用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中的包含pd-l1和/或pd-l2的靶向模块
1.本发明涉及一种包含至少一个pd-l1和/或pd-l2结合结构域、和标签结合结构域或标签的靶向模块，用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中；包含编码所述靶向模块的核苷酸序列的核酸、载体或细胞；包含所述靶向模块和包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞的药物组合物和药盒。
2.嵌合抗原受体(car)是由提供抗原特异性的结合部分和源自于免疫受体的一个或几个信号转导链组成的人工受体(cartellieri等2010)。这两个主要的car结构域通过连接肽链连接，该连接肽链包含将car锚定在细胞质膜中的跨膜结构域。免疫细胞，特别是t和nk细胞，可以通过基因修饰来表达插入其质膜中的car。如果这类car修饰的免疫细胞遇到表达或缀有car结合部分的适当靶标的其它细胞或组织结构，则在car结合部分与靶抗原结合后，car修饰的免疫细胞与靶标交联。交联导致诱导通过car信号转导链的信号通路，这将改变car移植的免疫细胞的生物学性质。例如，在效应cd4+和cd8+t细胞中触发car会激活典型的效应子功能，如分泌裂解化合物和细胞因子，最终导致杀伤相应的靶细胞。相反，在基因修饰的调节性t细胞(treg)中的car激活导致treg特异性免疫调节和抑制机制的激活，如白介素(il)-10或肿瘤生长因子β(tgf-β)的分泌。用嵌合抗原受体(car)工程改造的免疫细胞进行过继转移目前被认为是治疗原本无法治愈的恶性、感染性或自身免疫性疾病的一种非常有前景的治疗选择。迄今为止，两种car-t细胞治疗剂已获得市场批准用于治疗b细胞源性的恶性肿瘤，证明了这种方法的临床可行性。
3.然而，常规car技术伴随着许多关键性问题，需要解决这些问题之后才能将这种治疗模式广泛应用于临床治疗。首先，必须解决几个安全性问题。迄今，用常规car工程改造的t细胞在输注到患者体内后难以控制其免疫应答。严重不良事件率高(titov等2018)。尤其是，正常组织上意外的靶基因表达可能引起工程改造的t细胞对抗正常细胞的迅速而剧烈的免疫反应，这会导致严重的副作用(lamers等2006，morgan等2010)。此外，由于car-t细胞是新的一类自放大型(self-amplifying)细胞药物，输注的t细胞在存在重肿瘤负荷的情况下会发生剧烈扩增，导致肿瘤溶解综合征、细胞因子释放综合征和巨噬细胞活化综合征(brudno和kochenderfer 2016，maude等2014)。常规car技术的另一个缺点是工程改造的t细胞重新靶向单一抗原的限制。这样的单一治疗方法意味着在治疗期间发展出失去靶抗原的肿瘤逃逸变体的风险。在临床试验中已经观察到，在常规car t细胞疗法下几个月后出现肿瘤逃逸变异(grupp等2013，sotillo等2015)。总而言之，这些障碍将car-t细胞的应用局限在很少的适应症上。实际上，迄今为止，临床有效性的实例限于靶向cd19和bcma的car-t细胞。
4.模块化的“通用(universal)”car-t(unicar)方法可以通过将car的抗原识别和激活结构域分成两个独立的操作单元来克服这些限制。t细胞经工程改造以表达具有识别标签的通用结合结构域的car(cartellieri等2016)。抗原特异性由可溶性衔接蛋白提供，该衔接蛋白由与通用car识别的标签融合的抗原结合结构域组成。cartellieri等描述了体外和体内对cd33和/或cd123阳性的急性骨髓性白血病细胞的处理。
5.wo 2012/082841 a2公开了通用抗标签嵌合抗原受体表达型t细胞以及细胞相关疾病例如癌症的治疗方法。此外，wo 2013/044225 a1公开了一种由t细胞表达的通用免疫受体，用于靶向多样和多种抗原。这两种方法都描述了使用表达通用抗标签免疫受体的修饰的t细胞。通过额外应用结合细胞表面表面抗原并携带相应标签的可溶性模块，可以使这些t细胞重定向于疾病相关的这些表面抗原。wo 2016/030414 a1提供了一种基因修饰的免疫细胞，其允许采用基于核蛋白的内源性标签，以安全有效的方式针对多种疾病进行重定向。
6.wo 2018/224660 a1描述了用于通用抗标签嵌合抗原受体表达型t细胞的靶模块，其包含化学合成的对人表面蛋白质或蛋白质复合体特异性的肽结合单元，以及该靶模块的优点，特别是快速和容易制备、改善的稳定性和良好的药学性质。wo 2016/168773 a2公开了一种用于car-t细胞的基于肽新表位(pne)的开关，其包含受体结合配偶体、特别是肽抗原，靶结合部分、特别是可溶性t细胞受体或其一部分或抗体片段；和接头。
7.wo 2015/057834a1公开了开关型car-t细胞和用于car-t细胞的开关，该开关包含受体结合配偶体，特别是肽抗原。该肽抗原可以是天然的、非天然的或人工的肽，特别是酵母转录因子gcn4或其同源物。此外，该开关包含靶结合部分，特别是抗体或抗体片段，优选选自抗her2抗体、抗bcma抗体、抗cd19抗体、抗cea抗体及其片段，和接头。
8.yu等描述了不同代的car-t细胞以及降低毒性、包括所谓的细胞因子释放综合征和瘤外中靶(on-target off-tumour)毒性(yu等2019)的策略，特别是开关型car-t细胞，特别是利用自杀基因、例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)或诱导型半胱天冬酶9(icasp9)基因的开关型car-t细胞，或使用结合fitc的car-t细胞和包含fitc的小分子和针对肿瘤靶标的抗体特别是西妥昔单抗、曲妥珠单抗或利妥昔单抗的通用car体系。
9.此外，yu等公开了pd-1抑制型car-t细胞(icar)，并指出了i-car-t细胞的缺点，特别是icar-t细胞只识别在肿瘤上不存在或下调并由靶外组织表达的组织特异性抗原，无法对icar-t细胞进行时间和空间控制。
10.wo 2018/078066 a1公开了一种抗接头/标记表位(抗-lle)的胞外car，其包含接头/标记表位结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域，其中胞外接头/标记表位结合结构域与靶细胞结合分子(tcbm)结合，该靶细胞结合分子包含抗原结合部分(abm)、天然存在的标记表位(lam)和接头(lim)，其中abm特异性结合靶细胞上的抗原、优选肿瘤抗原，其中接头连接abm和lam并形成接头/标记表位，其中细胞外lle结合结构域比天然存在的lam更优先结合lle。
11.尽管使用嵌合抗原受体修饰的t细胞(car-t)在血液系统恶性肿瘤中取得了引人瞩目的治疗成就，但鉴于实性肿瘤的异质性和免疫抑制环境，包括肿瘤细胞对抑制性免疫检查点如pd-l1或pd-l2的表达，靶向实性肿瘤仍然具有挑战性。临床前模型表明，将car-t疗法与靶向pd-1/pd-l1轴的检查点抑制剂相结合可能是增强car-t在实性肿瘤中的抗癌活性的有希望的策略，并且正在进行的i期试验正在临床评估这种策略(grosser等2019)。然而，经常观察到对检查点阻断的原发性和获得性抗性限制了其广泛的适用性和效力(肿瘤逃逸变体)。此外，缺乏特异性导致频繁发生影响数个器官的免疫相关不良事件。
12.rafiq等公开了一种在体内通过car-t细胞靶向递送pd-1阻断型scfv以增强抗肿瘤效力的方法(rafiq等2018)。此外，rafiq等描述了与包括car-t细胞和免疫检查点阻断抑
制剂、特别是pd-1阻断型mab的联合疗法的比较；以及car-t细胞疗法的效力增加，特别是通过用针对cd19或muc16
ecto
的car构建体处理增加了pd-l1荷瘤小鼠的生存期，该构建体包含从pd-1阻断型mab的可变重链和轻链获得的c-myc标签的scfv。
13.另外，rafiq等公开了防止pd-1诱导的car-t细胞应答减弱的替代方法，方法包括其中pd-1的细胞外结构域与激活信号转导结构域相连的嵌合开关受体的共表达，或car-t细胞的共修饰以表达显性负性的pd-1受体，以及这些方法的缺点，特别是保护仅限于该t细胞本身。cherkassky等(cherkassky等2017)也公开了后一种表达显性负性pd-1受体的方法。
14.prosser等描述了表达pd-1和cd28嵌合受体的修饰的原代人cd8+细胞毒性t细胞，该细胞通过使用cd28的跨膜和细胞质结构域将pd-1转化为共刺激受体而产生，同时保留了该受体结合pd-l1的能力，以逆转抑制性肿瘤pd-l1对t细胞的效应(prosser等2012)。此外，prosser等公开了pd-l1肿瘤对该修饰的t细胞的共刺激。不利的是，具有嵌合pd-1:cd28受体的该修饰的t细胞在暴露于pd-l1或pd-l2阳性细胞时总是会收到共刺激信号。由于pd-l1不仅由肿瘤细胞表达，而且由抗原呈递细胞表达，因此这种慢性刺激增加了发展出肿瘤逃逸变体和非特异性效应(即自身免疫)的风险以及致癌性转化的风险。
15.本发明的目的是提供一种克服现有技术的缺点的方法。
16.该目的通过一种靶向模块来解决，所述靶向模块包含
17.i)至少一个pd-l1和/或pd-l2结合结构域，
18.ii)标签结合结构域或标签；
19.用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，优选用于治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病；
20.其中所述靶向模块与包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞联合施用，
21.其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，
22.其中
[0023]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0024]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0025]-第三结构域是信号转导结构域，
[0026]
其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。
[0027]
有利地，与开关型嵌合抗原受体联合使用的本发明靶向模块主动靶向肿瘤细胞表达的pd-l1和/或pd-l2，并且能够诱导显著的抗肿瘤应答，其中所述开关型嵌合抗原受体的抗肿瘤应答仅在所述靶向模块的存在下才被诱导。停止或中断施用所述靶向模块可以立即中断该效应。进一步有利地，本发明的靶向模块的药代动力学和药效学半衰期短，优选在10分钟至5小时的范围内，提供了所介导的免疫应答的迅速而可逆的关闭机制。有利地，本发明的靶向模块的毒性低，这是快速关闭机制的结果，可以通过在体外实验中在不补充靶向模块时pd-l1低表达细胞得以存留来证明。
[0028]
如本文所用的术语“靶向模块”是指具有至少两个不同结构域的分离蛋白，其中每个结构域分别对靶标或一组统一的靶标具有特异性，其中至少一个结构域、特别是pd-l1
和/或pd-l2结合结构域对靶细胞具有特异性；并且一个结构域、特别是所述标签结合结构域或标签对开关型嵌合抗原受体具有特异性。
[0029]
根据本发明，所述靶向模块包含至少一个pd-l1结合结构域、或至少一个pd-l2结合结构域、或至少一个pd-l1结合结构域和至少一个pd-l2结合结构域。
[0030]
如本文所用的“pd-l1”(程序性死亡配体1)是指根据seq id no.1的跨膜蛋白，其在人类中由cd274或pdcd1lg1基因编码并且是pd-1的配体。如本文所用的“pd-l2”(程序性死亡1配体2)是指根据seq id no.2的跨膜蛋白，其在人类中由cd273或pdcd1lg2基因编码并且是pd-1的配体。
[0031]
如本文所用的术语“结构域”是指蛋白质序列的一部分，其可以独立于蛋白质的其余部分而存在和发挥作用。
[0032]
如本文所用的术语“特异性”是指抗体或抗体片段或蛋白质、肽或低分子量有机配体识别和结合存在于样本中的结合配偶体(例如肿瘤抗原)蛋白、但基本上不识别或结合样本中的其它分子的能力。
[0033]
如本文所用的术语“结合”是指非共价结合，特别是离子键、氢键、范德华力和/或疏水性相互作用。
[0034]
如本文所用的术语“联合施用”是指一种处理，其中所述靶向模块在施用所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞之前、同时和/或之后施用。
[0035]
在实施方式中，在施用所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞之前优选1小时至2天、更优选4至24小时，单独施用所述靶向模块。有利地，在施用所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞之前施用所述靶向模块，刺激了所述开关型嵌合抗原受体并增加了携带所述开关型嵌合抗原受体的效应细胞的扩增以及它们在靶标部位的积累。
[0036]
在其它实施方式中，所述靶向模块与所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞同时施用。
[0037]
在其它实施方式中，所述靶向模块在施用所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞后优选3天至30天的范围内施用。此外，附加的此类剂量的所述靶向模块可以在间歇期后施用，以重新激活携带所述开关型嵌合抗原受体的效应细胞。
[0038]
如本文所用的术语“开关型嵌合抗原受体”是指人工嵌合融合蛋白，特别是包含标签结合结构域或标签、细胞外铰链和跨膜结构域以及信号转导结构域的受体(图1)。所述结构域可以源自于不同的来源，因此，所述受体被称为嵌合的。有利地，所述受体可以由所述标签结合结构域或标签与不同的靶向模块结合。
[0039]
有利地，包含编码开关型嵌合抗原受体(car)的核苷酸序列的细胞表达开关型car，所述开关型car对所述靶向模块的标签结合结构域或标签具有结合特异性，而所述靶向模块又与靶细胞上的pd-l1和/或pd-l2结合。
[0040]
术语“自身免疫性疾病”是指身体对正常存在于体内的物质和组织的异常免疫应答(自身免疫)。
[0041]
在实施方式中，所述靶向模块是单体或二聚体形式，优选单体形式。
[0042]
在其它实施方式中，所述靶向模块是单价或二价的。
[0043]
在一些实施方式中，本发明的靶向模块是二价的并且包含一个pd-l1结合结构域
和一个pd-l2结合结构域。
[0044]
优选地，所述pd-l1结合结构域是抗体或抗体片段。
[0045]
优选地，所述pd-l2结合结构域是抗体或抗体片段。
[0046]
如本文所用的术语“抗体”是指通过fab的可变区来结合抗原的蛋白质。所述片段抗原结合(fab)片段是抗体上与抗原结合的区域。它由重链(vh)和轻链(v
l
)各自的一个恒定结构域和一个可变结构域组成。如本文所用的术语“抗体片段”是指至少包含抗体的轻链或重链的可变结构域的蛋白质。在一个实施方式中，抗体片段选自单链可变片段(scfv)、单链抗体、f(ab')2片段、fab片段、由fab表达文库产生的片段、或单域抗体(纳米抗体)。
[0047]
如本文所用的术语“单链可变片段(scfv)”是指包含共价连接的抗体轻链和重链的可变结构域的人工抗体片段。在一个实施方式中，抗体的轻链(v
l
)和重链(vh)的可变结构域通过10至25个氨基酸的短肽共价连接。在一个进一步的实施方式中，所述短肽连接vh的n端和v
l
的c端，反之亦然。
[0048]
在实施方式中，所述抗体获自动物物种，优选获自哺乳动物如人、猿猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、马、牛、绵羊、山羊、猪、狗或猫。优选地，所述抗体或抗体片段是人、人源化或去免疫化的抗体。人源化抗体可以用多种方式制备，例如通过表面重塑(resurfacing)和cdr移植。在表面重塑的情况下，利用分子建模、统计分析和诱变的组合，对所述抗体表面上的所有非cdr区域进行修饰，使其变得与目标生物体的抗体表面相似。在cdr移植中，将本发明的cdr区被引入已知的人框架区，该框架区与原来的框架区序列相似。去免疫化抗体可以通过使基于计算机(in silico)肽-mhc亲和力所预测的赋予免疫原性热点的残基发生特异性突变来获得。
[0049]
在实施方式中，所述抗体或抗体片段是多克隆抗体、单克隆抗体或嵌合抗体，其中非人抗体的抗原结合区通过包括计算机设计的重组dna技术转移到人抗体的框架中。
[0050]
在实施方式中，针对选定的标签或抗原的抗体可通过注射表达特定蛋白质的细胞、编码该蛋白质的dna或rna、蛋白质本身或保留该蛋白质的免疫原性性质的任何部分、片段或寡肽来免疫接种各种宿主而产生，所述宿主包括但不限于山羊、兔、大鼠、小鼠、人类。
[0051]
在实施方式中，所述pd-l1结合结构域选自pd-1、bms-936559、阿替利珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿维单抗(avelumab)、3f2.1及其片段。优选地，所述pd-l1结合结构域是bms-936559、阿替利珠单抗或德瓦鲁单抗的scfv片段。
[0052]
如本文所用的术语“片段”是指由至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的pd-l1结合结构域氨基酸序列组成的蛋白质。
[0053]
如本文所用的术语“pd-1”(程序性细胞死亡蛋白1)是指细胞表面上的一种蛋白质，其通过抑制t细胞炎症活性来下调免疫系统和促进自身耐受性，从而在调节免疫系统对人体细胞的应答中发挥作用。优选地，所述pd-l1结合结构域包含与seq id no.3或其片段具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列，其中所述至少一个序列结合所述抗原pd-l1和pd-l2。在实施方式中，seq id no.3的片段包含pd-1的细胞外结构域。
