们与rna指导的基因编辑蛋白(如crispr cas9、ncas9、dcas9、融合蛋白、其他class 2crispr核酸内切酶和adar)的rnp复合物，以及它们作为治疗剂用于疾病治疗的用途。
背景技术：
1、天然核酸是由通过磷酸二酯键连接的核苷酸组成的聚合物。已知并非所有磷酸二酯键都是核酸生物功能所必需的。一个极端的例子是肽核酸，它是通过酰胺偶联合成的。长寡核苷酸具有多种应用，包括作为治疗性核酸的用途，mrna疫苗(以covid-19疫苗为著名例子)，以及基因编辑中的grna，但长rna的合成、纯化和分析表征一直具有挑战性。
2、我们公开了用于功能性长核酸的非核苷酸连接子。特别是，这些连接子可以替代grna中crrna和tracrrna之间的四核苷酸环和与cas9无相互作用的核苷酸，从而生成化学连接的功能性grna(lgrna)。这不仅使任何长grna的制造变得具有成本效益，还能够获得高质量验证的全长产品，在关键间隔段的合成错误比sgrna少得多，并且能够进行各种化学修饰以提高功效和选择性、稳定性、通过分子标记进行靶向递送等。关键间隔段的合成错误会导致额外的向导依赖性脱靶切割。三唑已被巧妙地引入核酶，并且报道的产物具有生物活性。结合三唑连接子的dna已知为dna合成的有效模板。因此，分段核酸是重要的核酸类似物家族。
3、这些分段核酸的合成是会聚的，因此非常高效；然而，迄今为止，具有两个或两个以上非核苷酸连接子的分段核酸的高效合成仍然缺乏。
4、在申请人之后，其他几个实验室报道了由一个非核苷酸接头连接的grna。在这些例子中，片段是通过合成后修饰制备的。具有两个非核苷酸接头的grna的例子很少。在申请人之后，park等人报道了dna模板化的sgrna双击合成，没有报道产量，并且，所用片段的分子间和分子内点击副反应产生了几种副产物，如他们的凝胶图像所示(park等人2022年的图3c)。由于亚磷酰胺与叠氮化物溶液中发生反应(staudinger反应)，因此在这些例子中是通过耗时的后合成方案引入的叠氮化物功能团(zhong 2015；taemaitree等人2019；park等人2022)。5’-叠氮基是通过合成后，依次转化5’-oh为5’-碘基，再叠氮取代而引入的，而3’-叠氮基则是通过nhs化学反应在溶液中脱保护的寡核苷酸上引入的。因为它在下游反应中不稳定，5’-碘基的完整性很难保持。
5、此外，长核酸形成各种二级结构，只有其中一些结构可以结合诸如rna指导的核酸内切酶等蛋白质，形成完全功能的rna-蛋白(rnp)复合物。这也导致了在分离/纯化和分析表征中的巨大挑战。
6、本发明涉及化学连接的核酸，包括向导rna寡核苷酸(lgrna)，并公开了一种高效的化学方法，用于制备具有两个或两个以上非核苷酸连接子的分段核酸。
7、此外，本发明涉及非核苷酸接头的应用，通过改变其二级结构的发布和/或引入包括氢键在内的额外分子相互作用来增强或调节所得核酸的功能。
8、本发明进一步涉及分段核酸和分段核酸缀合物作为基因编辑组合物成分的用途，特别是用于疾病治疗的用途。
技术实现思路
1、本发明涉及分段核酸，它们的合成及其作为治疗剂成分的用途。每个分段核酸包含两个或多个通过非核苷酸连接子连接在一起的片段，并可选择性地与其他分子缀合以改善药物特性，如细胞选择性递送。
2、本发明的一个方面涉及生产化学连接的分段核酸的方法。
3、在某些方面，本发明提供了通过化学连接形成的非核苷酸连接子的分段核酸，并且这些非核苷酸连接子对所得核酸功能几乎没有或没有影响。
4、在某些方面，本发明提供了通过化学连接形成的非核苷酸连接子的分段核酸，并且非核苷酸连接子通过改变二级结构的分布和/或引入额外的分子相互作用(包括氢键)来增强所得核酸的功能。
5、在某些方面，本发明涉及通过改变二级结构的分布和/或引入额外的分子相互作用(包括氢键)来增强lgrnas功能的非核苷酸连接子的应用。
6、在某些方面，本发明提供了通过化学连接形成的非核苷酸连接子的分段核酸，并且非核苷酸连接子具有一个或多个用于对所得核酸功能进行时间控制和/或细胞选择性调控的化学基团。这些化学基团包括光可切割功能、二硫键以及在特定细胞和某些细胞微环境中可切割的功能。
7、在某些方面，本发明涉及化学连接的核酸，包括向导rna寡核苷酸(lgrna)，并公开了一种用于制备具有两个非核苷酸连接子的分段核酸的高效化学方法。
8、在某些方面，本发明提供了生产核酸分子的方法，包括：(a)分别合成三个或更多配备有用于一次性正交或顺序化学连接的化学功能的核酸片段，(b)在使一个核酸片段的3'末端与第二个核酸片段的5'末端进行化学连接的条件下将核酸片段彼此接触，以生成分段核酸分子。
