本公开内容广泛地涉及检测宿主样品中非宿主物种的方法，所述方法包括一锅法dna/rna文库制备以及排除宿主背景以富集病原体dna和rna的技术。
背景技术：
1、检测驻留在宿主内或宿主上的非宿主物种的能力对于微生物研究、对于病原体鉴别以及对于人、宠物、家畜和野生动物的临床诊断而言重要。高通量测序可以作为检测宿主体液中非宿主核酸的有力方法，但来自非宿主生物体的核酸信号经常被来自宿主的信号所淹没。
2、以哺乳动物的体液(如血浆、脑脊液、鼻分泌物和尿液)为典型实例，即使通过低速离心排除宿主细胞，仍可在许多复合物(包括脂蛋白复合物、细胞外囊泡、线粒体和凋亡小体)中发现显著量的哺乳动物核酸。对于高通量测序，排除这些宿主信号对获得良好的信号-背景比至关重要。
3、本领域已经使用了许多方法来去除这种背景宿主信号。此类方法中的数种涉及进一步使用高速离心，后随着选择性细胞裂解和核酸降解。然而，来自非宿主生物体(包括细菌、原生动物、真菌和dna/rna病毒)的核酸信号可能在离心步骤期间丢失。其它缺点包括对可被降解或抑制的宿主细胞核酸的特定类型的限制，以及非宿主生物体信号的富集不足。
4、在去除背景宿主信号后，宏基因组学测序涉及文库的创建。通常，使用单独的样品分别创建dna文库和rna文库。从生物样品或医学样品中制备用于高通量测序的文库并非总是易事，因为它们的核酸含量通常显著地低。许多传统方法为了应对这种限制，可能需要更复杂的程序，这耗时更久且成本更高，或仅限于某种核酸样品，或可能丢失或添加一些不属于原始样品的要素，这意味着不存在对核酸样品进行同步扩增从而避免或降低同一靶标不同类型核酸之间的偏差的方法，尤其是当核酸样品量仅达皮克级时。因此，分别创建dna和rna文库可能会困难，增加处理成本并增加样品处理时间。
5、美国专利号5,731,171(bohlander等)提供了能够从微量中(如从显微切割的染色体材料中)扩增dna的序列非依赖性扩增(sia)，基于pcr的方法。该方法包括初始引物，所述引物由位于3'端的4个-8个随机核苷酸以及位于5'端的限定(非随机)序列的10个-30个核苷酸构成，其中，随机核苷酸可以是(处于任何顺序的)g/a/t/c中的任意一种。初始引物的3'端应与整个靶标dna片段中的随机位点互补，而限定序列应构成不形成自我同源性、没有连续相同的核苷酸并且不过度富含g:c或a:t富含的pcr引物。
6、美国专利号6,124,120(lizardi等)提供了多链置换扩增(mda)的不基于pcr的方法，该方法使用与一对双链dna互补的两组引物，其中，一些中间引物通过聚合酶在复制过程中被置换。该专利的另一项实施方式还使用一组随机引物来对整个基因组进行测序。在复制过程中使用了高加工性聚合酶，从而在短时间内合成整个基因组的重叠拷贝。
7、然而，bohlander等和lizardi等都不能被用于同时扩增含有不同核酸(包括脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)，或其任何类似物)的混合物的样品而无偏差，所述核酸为单链或双链，或两者皆有。
8、美国专利号7,402,386(kurn等)公开了使用rna-dna复合引物以及dna依赖性和rna依赖性dna聚合酶来全局扩增dna/rna多核苷酸靶标的方法。该方法涉及在后续扩增之前从rna/dna异源双链体中切割rna部分。
9、美国专利号7,718,403和美国专利号8,206,913(kamberov等)公开了全基因组扩增(wga)和全转录组扩增(wta)的方法，所述方法包括文库生成步骤和文库扩增步骤，涉及在文库生成步骤中使用随机引物和特定dna聚合酶从dna/rna模板生成第一链，其中引物的可变区包含最多3个随机核苷酸，各自包括两个非互补核苷酸，使得引物不会自杂交或彼此交叉杂交。如果每个随机引物中只有最多3个随机核苷酸，则选择包含两个非互补核苷酸碱基的随机核苷酸而不是包含至少三个非互补核苷酸碱基的随机核苷酸并不能有效减少随机引物池中的交叉杂交，因为pcr偏好于生成短扩增子。为了防止聚合酶螯合到非生产性扩增子上，重要的是要降低形成非特异性扩增子的能力。