[0054]
如本文所用的术语“bms-936559”是指特异性结合pd-l1的抗体。优选地，所述pd-l1结合结构域包含各自与以下序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列：seq id no.4和seq id no.5、或seq id no.67和seq id no.68、或
seq id no.69和seq id no.70、或seq id no.71和seq id no.72、或seq id no.73和seq id no.74、或seq id no.75和seq id no.76、或seq id no.77和seq id no.78、或seq id no.79和seq id no.80、或seq id no.81和seq id no.82、或seq id no.83和seq id no.84，其中所述至少一个序列结合抗原pd-l1。
[0055]
优选地，所述pd-l1结合结构域包含各自与seq id no.4和seq id no.5、或seq id no.77和seq id no.78具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列，其中所述至少一个序列结合抗原pd-l1。
[0056]
在实施方式中，所述pd-l1结合结构域包含各自与以下序列中的一个序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列：seq id no.85、seq id no.86、seq id no.87、seq id no.88、seq id no.89、seq id no.90、seq id no.91、seq id no.92、seq id no.93、seq id no.94、seq id no.95、seq id no.96、seq id no.97、seq id no.98、seq id no.99、seq id no.100、seq id no.101、seq id no.102、seq id no.103和seq id no.104。
[0057]
优选地，所述pd-l1结合结构域包含各自与seq id no.86或seq id no.97具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列。
[0058]
如本文所用的术语“阿替利珠单抗”是指特异性结合pd-l1的抗体。优选地，所述pd-l1结合结构域包含各自与seq id no.6和seq id no.7具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列，其中所述至少一个序列结合抗原pd-l1。
[0059]
在实施方式中，所述pd-l1结合结构域包含各自与seq id no.57或seq id no.65具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列。
[0060]
如本文所用的术语“德瓦鲁单抗”是指特异性结合pd-l1的抗体。优选地，所述pd-l1结合结构域包含各自与seq id no.8和seq id no.9具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列，其中所述至少一个序列结合抗原pd-l1。
[0061]
在实施方式中，所述pd-l1结合结构域包含各自与seq id no.58或seq id no.66具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列。
[0062]
如本文所用的术语“阿维单抗”是指特异性结合pd-l1的抗体。优选地，所述pd-l1结合结构域包含各自与seq id no.61和seq id no.62、或seq id no.105和seq id no.106具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列，其中所述至少一个序列结合抗原pd-l1。
[0063]
在实施方式中，所述pd-l1结合结构域包含各自与seq id no.107或seq id no.108具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列。
[0064]
如本文所用的术语“3f2.1”是指特异性结合pd-l1的抗体。优选地，所述pd-l1结合结构域包含各自与seq id no.63和seq id no.64具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列，其中所述至少一个序列结合抗原pd-l1。
[0065]
如本文所用的术语“标签”是指一种肽序列，其附着于肽或蛋白质以使其能够与特定的原子、离子或分子、特别是标签结合结构域结合。
[0066]
在实施方式中，所述pd-l2结合结构域选自特异性结合pd-l2的抗体或其片段。
[0067]
在实施方式中，所述标签是肽表位标签。在其它实施方式中，所述标签包含10至20个氨基酸。
[0068]
在实施方式中，所述肽表位标签是myc-标签、his-标签、来自酵母转录因子gcn4的短线性肽序列，后者优选是根据seq id no.10、seq id no.11的序列或其突变体；亮氨酸拉链序列，优选synzip 1至synzip 48、batf、fos、atf4、atf3、bach1、jund、nfe2l3、heptad(reinke等2010)，根据seq id no.12或seq id no.13的序列或其突变体；或来自人核蛋白、优选来自人la蛋白的短线性肽序列。优选地，来自人la蛋白的肽表位标签是根据seq id no.14的人la表位e5b9或根据seq id no.15或seq id no.16的e7b6，最优选根据seq id no.14的人la表位e5b9或根据seq id no.16的e7b6。
[0069]
如本文所用的术语“突变体”是指与所指定的肽或蛋白质具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性的肽或蛋白质。有利地，所述突变体能够具有所指定的肽或蛋白质的一种或多种活性，特别是与所述肽表位标签一样结合相同的标签结合结构域。
[0070]
在实施方式中，突变体是肽或蛋白质的截短形式。如本文所用的术语“截短形式”是指缩短的肽或蛋白质，其与所指定的肽或蛋白质具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选具有至少85％的链长和100％的序列同一性、最优选至少95％的链长和100％的序列同一性。有利地，所述截短形式具有所指定的肽或蛋白质的至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的活性。
[0071]
如本文所用的术语“核蛋白”是指在细胞核中发现的蛋白质。
[0072]
在实施方式中，his-标签是由组氨酸残基组成的氨基酸序列，优选在6至14个组氨酸残基的范围内。
[0073]
有利地，作为来自核抗原的肽序列的标签在生理条件下不能被天然蛋白质环境中的相应标签结合结构域接近和结合。进一步有利的是，所述标签不是免疫原性的。这导致将表达car的免疫细胞不受控制的异位中靶(on-target off-site)毒性的风险降至最低，所述风险如释放毒性水平的细胞因子，这也被另称为细胞因子风暴或细胞因子释放综合征(crs)。
[0074]
在一个优选的实施方式中，所述肽表位标签是myc-标签、his-标签、来自酵母转录因子gcn4的短线性肽序列，后者优选是根据seq id no.10、seq id no.11的序列；亮氨酸拉链序列，优选synzip 1至synzip 48、batf、fos、atf4、atf3、bach1、jund、nfe2l3、heptad(reinke等2010)，根据seq id no.12或seq id no.13的序列；或来自人核蛋白、优选来自人la蛋白的短线性肽序列。优选地，来自人la蛋白的肽表位标签是根据seq id no.14的人la表位e5b9或根据seq id no.15或seq id no.16的e7b6，最优选根据seq id no.14的人la表位e5b9或根据seq id no.16的e7b6。
[0075]
在其它实施方式中，所述标签结合结构域是抗体或抗体片段。
[0076]
在实施方式中，所述标签结合结构域与来自人核la蛋白的标签结合，优选所述标签结合结构域是抗体或抗原结合片段，其中所述标签结合结构域构成抗la表位scfv，更优选抗la表位scfv包含根据以下序列或与序列seq id no.19或seq id no.21之一具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性的序列的v
l
：
[0077]
divmtqspdslavslgeratincx1ssqsllnsrtx2knylawyqqkp gqppklliywastrx3sgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyy ckqsynlx4tfgggtkvelk(seq id no.17)，
[0078]
其中x1至x4是可变氨基酸残基，优选选自蛋白质α氨基酸残基。
[0079]
在一些实施方式中，所述可变氨基酸残基x1至x4选择如下：
[0080]
x1选自极性和/或带正电荷的残基，例如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸；优选赖氨酸或精氨酸；
[0081]
x2优选选自赖氨酸和脯氨酸；
[0082]
x3选自极性和带电荷的残基，例如天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸，优选谷氨酸和赖氨酸；
[0083]
x4选自疏水性残基，例如异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和色氨酸；优选亮氨酸或脯氨酸。
[0084]
在其它实施方式中，所述标签结合结构域是抗体或抗原结合片段，其中所述标签结合结构域构成抗la表位scfv，所述抗la表位scfv包含与序列seq id no.18或seq id no.20之一具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性的序列。
[0085]
优选地，所述标签结合结构域构成抗la表位scfv，所述抗la表位scfv包含与根据seq id no.18(vh)和seq id no.19(v
l
)的序列、或根据seq id no.20(vh)和seq id no.21(v
l
)的序列各自具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性的序列。
[0086]
最优选地，所述标签结合结构域构成根据seq id no.18(vh)和seq id no.19(v
l
)的抗la 5b9 scfv，或根据seq id no.20(vh)和seq id no.21(v
l
)的抗la 7b6 scfv。
[0087]
在其它实施方式中，本发明的靶向模块还包含效应细胞结合结构域，其中所述效应细胞结合结构域特异性结合人cd3链、人t细胞受体(tcr)或人cd16上的表位。
[0088]
如本文所用的术语“效应细胞结合结构域”是指肽或蛋白质，其特异性结合效应细胞上的蛋白质或蛋白质复合体(抗原)。如本文所用的术语“蛋白质复合体”是指一组两个或更多个相关蛋白链。
[0089]
如本文所用的术语“效应细胞”是指执行免疫反应的免疫细胞，特别是具有细胞溶解、吞噬和/或免疫抑制活性的免疫细胞。优选地，所述效应细胞是t细胞、自然杀伤(nk)细胞或巨噬细胞。有利地，所述靶向模块通过与所述结构域结合并超过关于这样的相互作用的所需数量的某个阈值来激活所述效应细胞。
[0090]
优选地，所述效应细胞结合结构域是抗体或抗体片段。
[0091]
在一个实施方式中，所述效应细胞结合结构域特异性结合人cd3上的表位，解离常数kd高达10-8
m。通常，所述效应细胞结合结构域的亲和力，特别是解离常数kd，是用表面等离子共振测量或基于流式细胞术的细胞结合测定来确定的。
[0092]
优选地，所述效应细胞结合结构域以低亲和力特异性结合人cd3上的表位，优选解离常数kd在10-4
m至10-8
m范围内。
[0093]
在实施方式中，所述效应细胞结合结构域包含以下序列中的至少一个：
[0094]
i)根据seq id no.22或24的v
l
和/或
[0095]
ii)根据seq id no.23或25的vh。
[0096]
在实施方式中，所述效应细胞结合结构域包含与seq id no.22或24和/或seq id no.23或25具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列，其中所述至少一个序列结合抗原cd3。
[0097]
优选地，所述人源化抗人cd3效应细胞结合结构域包含根据seq id no.25的重链(vh)的可变区和根据seq id no.24的轻链(v
l
)的可变区，例如以scfv的形式。优选地，vh和v
l
通过甘氨酸丝氨酸接头连接。
[0098]
在一些实施方式中，所述效应细胞结合结构域是人源化抗tcr结构域并且优选包含以下序列中的至少一个：
[0099]
i)根据seq id no.26的v
l
和/或
[0100]
ii)根据seq id no.27的vh。
[0101]
在实施方式中，所述效应细胞结合结构域包含与根据seq id no.26或seq id no.27的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列，其中所述至少一个序列结合抗原tcr。
[0102]
在一些实施方式中，所述效应细胞结合结构域是人源化抗cd16a结构域并且优选包含以下序列中的至少一个：
[0103]
i)根据seq id no.28的v
l
和/或
[0104]
ii)根据seq id no.29的vh，
[0105]
优选地，根据seq id no.28的v
l
和根据seq id no.29的vh。
[0106]
在一个实施方式中，所述效应细胞结合结构域包含与根据seq id no.28或seq id no.29的序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的序列同一性的至少一个序列，其中所述至少一个序列结合抗原cd16a。
[0107]
在实施方式中，所述至少一个pd-l1和/或pd-l2结合结构域和/或所述效应细胞结合结构域的可变区包含人源化氨基酸序列。
[0108]
在实施方式中，本发明的靶向模块的不同结构域通过接头彼此连接。所述接头包含优选10至20个氨基酸残基的短序列。在实施方式中，所述靶向模块包含柔性的肽序列，该序列的选择要使得所述结构域具有允许其表现出对效应细胞和靶细胞结合的特异性的三维折叠。优选的接头是具有结构(g
x
sy)的甘氨酸-丝氨酸接头，其中x和y选自1至10，优选1至5。最优选的是序列g4s1的1至10个重复。此外，优选由可以增加抗体衍生物的蛋白酶抗性的肽序列构成的接头。
[0109]
优选地，本发明的靶向模块作为融合蛋白来表达。
[0110]
在实施方式中，本发明的靶向模块包含选自共刺激配体、放射性核素、细胞死亡诱导化合物和半衰期延长结构域的其它结构域，优选igg1 fc、igg2 fc、igg3 fc、igg4 fc、hsa或其突变体。如本文所用的术语“突变体”是指与所述半衰期延长结构域具有至少85％的序列同一性、优选至少95％的序列同一性的蛋白质。有利地，所述突变体能够具有所指定的肽或蛋白质的一种或多种活性，特别是所述突变体像半衰期延长结构域一样延长半衰期。
[0111]
在优选的实施方式中，本发明的靶向模块包含选自共刺激配体、放射性核素、细胞死亡诱导化合物和半衰期延长结构域的其它结构域，优选igg1 fc、igg2 fc、igg3 fc、igg4 fc或hsa。
[0112]
在实施方式中，本发明的靶向模块的长度在20至1600个氨基酸的范围内。
[0113]
在一些实施方式中，本发明的靶向模块用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，其中所述靶向模块与包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞以及至少一种其它靶向模块联合施用，其中所述至少一种其它靶向模块包含至少一个靶细胞结合结构域和标签结合结构域或标签，其中所述至少一个靶细胞结合结构域是与选自下列的表面抗原结合的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体：cd2、
cd3、cd4、cd8、cd10、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd52、cd90、cd99、cd123、cd133、cd150、cd181、cd182、cd184、cd223、cd229、cd269(bcma)、cd273、cd274、cd276、cd279、cd319、cd366和cd371，白介素受体，尤其优选il-8rα(cxcr1)、il-8rβ(cxcr2)、il-11rα、il-11rβ、il-13rα1和il-13rα2，cxcr4，c-met，间皮素，表皮生长因子受体家族成员及其突变体，尤其优选erbb1、erbb2、erbb3、erbb4或其突变体，肿瘤坏死因子受体超家族成员，肝配蛋白，肝配蛋白受体，尤其优选epha1-10、epha5或ephb1-6，前列腺特异性抗原前列腺干细胞抗原(psca)和前列腺特异性膜抗原(psma)，胚胎抗原癌胚抗原(cea)和胎儿乙酰胆碱受体，血管内皮生长因子家族成员，上皮细胞粘附分子epcam，甲胎蛋白afp，细胞间粘附分子家族成员，粘蛋白家族成员，促卵泡激素受体(fshr)，人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，叶酸结合蛋白fbp，叶酸受体，生长抑素受体，nkg2d受体的配体，细胞因子受体，上皮糖蛋白家族成员，双唾液酸神经节苷脂，磷脂酰肌醇蛋白聚糖，g蛋白偶联受体，碳酸酐酶家族成员，糖抗原家族成员，notch配体，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、糖蛋白a33，鸟苷酸环化酶2c和肿瘤特异性聚糖；包括所指定的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体的突变体和类似物，其中本发明的靶向模块和所述至少一种其它靶向模块包含不同的靶细胞结合结构域、以及相同的标签结合结构域或标签。