9、本发明还包括生产用于crispr介导的基因编辑的化学连接单分子向导rna的方法。这些方法包括：(a)分别合成三个或更多配备有用于一次性正交或顺序化学连接的化学功能的核酸片段，(b)在使一个核酸片段的3'末端与第二个核酸片段的5'末端进行化学连接的条件下将核酸片段彼此接触，以生成分段核酸向导rna。
10、在一个实施方式中，所述用于crispr介导的基因编辑的化学连接的单分子向导rna为用于引导编辑(prime editing)的pegrna。所述连接的pegrna包括crgrna和连接的两段tracrgrna，通过非核苷酸接头连接得到三段pegrna，其中连接的tracrgrna的3’段还包括包含引物结合序列(pbs)和rt模板(rtt)的3’延伸，tracrgrna的内部连接位点位于第二个茎环处。
11、在另一实施方式中，所述连接的pegrna进一步与3’端稳定结构基序如端环连接得到四段pegrna。所述稳定结构基序的长度约为30-100碱基。
12、在某些方面，本发明提供了进一步包含一个或多个细胞靶向分子的分段核酸，每个分子通过非核苷酸连接子连接。
13、在某些方面，本发明涉及的方法包括：(a)分别合成配备有用于一次性正交或顺序化学连接的化学功能的核酸片段和细胞靶向配体，(b)在允许一个核酸片段的3'末端与第二个核酸片段的5'末端进行化学连接的条件下，将核酸片段相互接触以生成分段核酸分子，(c)将形成的分段核酸分子与细胞靶向配体接触以生成分段核酸-配体共轭物。
14、在某些方面，本发明涉及的方法包括：(a)分别合成配备有用于一次性正交或顺序化学连接的化学功能的核酸片段和肽，(b)在允许一个核酸片段的3'末端与第二个核酸片段的5'末端进行化学连接的条件下，将核酸片段相互接触以生成分段核酸分子，(c)将形成的分段核酸分子与肽接触以生成分段核酸-肽共轭物。
15、在某些方面，本发明涉及的方法包括：(a)分别合成配备有用于一次性正交或顺序化学连接的化学功能的核酸片段和蛋白质，(b)在允许一个核酸片段的3'末端与第二个核酸片段的5'末端进行化学连接的条件下，将核酸片段相互接触以生成分段核酸分子，(c)将形成的分段核酸分子与蛋白质接触以生成分段核酸-蛋白质共轭物。
16、在某些方面，本发明涉及的方法包括：(a)分别合成配备有用于一次性正交或顺序化学连接的化学功能的核酸片段和聚乙二醇(peg)，(b)在允许一个核酸片段的3'末端与第二个核酸片段的5'末端进行化学连接的条件下，将核酸片段相互接触以生成分段核酸分子，(c)将形成的分段核酸分子与聚乙二醇接触以生成分段核酸-聚乙二醇共轭物。
17、在某些方面，本发明涉及的方法包括：(a)分别合成配备有用于一次性正交或顺序化学连接的化学功能的核酸片段和聚合物，(b)在允许一个核酸片段的3'末端与第二个核酸片段的5'末端进行化学连接的条件下，将核酸片段相互接触以生成分段核酸分子，(c)将形成的分段核酸分子与聚合物接触以生成分段核酸-聚合物共轭物。
18、本发明还包括生产用于crispr介导的精确基因编辑的化学连接的单分子向导rna-ssdna共轭物的方法。这些方法包括：(a)分别合成配备有用于一次性正交或顺序化学连接的化学功能的三个或更多核酸片段，(b)在允许一个核酸片段的3'末端与第二个核酸片段的5'末端进行化学连接的条件下，将核酸片段相互接触以生成分段核酸分子。所得分段核酸的5'末端片段是包含基因编辑序列并由两个同源臂夹侧的ssdna修复模板。
19、在一种实施方式中，ssdna的5'末端与连接的导向rna的5'末端连接。
20、在另一种实施方式中，ssdna的3'末端与连接的向导rna的5'末端连接。
21、本发明还包括生产用于crispr介导的精确基因编辑的化学连接的单分子向导rna-ssdna共轭物的方法。这些方法包括：(a)分别合成配备有用于一次性正交或顺序化学连接的化学功能的三个或更多核酸片段，(b)在允许一个核酸片段的3'末端与第二个核酸片段的5'末端进行化学连接的条件下，将核酸片段相互接触以生成分段核酸分子。所得分段核酸的3'末端片段是包含基因编辑序列并由两个同源臂夹侧的ssdna修复模板。
22、在一种实施方式中，ssdna的5'末端与连接的向导rna的3'末端连接。