10、美国专利号8,741,606(casbon等)公开了如下的方法，所述方法将简并碱基区(dbr)标记至待测序的核酸分子两端，从而由于两个不同的dbr而产生不对称标记的核酸分子。dbr包括用于后续pcr的测序引物位点。在'606的某些实施方案中，dbr可以是3个至10个随机核苷酸长，并且各dbr可具有不同的碱基组成，例如4碱基dbr可以具有下列组成中的任一种：nnnn；nrsn；swsw；bdhv(根据iupac核苷酸代码)。'606涉及在待测序核酸分子的两端添加两个不同的dbr，以及一些功能结构域，如用于测序目的的唯一多重标识符和测序引物位点，但它起初并非设计用于从包括处于单链或双链形式的dna和rna两者在内的不同核酸的混合物中制备文库。
11、美国专利号8,728,766(casbon等)公开了加工基因组dna样品的方法，所述方法包括使用第一引物的群与初始靶标dna分子的基因组样品杂交，其中第一引物包括处于靶标特异性序列的5'的不同dbr序列，并且不同的dbr序列包含根据iupac核苷酸编码的r、y、s、w、k、m、b、d、h、v、n或它们的修饰版本中的至少一种。在某些实例中，ryb充当dbr序列，而dhvb充当靶标特异性序列。在这些实例中，来自这些随机核苷酸的不同序列的总数可为972个(2×2×3×3×3×3)。在'766的第一引物中使用的dbr序列中仍然只有三个随机核苷酸。在适当的条件下，引物之间仍可能发生交叉杂交。
12、美国专利号9,920,355(osborne等)提供了文库制备方法，所述方法包括在第一链、第二链生成和/或pcr扩增的rt反应混液(reaction mix)中加入不同浓度的脱氧甲基胞嘧啶核苷三磷酸，以促进使用特定限制性酶消化进行的片段化。
13、鉴于上述情况，需要解决或至少改善上述问题中的一个或多个。特别是，需要提供降解样品中不希望的核酸的方法，同时需要以成本有效的方式快速创建dna和rna文库，从而准确快速地检测宿主样品中的非宿主物种及相关组成。此类技术使得能够广泛使用下一代宏基因组测序，特别是对于人的病原体检测。
技术实现思路
1、在一个方面，本发明提供了改进的体液样品宏基因组测序工艺。在该工艺的一部分中，通过使样品和与酶(如核酸酶)偶联的磁性颗粒接触，使样品中不希望的核酸降解，所述酶用以降解样品中不希望的核酸。磁性颗粒与酶偶联，并且能够降解dna和rna两者，然后施加磁场将与酶偶联的磁性颗粒从样品中去除。通过一锅法工艺从降解的样品中创建dna和rna文库。
2、在另一个方面，一锅法工艺利用一组引物来对单链dna进行引发(prime)并同时对rna进行引发。
3、在另一个方面，样品包含作为后续延伸和扩增的模板的多于一种类型的核酸，所述核酸包括单链和/或双链的dna和/或rna，并且一锅法工艺包括从样品制备第一dna链，所述制备第一dna链包括使一种或多种第一dna链生成引物与dna和/或rna模板中的任一种退火、以及从退火的第一dna链生成引物进行延伸，所述延伸包括使用能够从dna和/或rna模板中的一者或两者合成第一dna链的dna聚合酶，以获得第一dna链。
4、在另一个方面，与酶偶联的磁性颗粒包括与dnase和rnase两者偶联的磁性颗粒、与能够降解dna和rna两者的酶偶联的磁性颗粒、包含与dnase偶联的磁性颗粒和与rnase偶联的磁性颗粒的混合物、或它们的组合。
5、在另一个方面，不希望的核酸包括无细胞核酸。
6、在另一个方面，降解样品中不希望的核酸进一步包括向样品施加裂解剂用于选择性地裂解样品中的生物复合物，以释放所述不希望的核酸供酶降解，任选地，其中裂解剂实质上不能裂解选自细菌、原生动物、真菌和寄生虫的完整细胞和病毒。
7、在另一个方面，裂解剂包括温和的洗涤剂。
8、在另一个方面，样品是源自宿主受试者的样品，并且不希望的核酸是宿主核酸，但实质上没有非宿主核酸。
9、在另一个方面，本发明提供了检测宿主样品中非宿主物种的方法。使宿主样品和与酶偶联的磁性颗粒接触，以降解宿主样品中存在的无细胞宿主核酸，其中，与酶偶联的磁性颗粒能够降解dna和rna两者。施加磁场以从宿主样品中去除与酶偶联的磁性颗粒。以一锅法工艺从降解的样品中创建dna和rna文库，然后从dna和rna文库中检测非宿主核酸的存在。