[0114]
如本文所用的术语“靶细胞结合结构域”是指肽、蛋白质或低分子量有机配体，其特异性结合靶细胞、优选癌细胞、t细胞、感染细胞或病原体或寄生虫表面上的蛋白质或蛋白质复合体(抗原)。
[0115]
如本文所用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白质或肽的序列的最大氨基酸数量没有限制。
[0116]
如本文所用的术语“低分子量有机配体”是指分子量最大为10kda、优选最大为3kda的有机分子，其特异性结合靶细胞、优选癌细胞、t细胞、感染细胞或病原体或寄生虫表面上的蛋白质或蛋白复合体(抗原)。
[0117]
术语“靶细胞结合结构域”还包括可溶性t细胞受体，其由t细胞受体(tcr)的α和β或γ和δ链、其片段或突变体构成。这类tcr衍生的结合部分识别并结合由i和ii类人白细胞抗原(hla)蛋白质复合体呈递的肽。例如，但不限于，对如下列蛋白质所衍生的肽特异性的tcr：egfr家族、生存素、sry样高迁移率族蛋白(sry-like high motility group box)(sox)家族、黑色素瘤相关抗原(例如自身免疫原性癌症/睾丸抗原ny-eso-1，黑色素瘤抗原家族a magea的成员，黑色素瘤prame中优先表达的抗原)、和白血病相关抗原(例如wilms肿瘤基因1wt1)。
[0118]
如本文所用的术语“突变体”是指与所指定的抗体、抗体片段、蛋白质或肽具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性的肽或蛋白质。有利地，所述突变体结合与所指定的抗体、抗体片段、蛋白质或肽相同的抗原。
[0119]
如本文所用的术语“类似物”是指与所指定的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体具有高度结构同一性的分子，优选至少一个原子、原子团、官能团或子结构被另一原子团、例如羟基代替。在实施方式中，生长抑素(srif14)的类似物是奥曲肽(octreotide)或帕瑞肽(pasireotide)。有利地，所述类似物结合与所指定的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体相同的抗原。
[0120]
在实施方式中，所指定的抗体、抗体片段、蛋白质或肽的类似物包含选自d氨基酸、假肽键、氨基醇、非蛋白氨基酸、非天然氨基酸、具有修饰侧链的氨基酸和/或环状蛋白质的修饰。有利地，这些类似物显示出增加的稳定性。
[0121]
在其它实施方式中，所述靶细胞结合结构域是由t细胞受体(tcr)的α和β或γ和δ链组成的可溶性t细胞受体。
[0122]
在优选的实施方式中，所述至少一种其它靶向模块包含至少一个靶细胞结合结构域和标签结合结构域或标签，其中所述至少一个靶细胞结合结构域是与选自下列的表面抗原结合的抗体或抗体片段：cd2、cd3、cd4、cd8、cd10、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd52、cd90、cd99、cd123、cd133、cd150、cd181、cd182、cd184、cd223、cd229、cd269(bcma)、cd273、cd274、cd276、cd279、cd319、cd366和cd371，白介素受体，尤其优选il-8rα(cxcr1)、il-8rβ(cxcr2)、il-11rα、il-11rβ、il-13rα1和il-13rα2，cxcr4，c-met，间皮素，表皮生长因子受体家族成员，尤其优选erbb1、erbb2、erbb3或erbb4；肿瘤坏死因子受体超家族成员，肝配蛋白，肝配蛋白受体，尤其优选epha1-10、epha5或ephb1-6，前列腺特异性抗原前列腺干细胞抗原(psca)和前列腺特异性膜抗原(psma)，胚胎抗原癌胚抗原(cea)和胎儿乙酰胆碱受体，血管内皮生长因子家族成员，上皮细胞粘附分子epcam，甲胎蛋白afp，细胞间粘附分子家族成员，粘蛋白家族成员，促卵泡激素受体(fshr)，人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，叶酸结合蛋白fbp，叶酸受体，生长抑素受体，nkg2d受体的配体，细胞因子受体，上皮糖蛋白家族成员，双唾液酸神经节苷脂，磷脂酰肌醇蛋白聚糖，g蛋白偶联受体，碳酸酐酶家族成员，糖抗原家族成员，notch配体，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、糖蛋白a33，鸟苷酸环化酶2c和肿瘤特异性聚糖，其中本发明的靶向模块和所述至少一种其它靶向模块包含不同的靶细胞结合结构域、以及相同的标签结合结构域或标签。
[0123]
在其它实施方式中，所述至少一种其它靶向模块包含两个结合表面抗原的靶细胞结合结构域，所述表面抗原选自psca和psma、cd19和cd20、cd19和cd22、cd19、cd20和cd22、cd19和cd123、cd33和cd123、cd33和cd99、cd33和cd366、cd123和cd366、cd123和cd371、cd366和cd371、erbb-1和erbb-2、psca和erbb-2、psma和cea、il-13rα2和erbb-2、cd38和cd269、间皮素和粘蛋白16。
[0124]
优选地，本发明的靶向模块包含根据seq id no.57至59的序列之一，更优选本发明的靶向模块由根据seq id no.57至59的序列之一组成。
[0125]
在优选实施方式中，本发明的靶向模块用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，其中在施用所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞以及至少一种其它靶向模块之后的优选3天至30天范围内，施用所述靶向模块。有利地，通过将所述靶向模块与其它靶向模块组合使用，其中在施用所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞以及所述其它靶向模块之后施用所述靶向模块，减少了pd-l1疗法的不良全身性效应。此外，附加的此类剂量的所述靶向模块可以在间歇期后施用，以重新激活携带所述开关型嵌合抗原受体的效应细胞。
[0126]
更优选地，本发明的靶向模块用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，其中在施用所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞之前的优选1小时至2天、更优选4至24小时单独施用所述至少一种其它靶向模块，并且在施用
所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞之后的优选3天至30天范围内施用本发明的靶向模块。此外，附加的此类剂量的所述靶向模块可以在间歇期后施用，以重新激活携带所述开关型嵌合抗原受体的效应细胞。
[0127]
本发明还包括核酸、载体或细胞，其包含编码本发明的靶向模块的核苷酸序列，用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，优选用于治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病；
[0128]
其中所述核酸、载体或细胞与包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞联合施用，其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，其中
[0129]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0130]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0131]-第三结构域是信号转导结构域，
[0132]
其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。
[0133]
根据本发明，所述核酸、载体和/或细胞是分离的。如本文所用的术语“分离的”是指从自然状态改变或去除。
[0134]
在实施方式中，所述核酸是cdna。如本文所用的术语“cdna”(互补dna)是指在逆转录酶催化的反应中，由单链rna、例如mrna合成的双链dna。在实施方式中，cdna是合成来源的。在其它实施方式中，与基因组dna相反，cdna源自于mrna，因此只含有外显子而没有内含子。
[0135]
所述载体优选是质粒、人工染色体、线性化dna或rna、病毒粒子、或含有稳定并入宿主细胞或宿主生物体基因组中的表达盒的其它载体。
[0136]
在实施方式中，所述细胞选自免疫细胞，优选具有细胞溶解、吞噬或免疫抑制活性的免疫细胞，如t细胞、自然杀伤(nk)细胞和巨噬细胞。在优选的实施方式中，所述细胞选自t细胞，包括α/β和γ/δt细胞或t细胞亚群，如干细胞记忆t细胞或中枢记忆t细胞、细胞毒性t细胞；或nk细胞。
[0137]
在实施方式中，所述核酸、载体或细胞还包含诱导型表达系统。在一些实施方式中，所述诱导型表达系统基于原核操纵子，包括但不限于lac操纵子、转座子tn10或四环素操纵子。在其它实施方式中，所述诱导型表达系统基于真核信号转导通路的组分，包括但不限于基于类固醇受体、雌激素受体、孕酮或金属硫蛋白的表达系统。
[0138]
在优选的实施方式中，所述诱导型表达系统选自(亦称rtta；tet systems，takara bio)、advanced(亦称rtta2
s-m2或rtta2-syn1；tet systems，takara bio)、3g(亦称rtta-v16；tet systems，takara bio)、(life technologies)或响应活化t细胞核因子(nfat)的启动子。
[0139]
如本文所用的术语“tet-on”是指至少包含四环素应答元件(tre)和反向四环素反式激活因子(rtta)蛋白或其变体的诱导型表达系统。如本文所用的术语“反向四环素反式激活因子(rtta)蛋白”是指一种蛋白，其如果被四环素或四环素衍生物、例如多西环素结合，能够结合tre上的操纵子(teto)。因此，将四环素或四环素衍生物引入该系统启动了基因产物的转录。在实施方式中，所述诱导型表达系统诱导编码开关型嵌合抗原受体的核苷
酸序列和/或编码本发明的靶向模块的核苷酸序列的转录，优选地，所述诱导型表达系统诱导编码本发明的靶向模块的核苷酸序列的转录。
[0140]
如本文所用的术语“变体”是指能够执行所述的核苷酸或所指定的氨基酸序列的一种或多种功能的核苷酸序列、肽或蛋白质。
[0141]
如本文所用的术语“衍生物”是指与所述的分子具有高度结构同一性的分子，优选相同的支架，其中至少一个原子、原子团、官能团或子结构被其它原子、原子团、官能团或子结构、例如羟基代替。有利地，所述衍生物能够具有所指定的分子的一种或多种活性。
[0142]
有利地，tet-on系统优于tet-off系统，因为它对四环素或四环素衍生物更快的响应性并且它被四环素或四环素衍生物激活而不是抑制。
[0143]
在实施方式中，rtta蛋白是rtetr(反向四环素阻遏物)的融合蛋白、大肠杆菌(escherichia coli)的tetr(四环素阻遏物)的突变形式、以及单纯疱疹病毒的毒粒蛋白16(vp16)的激活结构域。在优选实施方式中，rtta包括seq id no.30、seq id no.31或seq id no.32。
[0144]
如本文所用的术语“四环素应答元件(tre)”是指至少一个具有最小启动子的teto序列，通过增加其启动子下游的一个或多个基因的表达来响应所述rtta蛋白的结合。
[0145]
在实施方式中，tre由根据seq id no.33的19bp细菌teto序列的2至9个重复、优选7个重复组成，所述重复优选由间隔序列分隔，更优选由包含seq id no.34的间隔序列分隔。
[0146]
在优选的实施方式中，tre是seq id no.35。
[0147]
如本文所用的术语“tet-on advanced”是指基础表达降低并且对多西环素的敏感性增加的tet-on系统，其是人类密码子优化的并且包含三个最小转录激活结构域，对应于seq id no.31的rtta。
[0148]
如本文所用，术语“tet-on 3g”是指对多西环素的敏感性进一步增加的tet-on系统，对应于seq id no.32的rtta。
[0149]
如本文所用的术语“t-rex”是指其中目的基因侧接上游cmv启动子和两个teto2位点的系统。在没有四环素或四环素衍生物的情况下，tetr同源二聚体与每个teto2位点的结合抑制了基因表达。在针对所述tetr同源二聚体的四环素或四环素衍生物存在的情况下，tetr同源二聚体与teto2解离，导致目的基因的表达。
[0150]
如本文所用的术语“响应活化t细胞核因子(nfat)的启动子”是指天然存在于人类细胞核中的启动子，其被活化t细胞核因子(nfat)结合，从而启动了基因产物的转录。如本文所用的术语“活化t细胞核因子(nfat)”是指具有一个用于转录的dna结合结构域和两个用于被钙调神经磷酸酶激活的钙调神经磷酸酶结合结构域的转录因子。所述被钙调神经磷酸酶的激活是通过由钙调蛋白(钙传感器蛋白)激活丝氨酸/苏氨酸磷酸酶钙调神经磷酸酶而发生的。活化的钙调神经磷酸酶使nfat蛋白氨基末端中富含丝氨酸的区域(srr)和sp重复去磷酸化，导致构象变化，暴露出核定位信号，从而导致nfat核输入。
[0151]
在实施方式中，响应nfat的启动子由根据seq id no.36的30bp人nfat结合序列的2至12个重复、优选6个重复继以最小启动子组成，所述重复任选由间隔序列隔开。
[0152]
在实施方式中，所述最小启动子源自根据seq id no.37或seq id no.38的白介素2(il-2)启动子。
[0153]
在实施方式中，所述响应nfat的启动子具有seq id no.39或seq id no.40。
[0154]
在其它实施方式中，本发明的核酸、载体或细胞还包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列，
[0155]
其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，
[0156]
其中
[0157]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0158]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0159]-第三结构域是信号转导结构域，
[0160]
其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。
[0161]
本发明的另一个方面是核酸、载体或细胞，其包含
[0162]-诱导型表达系统，优选选自tet-on、tet-on advanced、tet-on3g、t-rex、或响应nfat的启动子，以及
[0163]-编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列，
[0164]
其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，
[0165]
其中
[0166]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0167]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0168]-第三结构域是信号转导结构域，以及
[0169]-编码本发明的靶向模块的核苷酸序列，
[0170]
其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。
[0171]
在实施方式中，所述诱导型表达系统诱导编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列和/或编码本发明的靶向模块的核苷酸序列的转录，优选地，所述诱导型表达系统诱导编码本发明的靶向模块的核苷酸序列的转录。
[0172]
本发明还包括包含本发明的靶向模块、本发明的核酸、载体或细胞的药物组合物，用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，优选用于治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病；
[0173]
其中所述药物组合物与包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞联合施用，其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，
[0174]
其中
[0175]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0176]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0177]-第三结构域是信号转导结构域，
[0178]
其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。
