本发明属于生物医学工程，具体涉及到组织工程，再生医学，小口径人工血管等技术，尤其是一种负载人羊膜间充质干细胞的新型人工血管及其制备方法和用途。
背景技术：
1、心血管疾病是全球范围内主要的死亡原因之一，尤其在中国，心血管病患病人数高达3.3亿，其导致的死亡占城乡居民总死亡比例的首位，超过44％。心血管疾病的防治对于减轻医疗和社会负担至关重要。在终末期的重症阻塞性心血管疾病治疗中，血管移植是关键的治疗手段，自体血管移植因其良好的兼容性和远期通畅率被视为金标准。
2、尽管自体血管移植具有显著优势，但其侵入性获取方式对患者造成较大损伤，并可能引发并发症。此外，由于患者个体差异，约三分之一的病人难以获取合适的自体血管。市场上已有的大口径人工血管在主动脉等大血管置换中取得了满意效果，但小口径人工血管(sdvg)由于其特殊的血流动力学特性，面临血栓形成和低远期通畅率的挑战，难以满足临床需求。
3、为了提高sdvg的通畅率，科学家们开发了多种具有抗血栓性能的人工血管。主要策略包括对材料进行抗凝血化合物修饰以减轻血栓形成，或引入具有抗血栓功能的细胞内衬。尽管化学修饰策略存在随时间下降的问题，但细胞内衬策略因其活细胞的自我更新和旁分泌功能，展现出随时间增强的抗血栓性能。
4、在探索sdvg抗血栓修饰的细胞资源时，人羊膜间充质干细胞(hamsc)因其多向分化能力、无致瘤性、低免疫原性以及优异的免疫耐受性，显示出作为新一代sdvg种子细胞的潜力。同时，新型支架材料，特别是可降解聚合物静电纺丝技术，被认为是下一代人工血管支架材料的发展方向，有望进一步提高人工血管的性能和临床应用的成功率。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种负载人羊膜间充质干细胞的新型人工血管及其制备方法，以及相应的用途，以克服现有技术的不足。
2、基于本发明的第一个主要方面，提供了一种负载人羊膜间充质干细胞的人工血管，由聚乳酸-聚己内酯共聚物plcl静电纺丝制备成管状结构，该管状结构具有以下特征：0.36±0.10μm，孔径为3.63±1.66μm，壁厚为510±50μm，内径为2.19±0.05mm，孔隙率为69.74％±5.81％；以及，负载有人羊膜间充质干细胞hamsc。
3、本发明通过精确控制聚乳酸-聚己内酯共聚物(plcl)静电纺丝工艺，实现了具有特定孔隙率和纤维结构的管状支架。这种结构不仅提供了优异的细胞生长微环境，而且通过优化的孔径和壁厚，为细胞提供了足够的空间以实现良好的细胞黏附和增殖。此外，负载的人羊膜间充质干细胞(hamsc)赋予了人工血管更好的组织相容性和促进血管再生的潜力，从而提高了人工血管的临床应用价值和治疗有效性。
4、在一些实施例中，所述人羊膜间充质干细胞hamsc是经过以下步骤提取和鉴定：机械剥离联合二酶消化法；流式细胞术分析；vimentin免疫染色；成骨分化能力测试；成脂分化能力测试。
5、hamsc的提取和鉴定步骤，确保了所选用的细胞具有高度的纯度和特定的生物学特性。通过流式细胞术分析和vimentin免疫染色，可以验证hamsc的表型和间充质特性，而通过成骨和成脂分化能力测试，则证实了hamsc的多向分化潜能。这些特性对于人工血管的长期功能和成功整合至宿主组织至关重要，有助于提高人工血管的稳定性和促进组织修复。
6、机械剥离联合二酶消化法首先从胎盘中取得羊膜组织，然后在无菌条件下，使用外科手术器械如镊子和剪刀，仔细剥离羊膜与胎盘的其他组织层，以获得纯净的羊膜组织。这一步骤需要在显微镜下进行，以确保羊膜的完整性和避免其他组织的污染。再将剥离得到的羊膜组织切割成小块，以增加组织的表面积，便于后续的酶消化。然后，使用组织均质器将这些小块进一步均质化，形成细胞悬液。