10、在另一个方面，一锅法工艺使用一组引物来对单链dna进行引发并同时对rna进行引发。
11、在另一个方面，样品包含作为后续延伸和扩增的模板的多于一种类型的核酸，所述核酸包括单链和/或双链的dna和/或rna，一锅法工艺包括从样品制备第一dna链，所述制备第一dna链包括使一种或多种第一dna链生成引物与dna和/或rna模板中的任一种退火、以及从退火的第一dna链生成引物进行延伸，所述延伸包括使用能够从dna和/或rna模板中的一者或两者合成第一dna链的dna聚合酶，以获得第一dna链。
12、在另一个方面，在使宿主样品和与酶偶联的磁性颗粒接触之前，将宿主细胞从宿主样品中去除。
13、在另一个方面，在接触步骤之前，向宿主样品施加第一裂解剂用于选择性地裂解生物复合物，以释放其中所含的宿主核酸，任选地，其中第一裂解剂实质上不能裂解非宿主物种以释放其中所含的核酸供酶降解。裂解剂包括温和的洗涤剂。
14、检测样品中非宿主核酸的存在的步骤包括对宿主样品施加第二裂解剂用于裂解非宿主物种，以释放其中所含的核酸。
15、在另一个方面，第二裂解剂包括裂解颗粒，所述颗粒能够给予机械力来裂解非宿主物种并释放其中所含的核酸。
16、在另一个方面，检测样品中非宿主核酸的存在包括对非宿主核酸进行测序。
1.一种体液样品的宏基因组测序工艺，所述工艺中改进包括：
2.如权利要求1所述的宏基因组测序工艺，其中，所述酶是核酸酶。
3.如权利要求1所述的宏基因组测序工艺，其中，所述一锅法工艺使用一组引物对单链dna进行引发，并同时对rna进行引发。
4.如权利要求1所述的宏基因组测序工艺，其中，所述样品包含作为后续延伸和扩增的模板的多于一种类型的核酸，所述核酸包括单链和/或双链的dna和/或rna，
5.如权利要求1所述的宏基因组测序工艺，其中，所述与酶偶联的磁性颗粒包括与dnase和rnase两者偶联的磁性颗粒、与能够降解dna和rna两者的酶偶联的磁性颗粒、与dnase偶联的磁性颗粒和与rnase偶联的磁性颗粒的混合物、或它们的组合。
6.如权利要求1或2所述的宏基因组测序工艺，其中，所述不希望的核酸包括无细胞核酸。
7.如权利要求1-5中任一项所述的宏基因组测序工艺，其中，降解所述样品中不希望的核酸还包括向样品施加裂解剂，用于选择性地裂解所述样品中的生物复合物，以释放所述不希望的核酸供所述酶降解，任选地，其中所述裂解剂实质上不能裂解选自细菌、原生动物、真菌和寄生虫的完整细胞和病毒。
8.如权利要求6所述的宏基因组测序工艺，其中，所述裂解剂包括温和洗涤剂。
9.如权利要求1-7中任一项所述的宏基因组测序工艺，其中，所述样品包括源自宿主受试者的样品并且所述不希望的核酸包括宿主核酸但实质上没有非宿主核酸。
10.如权利要求9所述的宏基因组测序工艺，其中，所述酶是核酸酶。
11.一种检测宿主样品中的非宿主物种的方法，所述方法包括：
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述一锅法工艺使用一组引物对单链dna进行引发，并同时对rna进行引发。
13.如权利要求11所述的方法，其中，所述样品包含作为后续延伸和扩增的模板的多于一种类型的核酸，所述核酸包括单链和/或双链的dna和/或rna，
14.如权利要求11所述的方法，所述方法进一步包括在使所述宿主样品和所述与酶偶联的磁性颗粒接触之前从所述宿主样品中去除宿主细胞。
15.如权利要求11所述的方法，所述方法进一步包括在接触步骤之前向所述宿主样品施加第一裂解剂，用于选择性地裂解生物复合物，以释放其中所含的宿主核酸，任选地，其中所述第一裂解剂实质上不能裂解非宿主物种以释放其中所含的核酸供所述酶降解。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述裂解剂包括温和的洗涤剂。
17.如权利要求11所述的方法，其中，检测所述样品中非宿主核酸的存在的步骤包括：
18.如权利要求11所述的方法，其中，所述第二裂解剂包括裂解颗粒，该裂解颗粒能够给予机械力以裂解非宿主物种并释放其中所含的核酸。
19.如权利要求11所述的方法，其中，检测所述样品中非宿主核酸的存在包括对所述非宿主核酸进行测序。