[0179]
所述药物组合物优选胃肠外施用，特别优选静脉内施用。在一个实施方式中，所述药物组合物以适合静脉内施用的形式存在。优选地，所述药物组合物是溶液、乳液或悬浮液。
[0180]
在实施方式中，所述药物组合物是可注射的缓冲溶液，包含浓度在1ng/ml至500mg/ml范围内、优选在5μg/ml至5mg/ml范围内的本发明的靶向模块、核酸、载体和/或细胞。
[0181]
在实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的稀释剂或载剂。在其它实施方式中，所述载剂选自水、缓冲水溶液、0.9％盐水溶液、5％葡萄糖、5％木糖醇、0.3％甘氨酸溶液、林格溶液、氨基酸溶液和类似的溶剂。在其它实施方式中，所述缓冲水溶液选自ph值在ph 5.0至ph 7.0范围内的组氨酸、琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾缓冲水溶液。在实施方式中，所述缓冲溶液的缓冲剂浓度在1mmol/l(mm)至500mm范围内，优选在5mm至20mm范围内，尤其优选在5mm至10mm范围内。在其它实施方式中，所述载剂包括氯化钠，优选其浓度在1mm至300mm范围内，尤其优选150mm。在实施方式中，所述药物组合物还包含稳定剂，优选其浓度在1mm至900mm范围内，尤其优选在50mm至600mm范围内。在实施方式中，所述稳定剂是蔗糖、海藻糖或l-甲硫氨酸。
[0182]
在一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。术语“药学上可接受的赋形剂”是指提供近似生理条件和/或增加稳定性的化合物，例如ph值调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等。在实施方式中，药学上可接受的赋形剂选自乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠和聚山梨醇酯80，优选聚山梨醇酯80在0.0001％(w/v)至1％(w/v)的范围内，尤其优选在0.001％(w/v)至0.1％(w/v)的范围内。
[0183]
在一个优选实施方式中，所述药物组合物包含剂量在25μg/天至100mg/天范围内、优选剂量在0.1mg/天至20mg/天范围内的靶向模块。
[0184]
在其它实施方式中，所述药物组合物是无菌的。通过常规公知的技术，包括但不限于无菌过滤，对所述药物组合物进行灭菌。
[0185]
在实施方式中，所述药物组合物用于给对象施用。
[0186]
在实施方式中，所述药物组合物在储存前冻干，或作为溶液储存在环境温度或以下，包括但不限于冷冻储存。
[0187]
在实施方式中，在施用于对象之前，所述药物组合物在输注和稳定化溶液中重构和/或稀释。用于重构或输注/稳定化的溶液可含有对所述药物组合物提到的任何组分或类似组分。
[0188]
本发明的另一个方面是一种药盒，所述药盒包含
[0189]
a)本发明的靶向模块，本发明的核酸、载体或细胞，和
[0190]
b)包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞，
[0191]
其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，
[0192]
其中
[0193]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0194]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0195]-第三结构域是信号转导结构域，
[0196]
其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。
[0197]
在实施方式中，所述标签是肽表位标签。在其它实施方式中，所述标签包含10至20个氨基酸。
[0198]
在实施方式中，所述肽表位标签是myc-标签、his-标签、来自酵母转录因子gcn4的短线性肽序列，后者优选是根据seq id no.10、seq id no.11的序列或其突变体；亮氨酸拉链序列，优选synzip 1至synzip 48、batf、fos、atf4、atf3、bach1、jund、nfe2l3、heptad(reinke等2010)，根据seq id no.12或seq id no.13的序列或其突变体；或来自人核蛋白、优选来自人la蛋白的短线性肽序列。优选地，所述来自人la蛋白的肽表位标签是根据seq id no.14的人la表位e5b9或根据seq id no.15或seq id no.16的e7b6，最优选根据seq id no.14的人la表位e5b9或根据seq id no.16的e7b6。
[0199]
在实施方式中，his-标签是由组氨酸残基组成的氨基酸序列，优选在6至14个组氨酸残基的范围内。
[0200]
在优选的实施方式中，所述肽表位标签是myc-标签、his-标签、来自酵母转录因子gcn4的短线性肽序列，后者优选是根据seq id no.10或seq id no.11的序列；亮氨酸拉链序列，优选synzip 1至synzip 48、batf、fos、atf4、atf3、bach1、jund、nfe2l3、heptad(reinke等2010)，根据seq id no.12或seq id no.13的序列；或来自人核蛋白、优选来自人la蛋白的短线性肽序列。
[0201]
在其它实施方式中，所述标签结合结构域是抗体或抗体片段。
[0202]
在实施方式中，所述标签结合结构域是与下列标签或序列结合的抗体或抗体片段：myc-标签、his-标签、来自酵母转录因子gcn4的短线性肽序列、亮氨酸拉链序列或来自人核蛋白的短线性肽序列。
[0203]
在实施方式中，所述标签结合结构域与来自人核la蛋白的标签结合，优选所述标签结合结构域是抗体或抗原结合片段，其中所述标签结合结构域构成抗la表位scfv，更优选抗la表位scfv包含根据以下序列或与序列seq id no.19或seq id no.21之一具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性的序列的v
l
：
[0204]
divmtqspdslavslgeratincx1ssqsllnsrtx2knylawyqqkpgqppklliywastrx3sgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyyckqsynlx4tfgggtkvelk(seq id no.17)，
[0205]
其中x1至x4是可变氨基酸残基，优选选自蛋白α氨基酸残基。
[0206]
在一些实施方式中，所述可变氨基酸残基x1至x4选择如下：
[0207]
x1选自极性和/或带正电荷的残基，例如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸和精氨酸；优选x1是赖氨酸或精氨酸；
[0208]
x2优选选自赖氨酸和脯氨酸；
[0209]
x3选自极性和带电荷的残基，例如天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸，优选谷氨酸和赖氨酸；
[0210]
x4选自疏水性残基，例如异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和色氨酸；优选z4选自亮氨酸或脯氨酸。
[0211]
在其它实施方式中，所述标签结合结构域是抗体或抗原结合片段，其中所述标签结合结构域构成抗la表位scfv，所述抗la表位scfv包含与序列seq id no.18或seq id no.20之一具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性的序列。
[0212]
优选地，所述标签结合结构域构成抗la表位scfv，所述抗la表位scfv包含与根据seq id no.18(vh)和seq id no.19(v
l
)的序列、或根据seq id no.20(vh)和seq id no.21(v
l
)的序列各自具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性的序列。
[0213]
最优选地，所述标签结合结构域构成根据seq id no.18(vh)和seq id no.19(v
l
)的抗la 5b9 scfv，或根据seq id no.20(vh)和seq id no.21(v
l
)的抗la 7b6 scfv。
[0214]
如本文所用的术语“细胞外铰链和跨膜结构域”是指与所述标签结合结构域或标签连接的柔性肽序列，其将所述开关型car锚定在细胞的细胞膜中并从该细胞的表面突出，以便与其特定的靶向模块最佳结合。
[0215]
在实施方式中，所述细胞外铰链和跨膜结构域选自人cd28分子、cd8a链、nk细胞受体、优选自然杀伤群nkg2d的铰链和跨膜结构域；或抗体恒定区的部分，及其组合。如本文所用的术语“其组合”是指不同铰链和跨膜结构域的组合。
[0216]
pinthus等2003、pinthus等2004和cartellieri等2016描述了人cd28分子的铰链和跨膜结构域在car中的用途(pinthus等2003，pinthus等2004，cartellieri等2016)。
[0217]
carpentino等、milone等和zhao等描述了人cd8α分子的铰链和跨膜结构域在car中的用途(carpentino等2009，milone等2009，zhao等2009)。
[0218]
zhang等2005和zhang等2006描述了nkg2d的铰链和跨膜结构域在car中的用途(zhang等2005，zhang等2006)。
[0219]
hombach等、frigault等和wang等描述了免疫球蛋白g1(igg)恒定区的部分的铰链和跨膜结构域的用途(hombach等2007，frigault等2015，wang等2007)。frigault等描述了igg4恒定区的铰链结构域的用途。
[0220]
细胞外铰链和跨膜结构域的组合的实例有但不限于，cd28细胞外铰链和跨膜结构域、cd8α细胞外铰链和跨膜结构域、igg1或igg4恒定区与cd28或cd137跨膜结构域组合。
[0221]
如本文所用的术语“信号转导结构域”是指一种肽序列，其通过表达所述开关型car的细胞(效应细胞)与人细胞表面蛋白或蛋白质复合体(靶细胞)的交联而将信号传送到细胞中。效应细胞和靶细胞之间的交联是由本发明的靶向模块介导的。
[0222]
在实施方式中，所述信号转导结构域选自：cd28、cd137(4-1bb)、cd134(ox40)、cd278(icos)、dap10和cd27的胞质区，程序性细胞死亡受体1(pd-1)，细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)，cd3链的胞质区，dap12，cd122(白介素-2受体β)、cd132(白介素-2受体γ)、cd127(白介素-7受体α)和cd360(白介素-21受体)，活化fc受体，及其突变体。
[0223]
如本文所用的术语“突变体”是指与所述信号转导结构域具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性的蛋白质。有利地，所述突变体以与所指定的信号转导结构域相同的方式通过表达所述开关型car的细胞(效应细胞)与人细胞表面蛋白或蛋白质复合体(靶细胞)的交联而将信号传送到细胞中。
[0224]
在实施方式中，突变体是截短的形式。如本文所用的术语“截短形式”是指缩短的蛋白质，其与所述信号转导结构域具有至少85％序列同一性、优选至少95％序列同一性、更优选具有至少85％的链长和100％的序列同一性、最优选至少95％的链长和100％的序列同一性。有利地，所述截短形式具有所指定的信号转导结构域的至少80％、优选至少90％、更优选至少95％的活性。
[0225]
hombach等、maher等和cartellieri等描述了cd28的胞质区作为car中的信号转导结构域的用途(hombach等2001，maher等2002，cartellieri等2016)。guedan等描述了cd28的胞质区的突变体作为信号转导结构域的用途(guedan等2020)。
[0226]
milone等和finney等描述了cd137(4-1bb)的胞质区作为信号转导结构域的用途
(finney等2004，milone等2009)。
[0227]
finney等以及hombach和abken描述了cd134(ox40)的胞质区作为car中的信号转导结构域的用途(finney等2004，hombach和abken 2011，hombach和abken 2013)。
[0228]
guedan等描述了cd278(icos)的胞质区作为信号转导结构域的用途(guedan等2018)。
[0229]
zhang等描述了dap10作为信号转导结构域的用途(zhang等2005)。
[0230]
fedorov等描述了程序性细胞死亡受体1(pd-1)和细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)作为car中的信号转导结构域的用途(fedorov等2013)。
[0231]
gong等和gade等描述了胞质区cd3链、特别是cd3ζ链作为car中的信号转导结构域的用途(gong等1999，gade等2005)。
[0232]
等描述了dap12作为car中的信号转导结构域的用途(等2015)。
[0233]
kagoya等描述了源自于白介素受体的信号转导链或基序作为car中的信号转导结构域的用途(kagoya等2018)。
[0234]
lamers等和kershaw等描述了活化fc受体、特别是fcε受体γ链作为信号转导结构域的用途(lamers等2004，kershaw等2006)。
[0235]
在优选的实施方式中，所述信号转导结构域选自：cd28、cd137(4-1bb)、cd134(ox40)、cd278(icos)、dap10和cd27的胞质区，程序性细胞死亡受体1(pd-1)，细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)，cd3链的胞质区，dap12，cd122(白介素-2受体β)、cd132(白介素-2受体γ)、cd127(白介素-7受体α)和cd360(白介素-21受体)，活化fc受体。
[0236]
在实施方式中，所述开关型嵌合抗原受体包含至少一个信号转导结构域，优选两个、三个、四个或更多个信号转导结构域，所述信号转导结构域尤其优选选自：cd28、cd137(4-1bb)、cd134(ox40)、cd278(icos)、dap10和cd27的胞质区，程序性细胞死亡受体1(pd-1)，细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)，cd3链的胞质区，dap12，cd122(白介素-2受体β)、cd132(白介素-2受体γ)、cd127(白介素-7受体α)、cd360(白介素-21受体)，活化fc受体，及其突变体。
[0237]
在优选的实施方式中，所述开关型嵌合抗原受体包含至少一个信号转导结构域，优选两个、三个、四个或更多个信号转导结构域，所述信号转导结构域尤其优选选自：cd28、cd137(4-1bb)、cd134(ox40)、cd278(icos)、dap10和cd27的胞质区，程序性细胞死亡受体1(pd-1)，细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)，cd3链的胞质区，dap12，cd122(白介素-2受体β)、cd132(白介素-2受体γ)、cd127(白介素-7受体α)和cd360(白介素-21受体)，活化fc受体。
[0238]
在其它实施方式中，所述开关型嵌合抗原受体包含第四结构域，其中所述第四结构域是所述受体的细胞外部分中的短肽接头，其可用于检测细胞表面上的所述嵌合抗原受体或刺激嵌合抗原受体t细胞。
[0239]
在其它实施方式中，所述第四结构域形成线性表位，用于单克隆抗体(mab)与所述第四结构域特异性结合。在一些实施方式中，所述第四结构域包含至少一个线性表位，优选根据seq id no.15或seq id no.16的e7b6。
[0240]
在一些实施方式中，所述第四结构域位于所述标签结合结构域或标签与所述细胞外铰链结构域或所述细胞外铰链结构域的组成部分之间。
[0241]
有利地，与非移植细胞相比，具有第四结构域的开关型car移植细胞可以被特异性刺激，从而优先增殖并存留更长时间，无论是在体外还是体内。更有利地，所述第四结构域还可用于从混合细胞群中纯化开关型car移植细胞、或阻抑开关型car移植细胞介导的免疫应答、以及消除体内的开关型car移植细胞。
[0242]
在其它实施方式中，所述开关型car包含信号肽。有利地，所述信号肽允许在效应细胞的细胞表面上表达。在一个实施方式中，所述信号肽位于所述开关型car核苷酸序列的n端，在所述标签结合域或标签前面。在一些实施方式中，所述信号肽以共翻译或翻译后的方式将蛋白质靶向分泌途径，并选自来自cd28、cd8α、il-2等蛋白质或人源抗体的重链或轻链的前导肽以避免免疫原性反应。
[0243]
在其它实施方式中，所述核酸是cdna。
[0244]
在实施方式中，所述核酸编码根据序列seq id no.41至48之一的开关型car。优选地，所述核酸是序列seq id no.49至56之一。
[0245]
在一些实施方式中，包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的细胞选自免疫细胞，优选具有细胞溶解、吞噬或免疫抑制活性的细胞，例如t细胞、自然杀伤(nk)细胞和巨噬细胞。在优选的实施方式中，所述细胞选自t细胞，包括α/β和γ/δt细胞或t细胞亚群，如干细胞记忆t细胞或中枢记忆t细胞、细胞毒性t细胞；或nk细胞。
[0246]