7、二酶消化法试向均质化后的细胞悬液中加入适量的两种酶——通常是胶原酶和中性蛋白酶。这些酶能够分解细胞外基质，帮助释放附着在基质上的细胞。将混合物在37℃恒温条件下孵育一段时间，以允许酶充分发挥作用。消化后的细胞悬液通过无菌过滤网过滤，以去除未消化的组织碎片。然后，通过离心分离出细胞沉淀，去除上清液中的酶和非细胞成分。将细胞沉淀重悬在适当的细胞培养基中，并接种到细胞培养板或瓶中。在37℃、5％co2的条件下培养，以促进细胞的贴壁和增殖。当细胞生长到一定密度后，进行传代培养，以获得足够数量的hamsc用于后续的实验和应用。
8、作为进一步的优选方案，所述流式细胞术分析用于确定hamsc的表型，包括cd标志物的表达；所述vimentin免疫染色用于验证hamsc的间充质特性；所述成骨分化能力测试，包括将hamsc培养在含有β-甘油磷酸钠、维生素d3和去氢胆固醇的成骨诱导介质中，并观察碱性磷酸酶的活性和矿化结节的形成；所述成脂分化能力测试，包括将hamsc培养在含有地塞米松、胰岛素、吲哚美辛和异丙肾上腺素的成脂诱导介质中，并观察油滴的形成。
9、通过特定的培养条件和化学诱导介质，测试并证明了hamsc的成骨和成脂分化能力。这种分化能力是评估hamsc在组织工程中应用潜力的关键因素，因为它们可以促进血管及其周围组织的结构和功能重建。此外，通过观察碱性磷酸酶的活性和矿化结节的形成，以及油滴的形成，可以准确评估hamsc的分化状态，从而确保所负载的细胞具备促进组织再生和修复的能力。
10、作为进一步的优选方案，所述提取和鉴定还包括细胞倍增时间和细胞存活率的测定，其中细胞倍增时间通过细胞计数法进行，细胞存活率通过mtt或cck-8实验进行。
11、细胞倍增时间和细胞存活率的测定，为评估hamsc的生物学活性和增殖能力提供了重要指标。通过细胞计数法确定的细胞倍增时间反映了hamsc的快速增殖特性，这对于细胞在人工血管中的快速覆盖和长期维持至关重要。而通过mtt或cck-8实验测定的细胞存活率则确保了hamsc在植入后的早期存活，为后续的组织整合和功能恢复提供了基础。这些指标的综合考量有助于提高人工血管的临床成功率和长期效果。
12、基于本发明的第二个主要方面，提供一种前述的负载人羊膜间充质干细胞的人工血管的制备方法，该方法包括以下步骤：利用静电纺丝技术，将plcl溶解于溶剂中制备成电纺液，通过电纺设备将电纺液加工成管状支架；将制备好的管状支架进行冷冻干燥和紫外线灭菌处理；将人羊膜间充质干细胞hamsc通过旋转种植技术均匀负载于管状支架内腔；使hamsc在管状支架内腔贴壁并增殖。
13、该制备方法为人工血管的成功制造提供了关键步骤，确保了最终产品的一致性和可重复性。通过精确控制静电纺丝技术来制备plcl管状支架，不仅实现了对支架微观结构的精确调控，还通过冷冻干燥和紫外线灭菌处理确保了支架的生物安全性。此外，旋转种植技术的应用使得hamsc能够在支架内腔均匀分布并贴壁增殖，这一过程对于形成功能性的血管内皮层至关重要，从而提高了人工血管的体内相容性和促进了快速的组织整合。
14、在一些实施例中，所述电纺液的浓度为10％，且电纺过程中使用的电压控制在12-14kv。
15、电纺液浓度和电压控制对制备高质量的人工血管管状支架至关重要。10％的电纺液浓度和12-14kv的电压范围为获得均匀的纤维直径和孔径提供了良好条件，这对于细胞黏附、迁移和增殖是必要的。这些参数的精确设置有助于保持支架的机械性能和生物相容性，从而确保人工血管在体内外的应用中具有更好的稳定性和功能性。
16、在一些实施例中，所述旋转种植技术包括以下步骤：将hamsc细胞悬液注入管状支架内；使用血管钳固定支架两端；在37℃、5％co2条件下静置2小时；每30分钟翻转支架90°，共旋转360°。