23、本发明还包括用于产生配备有用于crispr介导的精确基因编辑的ssdna模板的化学连接的单分子向导rna的方法。这些方法包括：(a)分别合成三个或更多个配备有化学功能的核酸片段，用于一锅正交或连续化学连接，(b)在允许3个核酸片段化学连接的条件下使核酸片段彼此接触。将一个核酸片段的5'末端连接到第二核酸片段的3'末端以产生分段的核酸分子。3'末端片段包括1个rna片段和1个dna片段，rna片段的3'末端与dna片段的5'末端之间通过磷酸二酯键或氨基磷酸酯键连接，所述dna片段是dna修复体模板包含侧翼有两个同源臂的基因编辑序列。
24、本发明还包括用于生产化学连接的单分子向导rna的方法，所述单分子向导rna装备有用于crispr介导的基因编辑的衔接子ssdna。这些方法包括：(a)分别合成三个或更多个装备有化学功能的核酸片段，用于一锅式正交或顺序化学连接，(b)在允许一个核酸片段的3'末端与第二个核酸片段的5'末端化学连接的条件下使核酸片段彼此接触以产生分段的核酸分子。5'末端片段或3'末端片段是与用于基因治疗的货物dna分子互补的衔接子ssdna。
25、在另一个实施例中，ssdna衔接子被rna衔接子取代，而货物dna分子含有共价连接的rna衔接子或dna衔接子。
26、这些分段核酸或它们的缀合物中的一些与蛋白质例如crispr cas9、ncas9、dcas9和融合蛋白、其他2类crispr核酸内切酶和adar形成rnp复合物，并且所得的rnp复合物用作用于治疗疾病。
27、本发明还包括含有一种或多种分段核酸或其缀合物的细胞和通过本文所述方法制备的细胞。例如，本发明包括已引入一种或多种分段核酸或其缀合物的细胞，其含有或不含有蛋白质，例如cas9、ncas9、ncas9融合蛋白、dcas9、dcas9融合蛋白、其他2类crispr内切酶及其adar。本发明还包括含有分段核酸或其缀合物和编码蛋白质的mrna的细胞，例如编码cas9、ncas9、ncas9融合蛋白、dcas9和融合蛋白、其他2类crispr内切酶及其adar的mrna，以及已通过本发明的方法修饰的细胞(例如，在靶位点处经历了dna切割和修饰的细胞)，其含有或不再含有一种或多种分段核酸。
28、在上述实施例中，应理解，连接的核酸的末端两个或三个核苷酸可选地被修饰为2’-ome或2’-moe硫代磷酸酯，以增加稳定性。
1.制备由三唑接头连接的分段核酸及其缀合物的方法，包括：
2.权利要求1步骤a)中片段1的所述合成是在附着于固相载体的醇上进行的，其中所述醇含叠氮基取代，随后整体脱保护得到含有3'-末端叠氮基修饰的片段1。
3.权利要求1的步骤d)中的所述转化是与氟磺酰叠氮化物的重氮转移反应。
4.权利要求1的步骤d)中的所述转化是与叠氮基取代的nhs酯形成酰胺。
5.权利要求1所述步骤c)和e)中的偶联，其中所述炔烃是过量的，偶联后用过量的小分子叠氮化物猝灭。
6.权利要求1的步骤d)中的所述转化是与连接官能团取代的nhs酯形成酰胺，并且权利要求1的e)被替换为：
7.权利要求1步骤b)的5'-炔基、3'-氨基核酸片段的制备方法，包括：
8.权利要求1的所述分段核酸是作为crispr-cas rnp复合物的组分的向导rna。
9.权利要求8所述的向导rna，其3'末端片段在其3'末端包含长度为18-200碱基的dna片段。
10.权利要求8的所述3'-末端片段，进一步包含tracrrna 3'-末端的rna区段，其与dna片段的5'-末端或3'-末端共价连接。
11.根据权利要求8所述的向导rna，其5'末端片段在5'末端连接了长度为18-200碱基的ssdna片段。
12.权利要求1的所述分段核酸是核酶。
13.权利要求1的所述分段核酸是适体。
14.权利要求1所述的分段核酸是人adar1或adar2的向导rna。
15.权利要求1的所述分段核酸是rna缀合物。
16.权利要求1的方法，用于制备由三唑接头连接的三分段核酸，包括：
17.权利要求1的方法，用于制备由三唑接头连接的三分段核酸，包括：
18.权利要求1的方法，用于制备由三唑接头和酰胺接头连接的三分段核酸，包括：
19.通过顺序连接制备分段核酸缀合物的方法，包括：
20.权利要求1中制备由三唑连接体连接的三分段核酸的方法，包括：
21.权利要求20的方法，其中步骤d)中的所述叠氮基是过量的，并且未反应完的叠氮基用过量的小分子炔烃猝灭。
22.通过顺序连接制备分段核酸缀合物的方法，包括：
23.制备连接的crispr向导rna文库的方法，包括：
24.锁定向导rna的二级结构的方法，包括连接两个核酸片段以形成顺式构型的nnt-接头。
25.权利要求23所述的所述nnt-接头选自以下组：
26.用于精确rna引导基因编辑的长dna模板递送方法，包括：
27.用于制备用于adar1和/或adar2介导的rna编辑的连接向导rna文库的方法，包括：