在实施方式中，所述药盒还包含至少一种其它靶向模块，其中所述至少一种其它靶向模块包含至少一个靶细胞结合结构域和标签结合结构域或标签，其中所述至少一个靶细胞结合结构域是与选自下列的表面抗原结合的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体：cd2、cd3、cd4、cd8、cd10、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd52、cd90、cd99、cd123、cd133、cd150、cd181、cd182、cd184、cd223、cd229、cd269(bcma)、cd273、cd274、cd276、cd279、cd319、cd366和cd371，白介素受体，尤其优选il-8rα(cxcr1)、il-8rβ(cxcr2)、il-11rα、il-11rβ、il-13rα1和il-13rα2，cxcr4，c-met，间皮素，表皮生长因子受体家族成员及其突变体，尤其优选erbb1、erbb2、erbb3、erbb4或其突变体，肿瘤坏死因子受体超家族成员，肝配蛋白，肝配蛋白受体，尤其优选epha1-10、epha5或ephb1-6，前列腺特异性抗原前列腺干细胞抗原(psca)和前列腺特异性膜抗原(psma)，胚胎抗原癌胚抗原(cea)和胎儿乙酰胆碱受体，血管内皮生长因子家族成员，上皮细胞粘附分子epcam，甲胎蛋白afp，细胞间粘附分子家族成员，粘蛋白家族成员，促卵泡激素受体(fshr)，人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，叶酸结合蛋白fbp，叶酸受体，生长抑素受体，nkg2d受体的配体，细胞因子受体，上皮糖蛋白家族成员，双唾液酸神经节苷脂，磷脂酰肌醇蛋白聚糖，g蛋白偶联受体，碳酸酐酶家族成员，糖抗原家族成员，notch配体，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、糖蛋白a33，鸟苷酸环化酶2c和肿瘤特异性聚糖；包括所指定的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体的突变体和类似物，其中本发明的靶向模块和所述至少一种其它靶向模块包含不同的靶细胞结合结构域、以及相同的标签结合结构域或标签。这样的药盒适合于避免肿瘤从免疫系统中逃逸。
[0247]
术语“靶细胞结合结构域”还包括可溶性t细胞受体，其由t细胞受体(tcr)的α和β或γ和δ链、其片段或突变体构成。
[0248]
在优选的实施方式中，所述药盒还包含至少一种其它靶向模块，其中所述至少一种其它靶向模块包含至少一个靶细胞结合结构域和标签结合结构域或标签，其中所述至少
一个靶细胞结合结构域是与选自下列的表面抗原结合的抗体或抗体片段：cd2、cd3、cd4、cd8、cd10、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd52、cd90、cd99、cd123、cd133、cd150、cd181、cd182、cd184、cd223、cd229、cd269(bcma)、cd273、cd274、cd276、cd279、cd319、cd366和cd371，白介素受体，尤其优选il-8rα(cxcr1)、il-8rβ(cxcr2)、il-11rα、il-11rβ、il-13rα1和il-13rα2，cxcr4，c-met，间皮素，表皮生长因子受体家族成员，尤其优选erbb1、erbb2、erbb3或erbb4；肿瘤坏死因子受体超家族成员，肝配蛋白，肝配蛋白受体，尤其优选epha1-10、epha5或ephb1-6，前列腺特异性抗原前列腺干细胞抗原(psca)和前列腺特异性膜抗原(psma)，胚胎抗原癌胚抗原(cea)和胎儿乙酰胆碱受体，血管内皮生长因子家族成员，上皮细胞粘附分子epcam，甲胎蛋白afp，细胞间粘附分子家族成员，粘蛋白家族成员，促卵泡激素受体(fshr)，人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，叶酸结合蛋白fbp，叶酸受体，生长抑素受体，nkg2d受体的配体，细胞因子受体，上皮糖蛋白家族成员，双唾液酸神经节苷脂，磷脂酰肌醇蛋白聚糖，g蛋白偶联受体，碳酸酐酶家族成员，糖抗原家族成员，notch配体，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、糖蛋白a33，鸟苷酸环化酶2c和肿瘤特异性聚糖，其中本发明的靶向模块和所述至少一种其它靶向模块包含不同的靶细胞结合结构域、以及相同的标签结合结构域或标签。
[0249]
在实施方式中，所述药盒包含
[0250]
·
本发明的核酸、载体或细胞，以及
[0251]
·
包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞，
[0252]
其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，
[0253]
其中
[0254]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0255]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0256]-第三结构域是信号转导结构域，
[0257]
·
至少一种其它靶向模块，
[0258]
其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合，
[0259]
其中本发明的靶向模块和所述至少一种其它靶向模块包含不同的靶细胞结合结构域、以及相同的标签结合结构域或标签。
[0260]
在实施方式中，所述药盒包含一至三种靶向模块，优选一种本发明的靶向模块和一或两种其它靶向模块。
[0261]
在实施方式中，所述标签结合结构域或标签存在于构成所述开关型car的多肽的氨基末端。有利地，将所述标签结合结构域或标签定位在所述氨基末端允许所述标签结合结构域或标签不受阻碍地接近与靶细胞结合的所述靶向模块。
[0262]
在实施方式中，所述药盒还包含诱导剂，优选四环素或四环素衍生物，例如多西环素。
[0263]
在药盒的实施方式中，所述靶向模块、所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体和/或细胞是药物组合物的形式。
[0264]
所述药物组合物优选胃肠外施用，特别优选静脉内施用。在实施方式中，所述药物组合物以适合静脉内施用的形式存在。优选地，所述药物组合物是溶液、乳液或悬浮液。
[0265]
在实施方式中，所述药物组合物是可注射的缓冲溶液，其包含1μg/ml至500mg/ml之间、优选50μg/ml至50mg/ml之间的本发明的靶向模块和/或核酸和/或载体和/或细胞。
[0266]
在实施方式中，所述药物组合物是可注射的缓冲溶液，其包含1,000ml-1
至5
·
108ml-1
之间、优选1
·
105ml-1
至2.5
·
107ml-1
之间的所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的细胞。
[0267]
在实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的稀释剂或载剂。在其它实施方式中，所述载剂选自水、缓冲水溶液、0.9％盐水溶液、5％葡萄糖、5％木糖醇、0.3％甘氨酸溶液、林格溶液、氨基酸溶液和类似的溶剂。在其它实施方式中，所述缓冲水溶液选自ph值在ph 5.0至ph 8.0范围内、优选ph值在ph 6.0至ph 7.0范围内的组氨酸、琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾缓冲水溶液。在实施方式中，所述缓冲溶液的缓冲剂浓度在1mmol/l(mm)至500mm范围内，优选在5mm至20mm范围内，尤其优选在5mm至10mm范围内。在其它实施方式中，所述载剂包括氯化钠，优选其浓度在0mm至300mm范围内，尤其优选150mm。在实施方式中，所述药物组合物还包含稳定剂，优选其浓度在1mm至900mm范围内，尤其优选在10mm至600mm范围内。在实施方式中，所述稳定剂是蔗糖、海藻糖或l-甲硫氨酸。
[0268]
在其它实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。术语“药学上可接受的赋形剂”是指提供近似生理条件和/或增加稳定性的化合物，例如ph值调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等或使所述药物组合物能够冷冻储存的试剂。在实施方式中，药学上可接受的赋形剂选自乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠和聚山梨醇酯80，优选聚山梨醇酯80在0.0001％(w/v)至1％(w/v)的范围内，尤其优选在0.001％(w/v)至0.1％(w/v)的范围内。
[0269]
在优选的实施方式中，所述药物组合物包含剂量在25μg/天至100mg/天范围内、优选剂量在0.1mg/天至10mg/天范围内的所述靶向模块。
[0270]
在其它实施方式中，所述药物组合物是无菌的。通过常规公知的技术，包括但不限于无菌过滤，对所述药物组合物进行灭菌。
[0271]
在实施方式中，所述药物组合物用于给对象施用。
[0272]
在实施方式中，所述药物组合物在储存前冻干，或作为溶液储存在环境温度或以下，包括但不限于冷冻储存。
[0273]
在实施方式中，在施用于对象之前，所述药物组合物在输注和稳定化溶液中重构和/或稀释。用于重构或输注/稳定化的溶液可含有对所述药物组合物提到的任何组分或类似组分。
[0274]
在优选的实施方式中，所述药物组合物包含所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的细胞，所述细胞的剂量在1
·
107至1
·
109/施用的范围内，优选剂量在1
·
108至5
·
108/施用的范围内。
[0275]
本发明的另一个方面是本发明的药盒，用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，优选用于治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。
[0276]
在实施方式中，本发明的靶向模块、本发明的核酸、载体或细胞、或本发明的药盒用于制备在癌症、感染或自身免疫性疾病的情况下用于治疗和/或诊断用途的药物。
[0277]
本发明的又一个方面是通过施用本发明的靶向模块、细胞或载体、药物组合物或药盒在患有癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病的哺乳动物、优选人类中刺激嵌合抗原受
体介导的免疫应答的方法。对于治疗应用，将包含药理学有效量的本发明的靶向模块以及包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞的本发明的无菌药物组合物或本发明的无菌药盒，施用于对象以治疗上述病恙。
[0278]
在实施方式中，所述在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法；优选所述治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病的方法，还包括施用诱导剂，优选四环素或四环素的衍生物，例如多西环素。
[0279]
在实施方式中，诱导剂，优选四环素或四环素衍生物，例如多西环素，在施用本发明的核酸、载体或细胞后口服或静脉内施用。
[0280]
在一些实施方式中，所述在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法，优选所述治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病的方法，包括以下步骤：
[0281]
a)向哺乳动物施用有效量的本发明的靶向模块以及
[0282]
b)向哺乳动物施用有效量的包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞，
[0283]
其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，
[0284]
其中
[0285]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0286]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0287]-第三结构域是信号转导结构域，
[0288]
其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合，
[0289]
其中所述靶向模块在施用所述载体或细胞之前、同时或之后施用于哺乳动物。
[0290]
在其它实施方式中，所述在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法，优选所述治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病的方法，包括以下步骤：
[0291]
a)向哺乳动物施用有效量的包含至少一个靶细胞结合结构域和标签结合结构域或标签的靶向模块，
[0292]
其中所述至少一个靶细胞结合结构域是与选自下列的表面抗原结合的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体：cd2、cd3、cd4、cd8、cd10、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd52、cd90、cd99、cd123、cd133、cd150、cd181、cd182、cd184、cd223、cd229、cd269(bcma)、cd273、cd274、cd276、cd279、cd319、cd366和cd371，白介素受体，尤其优选il-8rα(cxcr1)、il-8rβ(cxcr2)、il-11rα、il-11rβ、il-13rα1和il-13rα2，cxcr4，c-met，间皮素，表皮生长因子受体家族成员及其突变体，尤其优选erbb1、erbb2、erbb3、erbb4或其突变体，肿瘤坏死因子受体超家族成员，肝配蛋白，肝配蛋白受体，尤其优选epha1-10、epha5或ephb1-6，前列腺特异性抗原前列腺干细胞抗原(psca)和前列腺特异性膜抗原(psma)，胚胎抗原癌胚抗原(cea)和胎儿乙酰胆碱受体，血管内皮生长因子家族成员，上皮细胞粘附分子epcam，甲胎蛋白afp，细胞间粘附分子家族成员，粘蛋白家族成员，促卵泡激素受体(fshr)，人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，叶酸结合蛋白fbp，叶酸受体，生长抑素受体，nkg2d受体的配体，细胞因子受体，上皮糖蛋白家族成员，双唾液酸神经节苷脂，磷脂酰肌醇蛋白聚糖，g蛋白偶联受体，碳酸酐酶家族成员，糖抗原家族成员，notch配体，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、糖蛋白a33，鸟苷酸环化酶2c和肿瘤特异
性聚糖；包括所指定的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体的突变体和类似物，和
[0293]
b)向所述哺乳动物施用有效量的包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞，
[0294]
其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，
[0295]
其中
[0296]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0297]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0298]-第三结构域是信号转导结构域，
[0299]
其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合，和
[0300]
c)向哺乳动物施用有效量的本发明的靶向模块，
[0301]
其中本发明的靶向模块和所述至少一种其它靶向模块包含不同的靶细胞结合结构域、以及相同的标签结合结构域或标签，
[0302]
其中所述方法以步骤a)、b)和c)的顺序进行。
[0303]
术语“靶细胞结合结构域”还包括可溶性t细胞受体，其由t细胞受体(tcr)的α和β或γ和δ链、其片段或突变体构成。
[0304]
在优选的实施方式中，所述在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法，优选所述治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病的方法，包括以下步骤：
[0305]
a)向哺乳动物施用有效量的包含至少一个靶细胞结合结构域和标签结合结构域或标签的靶向模块，
[0306]