17、旋转种植技术是实现hamsc在人工血管内均匀分布的关键步骤。通过将细胞悬液注入管状支架内并使用血管钳固定，结合在特定条件下的静置和翻转，该技术确保了hamsc与支架材料的充分接触，从而促进了细胞的均匀种植和后续的增殖。这种均匀的细胞分布对于形成连续的血管内皮层和提高人工血管的抗血栓能力至关重要。
18、在一些实施例中，所述冷冻干燥步骤在-80℃条件下进行24小时。
19、冷冻干燥步骤是确保人工血管支架结构稳定性和细胞活性的重要环节。在-80℃条件下进行24小时的冷冻干燥，可以有效去除支架中的水分，减少细胞受损的风险，并保持支架的孔隙结构，为细胞的种植和生长提供了良好的环境。这一步骤对于保持人工血管的长期稳定性和功能性至关重要。
20、在一些实施例中，所述通过电纺设备将电纺液加工成管状支架包括以下步骤：将plcl溶解于六氟异丙醇中；使用旋转不锈钢钢棒作为接收装置进行静电纺丝；将制得的血管从不锈钢棒上剥离并连同纺丝膜一起浸入去离子水中。
21、制备过程中的最后几个步骤，包括将plcl溶解于六氟异丙醇、使用旋转不锈钢钢棒进行静电纺丝，以及将制得的血管从不锈钢棒上剥离并进行后期处理，这些步骤共同确保了人工血管的形态和结构特征。特别是，这种制备方法能够生产出具有适当孔径和孔隙率的支架，为细胞提供了必要的微环境，有助于细胞的黏附、生长和分化，从而提高了人工血管的整体性能和临床应用潜力。
22、基于本发明的第三个主要方面，提供了负载人羊膜间充质干细胞的人工血管在制备治疗心血管疾病的器械中的应用，所述心血管疾病包括冠状动脉疾病、外周动脉疾病和主动脉疾病。
23、这种应用利用了人工血管的优异细胞相容性和hamsc的多向分化潜能，旨在提供一种新型的治疗手段，以促进受损血管的修复和再生。通过hamsc的植入，人工血管不仅能够提高血管的通畅率，还能通过分泌生长因子和细胞外基质成分，促进周围组织的修复，减少术后并发症，从而改善患者的预后。
24、除了心血管疾病外，这种人工血管还可能被应用于其他需要血管替代或修复的医疗领域。例如，在肿瘤切除术后的血管重建、外伤性血管损伤的修复，以及复杂骨折后的血管再生中，该人工血管都能发挥重要作用。其独特的结构和细胞负载能力，能够促进受损区域的快速血管化，加速伤口愈合过程，提高治疗成功率。
25、考虑到hamsc的免疫调节特性，这种人工血管还有潜力被应用于治疗自身免疫性疾病。在这些疾病中，血管经常受到炎症的侵袭和损伤。利用hamsc的免疫调节功能，可以减少炎症反应，保护血管免受进一步损害，并促进受损血管的修复。此外，hamsc的抗炎和促进血管生成的能力，也可能使其在治疗慢性伤口愈合和糖尿病足等领域中发挥作用。
26、小口径人工血管是心血管疾病治疗领域亟需突破的瓶颈，本发明采用基于干细胞和可降解静电纺丝复合物的制备策略，提出了一种新的人工血管方案。该方案使用人类来源的hamsc作为种子细胞，这种细胞具有活力强、含量丰富、提取便捷等优点。
27、此外，plcl静电纺丝材料作为支架基底材料，生物安全性高，力学性能适中。通过将hamsc种植在plcl静电纺丝管状支架内，成功制备出符合设计要求的人工血管，并在体内外实验中验证了其可行性。
28、实验结果表明，hamsc-plcl人工血管具有良好的力学性能、细胞相容性和体外血液相容性，能够协同vegf促进hamsc向内皮细胞分化，适合用于血管移植。大鼠皮下移植实验显示了其良好的组织相容性，并证明了hamsc对血管再生的促进作用。体内血液相容性测试表明hamsc-plcl人工血管具有抗急性血栓的能力。