其中所述至少一个靶细胞结合结构域是与选自下列的表面抗原结合的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体：cd2、cd3、cd4、cd8、cd10、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd52、cd90、cd99、cd123、cd133、cd150、cd181、cd182、cd184、cd223、cd229、cd269(bcma)、cd273、cd274、cd276、cd279、cd319、cd366和cd371，白介素受体，尤其优选il-8rα(cxcr1)、il-8rβ(cxcr2)、il-11rα、il-11rβ、il-13rα1和il-13rα2，cxcr4，c-met，间皮素，表皮生长因子受体家族成员，尤其优选erbb1、erbb2、erbb3或erbb4；肿瘤坏死因子受体超家族成员，肝配蛋白，肝配蛋白受体，尤其优选epha1-10、epha5或ephb1-6，前列腺特异性抗原前列腺干细胞抗原(psca)和前列腺特异性膜抗原(psma)，胚胎抗原癌胚抗原(cea)和胎儿乙酰胆碱受体，血管内皮生长因子家族成员，上皮细胞粘附分子epcam，甲胎蛋白afp，细胞间粘附分子家族成员，粘蛋白家族成员，促卵泡激素受体(fshr)，人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，叶酸结合蛋白fbp，叶酸受体，生长抑素受体，nkg2d受体的配体，细胞因子受体，上皮糖蛋白家族成员，双唾液酸神经节苷脂，磷脂酰肌醇蛋白聚糖，g蛋白偶联受体，碳酸酐酶家族成员，糖抗原家族成员，notch配体，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、糖蛋白a33，鸟苷酸环化酶2c和肿瘤特异性聚糖，和
[0307]
b)向所述哺乳动物施用有效量的包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞，
[0308]
其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，
[0309]
其中
[0310]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0311]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0312]-第三结构域是信号转导结构域，
[0313]
其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合，和
[0314]
c)向哺乳动物施用有效量的本发明的靶向模块，
[0315]
其中本发明的靶向模块和所述至少一种其它靶向模块包含不同的靶细胞结合结构域、以及相同的标签结合结构域或标签，
[0316]
其中所述方法以步骤a)、b)和c)的顺序进行。
[0317]
在优选的实施方式中，在施用所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞之前的优选1小时至2天、更优选4至24小时单独施用所述靶向模块，并且在施用所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞之后的优选3天至30天范围内施用本发明的靶向模块。此外，附加的此类剂量的所述靶向模块可以在间歇期后施用，以重新激活携带所述开关型嵌合抗原受体的效应细胞。
[0318]
在其它实施方式中，所述在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法，优选所述治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病的方法，包括以下步骤：
[0319]
a)向哺乳动物施用有效量的载体或细胞，所述载体或细胞包含：诱导型表达系统，优选选自tet-on、tet-on advanced反式激活因子、tet-on 3g或响应nfat的启动子；以及编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，其中
[0320]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0321]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0322]-第三结构域是信号转导结构域，以及
[0323]
编码本发明的靶向模块的核苷酸序列，其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合，和
[0324]
b)向哺乳动物施用有效量的诱导剂，优选四环素或四环素衍生物，例如多西环素。
[0325]
在实施方式中，所述诱导型表达系统诱导编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列和/或编码本发明的靶向模块的核苷酸序列的转录，优选地，所述诱导型表达系统诱导编码本发明的靶向模块的核苷酸序列的转录。
[0326]
在优选的实施方式中，所述在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法，优选所述治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病的方法，包括以下步骤：
[0327]
a)向哺乳动物施用有效量的包含至少一个靶细胞结合结构域和标签结合结构域或标签的靶向模块，
[0328]
其中所述至少一个靶细胞结合结构域是与选自下列的表面抗原结合的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体：cd2、cd3、cd4、cd8、cd10、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd52、cd90、cd99、cd123、cd133、cd150、cd181、cd182、cd184、cd223、cd229、cd269(bcma)、cd273、cd274、cd276、cd279、cd319、cd366和cd371，白介素受体，尤其优选il-8rα(cxcr1)、il-8rβ(cxcr2)、il-11rα、il-11rβ、il-13rα1和il-13rα
2，cxcr4，c-met，间皮素，表皮生长因子受体家族成员，尤其优选erbb1、erbb2、erbb3或erbb4；肿瘤坏死因子受体超家族成员，肝配蛋白，肝配蛋白受体，尤其优选epha1-10、epha5或ephb1-6，前列腺特异性抗原前列腺干细胞抗原(psca)和前列腺特异性膜抗原(psma)，胚胎抗原癌胚抗原(cea)和胎儿乙酰胆碱受体，血管内皮生长因子家族成员，上皮细胞粘附分子epcam，甲胎蛋白afp，细胞间粘附分子家族成员，粘蛋白家族成员，促卵泡激素受体(fshr)，人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，叶酸结合蛋白fbp，叶酸受体，生长抑素受体，nkg2d受体的配体，细胞因子受体，上皮糖蛋白家族成员，双唾液酸神经节苷脂，磷脂酰肌醇蛋白聚糖，g蛋白偶联受体，碳酸酐酶家族成员，糖抗原家族成员，notch配体，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、糖蛋白a33，鸟苷酸环化酶2c和肿瘤特异性聚糖，和
[0329]
b)向哺乳动物施用有效量的载体或细胞，所述载体或细胞包含：诱导型表达系统，优选选自tet-on、tet-on advanced反式激活因子、tet-on 3g或响应nfat的启动子；以及编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，其中
[0330]-第一结构域是标签结合结构域或标签，
[0331]-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且
[0332]-第三结构域是信号转导结构域，以及
[0333]
编码本发明的靶向模块的核苷酸序列，其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合，和
[0334]
c)向哺乳动物施用有效量的诱导剂，优选四环素或四环素衍生物，例如多西环素，
[0335]
其中本发明的靶向模块和所述至少一种其它靶向模块包含不同的靶细胞结合结构域、以及相同的标签结合结构域或标签，
[0336]
其中所述方法优选以步骤a)、b)和c)的顺序进行。
[0337]
在其它实施方式中，前述的实施方式可以组合。
[0338]
现在将通过以下非限制性附图和实施例进一步说明本发明。
[0339]
图1显示了具有三个结构域的开关型嵌合抗原受体(car)的示意图，其中第一结构域是标签结合结构域或标签(例如scfv)，第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，第三结构域是信号转导结构域，并且任选的第四结构域是所述受体的细胞外部分的短肽接头。
[0340]
图2显示了三种不同的pd-l1和/或pd-l2结合型tm与pd-l1表达细胞的基于流式细胞术的体外结合测定的结果。数据表示为至少四次独立实验的平均值
±
sd。
[0341]
图3显示了开关型嵌合抗原受体t细胞的基于流式细胞术的体外杀伤测定的结果，所述t细胞被三种不同的pd-l1和/或pd-l2结合型tm重定向到pd-l1表达细胞。在温育a)24小时和b)48小时后确定靶细胞数。数据表示为用单个t细胞供体的四次独立实验的平均值
±
sd。
[0342]
图4显示了开关型嵌合抗原受体t细胞的活细胞显微镜检查体外杀伤测定的结果，所述t细胞被两种不同的抗pd-l1 tm重定向到干扰素-γ处理的pc3-psca细胞。数据表示为用单个t细胞供体的四次独立实验的平均值
±
sd。
[0343]
图5显示了皮下移植pc3-psca肿瘤的免疫缺陷小鼠用开关型嵌合抗原受体t细胞单独处理或用其与抗psca tm、基于德瓦鲁单抗的抗pd-l1 tm、或德瓦鲁单抗的不同组合进
行处理的体内处理结果。数据表示为每组11只小鼠的平均值
±
sem。
[0344]
图6显示了组合的unicar和teton诱导型免疫检查点特异性靶向模块表达盒(tre-四环素应答元件、ef1a-延伸因子1a、rtta-反向四环素反式激活因子、irfp-红外荧光蛋白、egfp-增强型绿色荧光蛋白)的示意图。
[0345]
图7显示了通过慢病毒基因转移获得的基因修饰的原代人t细胞的频度：在与unicar组合的teton盒的控制下，pd-l1结合型靶向模块的多西环素诱导型基因表达。显示的数据表示从个体人t细胞供体获得的至少六个批次。
[0346]
图8显示了经基因工程改造以表达unicar和在多西环素响应性teton盒控制下的pd-l1和/或pd-l2结合型tm的人t细胞的靶向模块依赖性细胞毒性反应，a)48小时后和b)120小时后。显示了用六个独立的人类供体获得的结果的平均值
±
sd。
[0347]
图9显示了基于流式细胞术的细胞毒性测定，以评估由unicar-t介导的pd-l1阳性nalm-6细胞的裂解，所述unicar-t经修饰以分泌pd-l1和/或pd-l2结合型tm，a)48小时后和b)120小时后。数据表示为分别用单个t细胞供体进行的至少四次独立实验的平均值
±
sd。
[0348]
图10显示了表达unicar和在多西环素响应性teton盒控制下的pd-l1和/或pd-l2结合型tm的人t细胞对内在的pd-l1上调性pc3-psca细胞的细胞毒性测定，a)48小时后和b)120小时后。数据显示为分别用单个t细胞供体进行的三次重复实验的平均值
±
sd。
[0349]
图11显示了在多西环素诱导下由基因工程改造的人t细胞分泌的tm-pd-l1-scfv1浓度的定量。数据表示为用五个t细胞供体进行的五次重复实验的平均值
±
sd。
[0350]
图12显示了多西环素诱导型tm-pd-l1-scfv1分泌的on/off开关动力学。数据表示为四个t细胞供体和四次实验的平均值
±
sd。
[0351]
图13显示了表面上的unicar分子的定量取决于通过多西环素诱导的tm-pd-l1-scfv1表达进行的激活。显示了三个t细胞供体的平均值
±
sd，通过配对t检验计算统计显著性，**p《0.01。
[0352]
图14显示了在teton盒控制下的tm-pd-l1-scfv的基础表达低于诱导细胞毒性的阈值。将经基因修饰以表达开关型嵌合抗原受体并响应多西环素而分泌tm-pd-l1-scfv的人t细胞在标准培养基中在不存在(sn w/o)或存在1000ng/ml多西环素(sn+)情况下培养72小时。收获上清液，按1:5稀释，添加到nalm-6-pd-l1靶细胞和经基因修饰以单独表达开关型嵌合抗原受体的人t细胞中。作为附加的对照，将细胞混合物与1nm纯化的tm-pd-l1-scfv1(+tm)或普通细胞培养基(w/o tm)一起温育。温育24小时后，使用流式细胞术分析靶细胞的裂解。数据表示为四个t细胞供体的平均值
±
sd。通过单因素方差分析计算统计显著性；****p《0.0001。
[0353]
图15显示了tm-pd-l1-scfv1的稳定性，将其在培养基中37℃下72小时后进行基于流式细胞术的细胞毒性测定。
[0354]
图16显示了在前列腺癌(pca)的异种移植模型中，经基因工程改造以表达unicar和在teton盒控制下的tm-pd-l1-scfv的人t细胞的体内效力。a)实验设置的示意图。b)随时间绘制的测量的肿瘤体积，为至少九只小鼠的平均值
±
sem。
[0355]
图17显示了tm-pd-l1-scfv1与重组人fc标签的pd-l1结合的表面等离子共振(spr)测量结果。
[0356]
图18显示了tm-pd-l1-scfv2与重组人fc标签的pd-l1结合的表面等离子共振
(spr)测量结果。
[0357]
图19显示了通过unicar和unicar/pd-1开关修饰的t细胞，体外消除了表达重组pd-l1的急性骨髓性白血病细胞系molm-13。a)molm-13细胞经工程改造以表达重组pd-l1，并通过流式细胞术分析pd-l1表面表达。b)在不存在或存在cd33特异性靶向模块(tm cd33)的情况下，将unicar-t细胞(cd137/cd3-ζ，uc04)或unicar-pd-1开关t细胞与molm-13-pd-l1以2:1的效应细胞与靶细胞(e:t)比共培养。48小时和120小时后，通过流式细胞术评估对molm-13-pd-l1的细胞毒反应性(平均值
±
sd)。c)通过与molm-13-pd-l1共培养120小时后对t细胞活化标志物cd25进行表面染色来分析t细胞活化(平均值
±
sd)。通过wilcoxon符号秩检验评估n＝3个独立t细胞供体的统计显著性(*p《0.05，ns＝不显著)。
[0358]
图20显示了通过elisa确定tm-pd-l1变体的血浆浓度进行的tm-pdl1变体在nsg小鼠中的药代动力学研究：a)tm-pd-l1-scfv2，b)tm-pd-l1-scfv3，和c)tm-pd-l1-scfv4。显示了每个分析时间点三到四只小鼠的数据。
[0359]
图21显示了pd-l1特异性tm在pd-l1表达细胞系上的靶介导内化：为了确定pd-l1特异性可溶性适配体的pd-l1介导的药效半衰期，将pd-l1阳性靶细胞系(a)du-145和(b)u-251用1000nm tm-pd-l1-scfv3(tmpd-l1
v3
)或tm-pd-l1-scfv5(tmpd-l1
v5
)染色并在4℃或37℃下温育所指定的时间点。通过将获得的mfi对比所测量的最高mfi进行归一化，将数据显示为％最大结合。另外，计算各tm在37℃下的药效半衰期(t
1/2
)。数据显示为技术上一式三份测量的一个实验的平均值
±
sd。
[0360]
开关型car细胞的产生
[0361]
可以对免疫细胞进行基因工程，以通过各种方法表达针对pd-l1和/或pd-l2的开关型car和/或诱导型tm。将编码所述开关型car和确保其在基因工程改造的免疫细胞中表达的所有必要元件的多核苷酸载体转移到免疫细胞中。所述载体的转移可以通过核酸的电穿孔或转染或借助病毒载体系统如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、泡沫病毒或慢病毒基因转移来进行。
[0362]
慢病毒基因转移通过首先构建编码选定的开关型car的慢病毒载体，应用于在免疫细胞中稳定表达开关型car。慢病毒载体是plvx-ef1αunicar 28/ζ(clontech，takara bio group)，其中所述载体的慢病毒部分源自于人类免疫缺陷病毒(hiv)并且msc/ires/zxgreeni部分被所述开关型car构建体置换。
[0363]
慢病毒粒子是通过用编码开关型car的慢病毒载体质粒瞬时转染人胚胎肾(hek)293t(acc 635)细胞，并用编码群特异性抗原(gag)和聚合酶(pol)的质粒(pspax2)加上编码包膜的质粒(pmd2.g)共转染而产生的。转染后，所述包装质粒表达hiv-1的gag和pol蛋白。质粒md2.g编码水疱性口炎病毒的糖蛋白(vsv-g)。vsv-g蛋白用于慢病毒载体以转导广泛的哺乳动物细胞。来自不同病毒物种的各种包膜可以用于此目的。慢病毒载体可以成功地用兼向性鼠白血病病毒(mlv)的包膜糖蛋白(env)或水疱性口炎病毒的g蛋白(vsv-g)、原型泡沫病毒(pfv)的修饰包膜、或源自于长臂猿白血病病毒(galv)和mlv的嵌合包膜糖蛋白变体进行假型化。
[0364]
转染后24小时至96小时，收集转染的hek293t细胞的上清液，并通过超速离心或其它方法从所述上清液中浓缩病毒粒子。对于免疫细胞的慢病毒转导，将外周血单核细胞(pbmc)或分离的t细胞用对cd3复合体特异性的mab、例如克隆okt3或ucht1激活，所述mab或
是在溶液中给予、或是包被在塑料细胞培养皿或磁珠或可生物降解的聚合物基质上。通过用单独或组合地包被到塑料细胞培养皿或磁珠或可生物降解的聚合物基质上的对cd27、cd28、cd134或cd137特异性的mab或配体并供应外源重组细胞因子如白介素(il)-2、il-7、il-12、il-15和il-21来刺激共刺激途径，进一步增强pbmc或分离t细胞的激活。以单次或多次剂量初始施用活化cd3特异性抗体和/或对共刺激受体cd27、cd28、cd134或cd137特异性的抗体和/或重组细胞因子后24小时至96小时，将浓缩或非浓缩的病毒粒子添加到pbmc或t细胞培养物中。t细胞电穿孔、转导和扩增可以在开放式细胞培养系统中通过手动操作进行或在封闭的部分或全自动系统中进行。
[0365]
从最后施用病毒上清液后第3天起，可以在用针对开关型car的表面表达的含标签的分子或针对开关型car的第四结构域的mab进行染色后，通过流式细胞术确定t细胞的稳定转导。开关型car转导的t细胞可以通过在供应重组细胞因子和活化抗cd3 mab的情况下对其进行培养来体外增殖。
[0366]
在所述开关型car含有所述任选的第四结构域、即形成mab的线性表位的肽序列的情况下，可以通过下述方式在体外特异性地增殖经基因修饰以表达开关型car的免疫细胞：将与第四开关型car结构域结合的mab或其抗体片段包被到培养皿表面或任何种类的珠子或可生物降解的聚合物基质上，并将其以规定的比率添加到细胞培养物中。表面包被的mab与所述开关型car肽结构域的结合诱导细胞表面表达的开关型car的交联和免疫突触的形成，从而导致由所述开关型car的信号结构域特异性触发的信号通路的激活。依靠所诱导的信号通路，这会导致增强携带所述开关型car的免疫细胞的增殖和对激活诱导的细胞死亡的持续抵抗，并因此增强开关型car基因修饰的免疫细胞在混合群体中的富集。
[0367]
所述任选的第四个结构域，即形成mab的线性表位的肽序列，还可以用于从混合群体中富集和纯化开关型car表达免疫细胞。富集和纯化借助与所述第四开关型car结构域结合的mab或其抗体片段进行，所述mab或其抗体片段或是标记开关型car表达细胞以进行细胞分选、或是将所述开关型car表达免疫细胞瞬时连接到可用于进行细胞分离的小粒子上。在一个方面，开关型car移植的免疫细胞与识别所述第四结构域的mab一起温育。接下来，添加与抗体或其片段缀合的磁珠，所述抗体或其片段针对与所述任选的第四结构域结合的mab的物种特异性和同种型特异性的重链和轻链。因此，开关型car表达免疫细胞和磁珠在磁场中连接并被捕获和与其它免疫细胞分离。
[0368]
本发明的靶向模块的设计
[0369]
在一个示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm包含根据seq id no.57的阿替利珠单抗的scfv，所述scfv包含通过接头连接的seq id no.6和7以及根据seq id no.14的人la表位e5b9(tm-pd-l1-scfv1)。
[0370]
在一个替代示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm包含根据seq id no.65的阿替利珠单抗的scfv，所述scfv包含通过接头连接的seq id no.6和7以及根据seq id no.14的人la表位e5b9。
[0371]
在其它示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm包含根据seq id no.58的德瓦鲁单抗的scfv，所述scfv包含通过接头连接的seq id no.8和9以及根据seq id no.14的人la表位e5b9(tm-pd-l1-scfv2)。
[0372]
在一个替代示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm包含根据seq id no.66的德
瓦鲁单抗的scfv，所述scfv包含通过接头连接的seq id no.8和9以及根据seq id no.14的人la表位e5b9。
[0373]
在另一个示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm包含根据seq id no.86的bms-936559的scfv，所述scfv包含通过接头连接的seq id no.4和5以及根据seq id no.14的人la表位e5b9(tm-pd-l1-scfv3)。
[0374]
在一个替代示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm包含根据seq id no.85的bms-936559的scfv，所述scfv包含通过接头连接的seq id no.4和5以及根据seq id no.14的人la表位e5b9。
[0375]
在另一个示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm包含根据seq id no.97的bms-936559的scfv，所述scfv包含通过接头连接的seq id no.77和78以及根据seq id no.14的人la表位e5b9(tm-pd-l1-scfv4)。
[0376]
在一个替代示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm包含根据seq id no.98的bms-936559的scfv，所述scfv包含通过接头连接的seq id no.77和78以及根据seq id no.14的人la表位e5b9。
[0377]
在另一个示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm包含根据seq id no.87的bms-936559的scfv，所述scfv包含通过接头连接的seq id no.67和68以及根据seq id no.14的人la表位e5b9(tm-pd-l1-scfv5)。
[0378]
在一个替代示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm包含根据seq id no.88的bms-936559的scfv，所述scfv包含通过接头连接的seq id no.67和68以及根据seq id no.14的人la表位e5b9。
[0379]
在其它示例中，所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm是二价的并且包含两个pd-1细胞外结构域，所述细胞外结构域各自是seq id no.3的片段和根据seq id no.14的人la表位e5b9(tm-tdpd1)。tm-tdpd-1由seq id no.59编码。
[0380]
本发明的靶向模块的功能性的表征
[0381]
所述pd-l1和/或pd-l2结合型tm的功能性可以在使用表面等离子共振对人和鼠pd-l1的结合测定中以及在基于细胞的细胞毒性测定中进行确认。
[0382]
图2显示了三种不同的pd-l1和/或pd-l2结合型tm与被转导为表达pd-l1的nalm-6细胞的基于流式细胞术的体外结合测定的结果。数据表示为至少四次独立实验的平均值
±
sd。
[0383]
图3显示了开关型嵌合抗原受体t细胞(seq id no.60)的基于流式细胞术的体外杀伤测定的结果，所述t细胞被三种不同的pd-l1和/或pd-l2结合型tm重定向到被转导以表达pd-l1的nalm-6细胞。效应细胞与靶细胞比(e:t)为1:1。在温育a)24小时和b)48小时后确定靶细胞数。数据表示为用单个t细胞供体的四次独立实验的平均值
±
sd。
[0384]
图4显示了开关型嵌合抗原受体t细胞(seq id no.60)的基于活细胞显微镜检查的体外杀伤测定结果，所述t细胞被两种不同的抗pd-l1 tm重定向到干扰素-γ处理的pc3-psca细胞。效应细胞与靶细胞比(e:t)为1:1。温育96小时后确定靶细胞数。数据表示为用单个t细胞供体的四次独立实验的平均值
±
sd。
[0385]
图5显示了皮下移植pc3-psca肿瘤的免疫缺陷小鼠用开关型嵌合抗原受体t细胞(seq id no.60)单独处理或用其与抗psca tm、基于德瓦鲁单抗的抗pd-l1 tm、或德瓦鲁单
抗的不同组合进行处理的体内处理结果。所述开关型嵌合抗原受体t细胞在指定的时间点静脉内注射。在每个指定的处理周期(t)期间，所述tm每天两次腹膜内注射，德瓦鲁单抗腹膜内注射一次。数据表示为每组11只小鼠的平均值
±
sem。
[0386]
组合式开关型car和诱导型靶向模块表达盒的设计(图6)
[0387]
所述慢病毒基因表达质粒含有ef1a启动子以用于rtta和unicar的连续多顺反子转录，rtta和unicar由thosea asigna病毒源性的肽切割位点(2pa)分隔。另外，pd-l1和/或pd-l2结合型靶向模块(tm)在tre3g启动子的控制之下，所述启动子只有在多西环素存在下通过结合rtta才能被激活。这种安排允许多西环素依赖性的可诱导和可逆的基因表达。
[0388]
组合式开关型car和诱导型靶向模块表达盒的功能性的表征
[0389]
图7显示了通过慢病毒基因转移获得的基因修饰的原代人t细胞的频度。将从健康自愿人类供体中分离的t细胞用慢病毒上清液转导，所述慢病毒上清液转移遗传信息，以进行在与unicar组合的teton盒控制下的pd-l1和/或pd-l2结合型靶向模块(tm-pd-l1-scfv-1、tm-pd-l1-scfv2和tm-tdpd1)的多西环素诱导型基因表达。通过使用针对整合到unicar铰链中的细胞外e7b6标签的第一小鼠a7b6-mab(10μg/ml)对表面展示的unicar进行免疫荧光染色，分析转导后第14天的转导效率。alexafluor 647缀合的山羊抗小鼠ab用作第二抗体。
[0390]
图8显示了经基因工程改造以表达unicar和在多西环素响应性teton盒控制下的本发明的tm的人t细胞的tm依赖性细胞毒性反应。从健康自愿人类供体中分离的t细胞经基因修饰而表达unicar以及在teton盒控制下的pd-l1和/或pd-l2结合型靶向模块。所述unicar修饰的细胞介导针对靶癌细胞的tm依赖性细胞毒性反应的能力在基于流式细胞术的细胞毒性测定中进行评估。在存在浓度递增的包含根据ep 2 990 416b1的psca结合结构域和根据seq id no.14的人la表位e5b9的psca结合型tm的情况下，将nalm-6-psca细胞与人unicar表达t细胞一起培养，总t细胞与靶细胞的比率为1:1。在指定的时间点确定活靶细胞的数量。相对于不添加tm的对照来计算特异性裂解。
[0391]
图9显示了评估由经修饰以分泌pd-l1特异性tm的unicar-t介导的pd-l1阳性nalm-6细胞裂解的细胞毒性测定结果。在浓度从1,000到1ng/ml递减的多西环素存在下，将nalm-6-pd-l1靶细胞与基因修饰的人t细胞一起培养，总t细胞与靶细胞(e:t)比率为1:1。t细胞经工程改造以表达unicar和多西环素响应性teton盒，以在多西环素存在下诱导tm-pd-l1-scfv-1、tm-pd-l1-scfv2或tm-tdpd1的表达和分泌。在a)48小时和b)120小时温育后分析靶细胞的特异性裂解，并对比没有多西环素时的背景裂解进行归一化。
[0392]
图10显示了表达unicar和在多西环素响应性teton盒控制下的pd-l1特异性tm的人t细胞对内在的pd-l1上调性pc3-psca细胞的细胞毒性测定结果。用25ng/ml ifn-γ处理pc3-psca细胞以诱导pd-l1上调。随后，在多西环素诱导型teton盒的控制下，将呈递pd-l1的pc3-psca与表达unicar和pd-l1特异性tm、特别是tm-pd-l1-scfv1的基因修饰的t细胞一起温育a)48小时和b)120小时，总细胞与靶细胞(e:t)比率为1:1。多西环素以从1000到1ng/ml的递减浓度添加，并相对于没有多西环素的靶细胞裂解来计算特异性裂解。
[0393]
通过将pd-l1阳性靶细胞和经工程改造以表达unicar和用于多西环素诱导型tm-pd-l1-scfv1的teton盒的人t细胞在总t细胞与靶细胞(e:t)比率为1:1的情况下与浓度递减的多西环素一起温育120小时，进行在多西环素诱导下由基因工程改造的人t细胞分泌的
tm-pd-l1-scfv1浓度的定量(图11)。收获无细胞上清液并通过elisa分析分泌的tm-pd-l1-scfv1浓度。将多西环素浓度分别相对于以ng/ml计的tm浓度和由此产生的摩尔浓度作图。
[0394]
图12显示了多西环素诱导型tm-pd-l1-scfv1分泌的on/off开关动力学。对于在on期的每个指定时间点，将1
×
105个经基因工程改造以表达unicar和在多西环素(dox)诱导型teton盒控制下的tm-pd-l1-scfv1的人t细胞在存在1000ng/ml多西环素的500μl培养基中温育。同样，对于off期，将工程改造的t细胞池首先与相同量的多西环素一起培养24小时，然后彻底清洗并按照on期的描述但不添加多西环素再培养4、6、8、12和24小时。对于分析的每个时间点，收获无细胞上清液并使用elisa定量tm-pd-l1-scfv1水平。
[0395]
图13显示了表面上的unicar分子的定量取决于通过多西环素诱导的tm-pd-l1-scfv1表达进行的激活。使用以dako生成的校准曲线来定量工程改造的t细胞上unicar表面分子的数量。基因工程改造的t细胞的免疫荧光染色使用用于检测unicar的抗7b6-mab进行，并将alexafluor 647山羊抗小鼠ab作为第二ab应用于预染色的t细胞，但也应用于校准珠。将表达unicar和用于多西环素诱导型tm-pd-l1-scfv1的teton盒的基因工程改造的人t细胞在不存在或存在1,000ng/ml多西环素的情况下培养24小时。
[0396]
图14显示了在teton盒的控制下tm-pd-l1-scfv的基础表达低于诱导细胞毒性的阈值。将经基因修饰以表达unicar并响应多西环素而分泌tm-pd-l1-scfv的人t细胞在标准培养基中在不存在(sn w/o)或存在1,000ng/ml多西环素(sn+)情况下培养72小时。收获上清液，按1:5稀释，添加到nalm-6-pd-l1靶细胞和经基因修饰以单独表达unicar的人t细胞中。作为附加的对照，将细胞混合物与1nm纯化的tm-pd-l1-scfv1(+tm)或普通细胞培养基(w/o tm)一起温育。温育24小时后，使用流式细胞术分析靶细胞的裂解。
[0397]
为了验证tm-pd-l1-scfv1在37℃下的稳定性，将纯化的tm在培养基中于37℃温育72小时，并使用经基因修饰而仅表达unicar的人t细胞和nalm-6-pd-l1靶细胞，以总t细胞与靶细胞(e:t)比率为1:1，在基于标准流式细胞术的细胞毒性测定中对效力进行24小时的分析(图15)。
[0398]
图16显示了在前列腺癌(pca)的异种移植模型中，经基因工程改造以表达unicar和在teton盒控制下的tm-pd-l1-scfv的人t细胞的体内效力。将小鼠皮下移植1
×
106个肿瘤细胞(pc3-psca)(图16a)。25天后，施用200万个t细胞(其中28.7％经基因工程改造以表达unicar和在teton盒的控制下的tm-pd-l1-scfv)，并在同一天开始喂食多西环素。相继进行连续两周的多西环素喂食，其间休息两天。两周后开始第二个处理周期并以相同的方式进行。每周一次用数字卡尺测量肿瘤体积，并以至少9只小鼠的平均值
±
sem随时间作图(图16b)。
[0399]
用针对cd33的靶向模块重定向的开关型car与pd-l1:cd28开关受体的组合
[0400]
通过经工程改造以表达重组pd-l1并通过流式细胞术分析pd-l1表面表达的molm-13细胞，考查通过unicar和unicar/pd-1开关修饰的t细胞对表达重组pd-l1的急性骨髓性白血病细胞系molm-13的体外消除(参见图19a)。
[0401]
在不存在或存在cd33特异性靶向模块(tm cd33)的情况下，将unicar-t细胞(cd137/cd3-ζ，uc04)或unicar-pd-1开关t细胞与molm-13-pd-l1以2:1的效应细胞与靶细胞(e:t)比共培养。48小时和120小时后，通过流式细胞术评估对molm-13-pd-l1的细胞毒反应性(参见图19b，平均值
±
sd)。
[0402]
通过与molm-13-pd-l1共培养120小时后对t细胞活化标志物cd25进行表面染色，来分析t细胞活化(参见图19c，平均值
±
sd)。通过wilcoxon符号秩检验评估n＝3个独立t细胞供体的统计显著性(*p《0.05，ns＝不显著)。
[0403]
pd-l1:cd28开关受体与unicar(4-1bb-cd3ζunicar)相结合表现出高度靶向模块独立的molm-13pd-l1细胞裂解，表明这样的方法的局限性。
[0404]
tm-pdl1变体的药代动力学研究
[0405]
对于tm-pdl1变体在nsg小鼠中的药代动力学研究，通过尾静脉静脉注射1μg/g nsg小鼠的bw来施用tm-pd-l1。在指定的时间点通过眼窝后穿刺采集外周血。利用pdl1-fc嵌合体捕获蛋白和抗penta-his hrp缀合物检测抗体(定量下限0.03-0.22ng/ml测定浓度)，通过elisa确定tm-pd-l1变体的血浆浓度。在图20a)、b)、c)中显示了每个时间点分析的三到四只小鼠的数据。利用pk solver 2.0(zhang等2010)，应用加权的(1/y2)两室分析来定义指定的药代动力学参数。由最后三或四个时间点计算终期的斜率(t
1/2
β)。图20显示了a)tm-pd-l1-scfv2、b)tm-pd-l1-scfv3和c)tm-pd-l1-scfv4的浓度，表1显示了计算的药代动力学(pk)参数。
[0406]
表1 tm-pdl1变体：tm-pd-l1-scfv2(tm-pd-l1
v2
)、tm-pd-l1-scfv3(tm-pd-l1
v3
)和tm-pd-l1-scfv4(tm-pd-l1
v4
)的药代动力学(pk)研究结果
[0407][0408]
图21显示了pd-l1特异性tm在pd-l1表达细胞系上的靶介导内化。为了确定pd-l1特异性可溶性适配体的pd-l1介导的药效半衰期，将pd-l1阳性靶细胞系(a)du-145和(b)u-251用1000nm tm-pd-l1-scfv3(tmpd-l1
v3
)或tm-pd-l1-scfv5(tmpd-l1
v5
)染色。随后，将染色的靶细胞在4℃或37℃下温育指定的时间点。使用pe标记的α-his ab，通过流式细胞术分析pd-l1特异性tm的结合。另外，计算各tm在37℃下的药效半衰期(t
1/2
)。
[0409]
引用的非专利文献
[0410]
brudno jn,kochenderfer jn(2016)嵌合抗原受体t细胞的毒性：识别和管理(toxicities of chimeric antigen receptor t cells:recognition and management).blood 127,3321-3330.