29、进一步的体内实验中，将hamsc-plcl人工血管植入大鼠腹主动脉替代模型中，一个月后结果显示人工血管实现了100％的通畅率，而无细胞plcl人工血管仅60％通畅。
30、组织化学和免疫荧光染色分析显示hamsc负载提高了人工血管的再生效果，如更深的细胞浸润、更多的细胞外基质沉积和更完整的内膜层形成。这表明hamsc能够通过多种途径提高人工血管的通畅率和再生性能。总的来说，这一研究证明了hamsc-plcl人工血管的临床应用潜力。
1.一种负载人羊膜间充质干细胞的人工血管，其特征在于，由聚乳酸-聚己内酯共聚物plcl静电纺丝制备成管状结构，该管状结构具有以下特征：纤维直径为0.36±0.10μm，孔径为3.63±1.66μm，壁厚为510±50μm，内径为2.19±0.05mm，以及孔隙率为69.74％±5.81％；以及，负载有人羊膜间充质干细胞hamsc。
2.根据权利要求1所述的负载人羊膜间充质干细胞的人工血管，其特征在于，所述人羊膜间充质干细胞hamsc是经过以下步骤提取和鉴定：机械剥离联合二酶消化法；流式细胞术分析；vimentin免疫染色；成骨分化能力测试；成脂分化能力测试。
3.根据权利要求2所述的负载人羊膜间充质干细胞的人工血管，其特征在于，所述流式细胞术分析用于确定hamsc的表型，包括cd标志物的表达；所述vimentin免疫染色用于验证hamsc的间充质特性；所述成骨分化能力测试，包括将hamsc培养在含有β-甘油磷酸钠、维生素d3和去氢胆固醇的成骨诱导介质中，并观察碱性磷酸酶的活性和矿化结节的形成；所述成脂分化能力测试，包括将hamsc培养在含有地塞米松、胰岛素、吲哚美辛和异丙肾上腺素的成脂诱导介质中，并观察油滴的形成。
4.根据权利要求2所述的负载人羊膜间充质干细胞的人工血管，其特征在于，所述提取和鉴定还包括细胞倍增时间和细胞存活率的测定，其中细胞倍增时间通过细胞计数法进行，细胞存活率通过mtt或cck-8实验进行。
5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的负载人羊膜间充质干细胞的人工血管的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将plcl溶解于溶剂中制备成电纺液，利用静电纺丝技术，通过电纺设备将电纺液加工成管状支架；将制备好的管状支架进行冷冻干燥和紫外线灭菌处理；将人羊膜间充质干细胞hamsc通过旋转种植技术均匀负载于管状支架内腔；使hamsc在管状支架内腔贴壁并增殖。
6.根据权利要求5所述的负载人羊膜间充质干细胞的人工血管的制备方法，其特征在于，所述电纺液的浓度为10％，且电纺过程中使用的电压控制在12-14kv。
7.根据权利要求5所述的负载人羊膜间充质干细胞的人工血管的制备方法，其特征在于，所述旋转种植技术包括以下步骤：将hamsc细胞悬液注入管状支架内；使用血管钳固定支架两端；在37℃、5％co2条件下静置2小时；每30分钟翻转支架90°，共旋转360°。
8.根据权利要求5所述的负载人羊膜间充质干细胞的人工血管的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥步骤在-80℃条件下进行24小时。
9.根据权利要求5所述的负载人羊膜间充质干细胞的人工血管的制备方法，其特征在于，所述通过电纺设备将电纺液加工成管状支架包括以下步骤：将plcl溶解于六氟异丙醇中；使用旋转不锈钢钢棒作为接收装置进行静电纺丝；将制得的血管从不锈钢棒上剥离并连同纺丝膜一起浸入去离子水中。
10.权利要求1-5中任意一项所述的负载人羊膜间充质干细胞的人工血管在制备治疗心血管疾病的器械中的应用，所述心血管疾病包括冠状动脉疾病、外周动脉疾病和主动脉疾病。