[0411]
carpenito c,milone mc,hassan r,simonet jc,lakhal m,suhoski,mm,varela-rohena a,haines km,heitjan d,albelda sm,carrol rg,riley jl,pastan,i,june ch(2009)用含有cd28和cd137结构域的基因重新靶向的人t细胞控制大型、已建立的肿瘤异种
md,hirano n(2018)含有jak-stat信号转导结构域的新型嵌合抗原受体介导卓越的抗肿瘤效应(a novel chimeric antigen receptor containing a jak-stat signaling domain mediates superior antitumor effects).nat med.24(3),352-359.
[0429]
kershaw mh,westwood ja,parker ll,等(2006)使用基因修饰的t细胞治疗卵巢癌的过继性免疫疗法的i期研究(a phase i study on adoptive immunotherapy using gene-modified t cells for ovarian cancer).clin.cancer res.12(20),6106-6115.
[0430]
lamers ch,sleijfer s,willemsen ra,debets r,kruit whj,gratama jw,stoter g(2004)用单链抗体[scfv(ig)]基因修饰的t淋巴细胞对癌症的过继性免疫基因疗法(adoptive immuno-gene therapy of cancer with single chain antibody[scfv(ig)]gene modified tlymphocytes).j.biol.regul.homeost.agents.18(2),134-140.
[0431]
lamers ch,sleijfer s,vulto ag,kruit wh,kliffen m,debets r,gratama jw,stoter g,oosterwijk e(2006)用针对碳酸酐酶ix进行基因重靶向的自体t淋巴细胞治疗转移性肾细胞癌：首次临床经验(treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologous t-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase ix:first clinical experience).j.clin.oncol.24,e20-e22.
[0432]
maher j,brentjens rj,gunset g,rivi
è
re i,sadelain m(2002)由单一嵌合tcrζ/cd28受体引导的人t淋巴细胞细胞毒性和增殖(human t-lymphocyte cytotoxicity and proliferation directed by a single chimeric tcrzeta/cd28 receptor).nat.biotechnol.20(1),70-75.
[0433]
maude sl,barrett dm,teachey dt,grupp sa(2014)管理与新型t细胞接合疗法相关的细胞因子释放综合征(managing cytokine release syndrome associated with novel t cell-engaging therapies).cancer j.20(2),119-122.
[0434]
milone mc,fish jd,carpenito c,carroll rg,binder gk,teachey d,samanta m,lakhal m,gloss b,danet-desnoyers g,campana d,riley jl,grupp sa,june ch(2009)含有cd137信号转导结构域的嵌合受体在体内介导增强的t细胞存活率和增加的抗白血病效力(chimeric receptors containing cd137 signal transduction domains mediate enhanced survival of t cells and increased antileukemic efficacy in vivo).mol.ther.17(8),1453-1464.
[0435]
morgan ra,yang jc,kitano m,dudley me,laurencot cm,rosenberg sa(2010)用识别erbb2的嵌合抗原受体转导的t细胞在施用后严重不良事件的病例报告(case report of a serious adverse event following the administration of t cells transduced with a chimeric antigen receptor recognizing erbb2).mol.ther.18,843-851.
[0436]
pinthus jh,waks t,kaufman-francis k,schindler dg,harmelin a,kanety h,ramon j,eshhar z(2003)使用嵌合受体重定向的人淋巴细胞对已建立的前列腺肿瘤的免疫基因疗法(immuno-gene therapy of established prostate tumors using chimeric receptor-redirected human lymphocytes).cancer res.63(10),2470-2476.
[0437]
pinthus jh,waks t,malina v,kaufman-francis k,harmelin a,aizenberg i,kanety h,ramon j,eshhar z(2004)使用重定向的效应淋巴细胞对前列腺癌骨病变的过继
性免疫疗法(adoptive immunotherapy of prostate cancer bone lesions using redirected effector lymphocytes).j clin invest.114(12),1774-1781.
[0438]
prosser me,brown ce,shami af,forman sj,jensen mc(2012)肿瘤pd-l1共同刺激经修饰以表达pd1:cd28嵌合受体的原代人cd8细胞毒性t细胞(tumor pd-l1 co-stimulates primary human cd8cytotoxic t cells modified to express a pd1:cd28 chimeric receptor).molecular immunology 51(3),263-272.
[0439]
reinke aw,grant ra,keating ae(2010)合成的卷曲螺旋相互作用组为分子工程提供异质特异性模块(a synthetic coiled-coil interactome provides heterospecific modules for molecular engineering).jacs 132,6025-6031.
[0440]
rafiq s,yekuoo,jackson hj,purdon tj,van leeuwen dg,drakes dj,song m,miele mm,li z,wang p,yan s,xiang j,ma x,seshan ve,henderickson rc,liu c,brentjens rj(2018)car-t细胞靶向递送pd-1阻断性scfv增强体内抗肿瘤效力(targeted delivery of a pd-1-blocking scfv by car-t cells enhances anti-tumor efficacy in vivo).nature biotechnology 36(9),847-856.
[0441]
sotillo e,barrett dm,black k.,bagashev a,oldridge d,wu g,sussman r,lanauze c,ruella m,gazzara mr,martinez nm,harrington ct,chung ey,perazzelli j,hofmann tj,maude sl,raman p,barrera a,gill s,lacey sf,melenhorst jj,allman d,jacoby e,fry t,mackall c,barash y,lynch kw,maris jm,grupp sa,thomas-tikhonenko a(2015)cd19的获得性突变的收敛和可变剪接实现对cart-19免疫疗法的抗性(convergence of acquired mutations and alternative splicing of cd19enables resistance to cart-19immunotherapy).cancer discov.5,1282-1295.
[0442]
titov a,petukhov a,staliarova a,motorin d,bulatov e,shuvalov o,soond sm,piacentini m,melino g,zaritskey a,barlev na(2018)car-t疗法相关毒性的生物学基础和临床症状(the biological basis and clinical symptoms of car-t therapy-associated toxicities).cell death dis9,897.
[0443]
k,cartellieri m,michen s,wiedemuth r,m
ü
ller n,lindemann d,bachmann m,f
ü
ssel m,schackert g,temme a(2015)基于dap12的活化嵌合抗原受体用于nk细胞肿瘤免疫疗法(dap12-based activating chimeric antigen receptor for nk cell tumor immunotherapy).j.immunol.194(7),3201-3212.
[0444]
wang j,jensen m,lin y,sui x,chen e,lindgren cg,till b,raubitschek a,forman sj,qian x,james s,greenberg p,riddell s,press ow(2007)使用具有cd28和cd137共刺激结构域的嵌合t细胞受体优化淋巴瘤的过继性多克隆t细胞免疫治疗(optimizing adoptive polyclonal t cell immunotherapy of lymphomas,using a chimeric t cell receptor possessing cd28 and cd137 costimulatory domains).hum.gene ther.18(8),712-725.
[0445]
yu s,yi m,qin s,wu k(2019)下一代嵌合抗原受体t细胞：克服毒性的安全策略(next generation chimeric antigen receptor t cells:safety strategies to overcome toxicity).molecular cancer.18(1).
[0446]
zhang t,lemoi ba,sentman cl(2005)携带嵌合nk受体的t细胞介导抗肿瘤免疫
疗法(chimeric nk-receptor-bearing t cells mediate antitumor immunotherapy).blood.106(5),1544-1551.
[0447]
zhang t,barber a,sentman cl(2006)用嵌合nkg2d受体基因修饰人原代t细胞产生抗肿瘤反应(generation of antitumor responses by genetic modification of primary human t cells with a chimeric nkg2dreceptor).cancer res.66(11),5927-5933.
[0448]
zhang y,huo m,zhou j,xie s(2010)pksolver:microsoft excel中用于药代动力学和药效学数据分析的插件程序(pksolver:an add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in microsoft excel).computer methods and programs in biomedicine 99(3),306-314.
[0449]
zhao y,wang qj,yang s,kochenderfer jn,zheng z,zhong x,sadelain m,eshhar z,rosenberg sa,morgan ra(2009)具有修饰的信号转导结构域的基于赫赛汀的嵌合抗原受体导致转导的t淋巴细胞的存活率和抗肿瘤活性提高(aherceptin-based chimeric antigen receptor with modified signaling domains leads to enhanced survival of transduced t lymphocytes and antitumor activity).j.immunol.183(9),5563-5574.
[0450]
参考符号
[0451]
1 第一结构域，标签结合结构域或标签。
[0452]
2 第二结构域，细胞外铰链和跨膜结构域。
[0453]
3 第三结构域，信号转导结构域
[0454]
4 任选的第四结构域，短肽接头。
技术特征：1.一种靶向模块，所述靶向模块包含i)至少一个pd-l1和/或pd-l2结合结构域，ii)标签结合结构域或标签；用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，其中所述靶向模块与包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞联合施用，其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，其中-第一结构域是标签结合结构域或标签，-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且-第三结构域是信号转导结构域，其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。2.根据权利要求1所述的靶向模块，其是单价或二价的。3.根据权利要求1或2所述的靶向模块，其中所述pd-l1和/或pd-l2结合结构域是bms-936559、阿替利珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗、3f2.1及其片段。4.根据权利要求1至3中的任一项所述的靶向模块，其中所述标签是肽表位标签。5.根据权利要求4所述的靶向模块，其中所述肽表位标签是myc-标签、his-标签、来自酵母转录因子gcn4的短线性肽序列、亮氨酸拉链序列、或来自人核蛋白、优选来自人la蛋白的短线性肽序列。6.根据权利要求1至5中的任一项所述的靶向模块，其还包含效应细胞结合结构域，其中所述效应细胞结合结构域特异性结合人cd3链、人t细胞受体(tcr)或人cd16上的表位。7.根据权利要求1至6中的任一项所述的靶向模块，其中所述至少一个pd-l1和/或pd-l2结合结构域和/或所述效应细胞结合结构域的可变区包含人源化氨基酸序列。8.根据权利要求1至7中的任一项所述的靶向模块，其中长度在20至1600个氨基酸的范围内。9.根据权利要求1至8中的任一项所述的靶向模块，用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，其中所述靶向模块与包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞以及至少一种其它靶向模块联合施用，其中所述至少一种其它靶向模块包含至少一个靶细胞结合结构域和标签结合结构域或标签，其中所述至少一个靶细胞结合结构域是与选自下列的表面抗原结合的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体：cd2、cd3、cd4、cd8、cd10、cd19、cd20、cd22、cd23、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd52、cd90、cd99、cd123、cd133、cd150、cd181、cd182、cd184、cd223、cd229、cd269(bcma)、cd273、cd274、cd276、cd279、cd319、cd366和cd371，白介素受体，尤其优选il-8rα(cxcr1)、il-8rβ(cxcr2)、il-11rα、il-11rβ、il-13rα1和il-13rα2，cxcr4，c-met，间皮素，表皮生长因子受体家族成员及其突变体，尤其优选erbb1、erbb2、erbb3、erbb4或其突变体，肿瘤坏死因子受体超家族成员，肝配蛋白，肝配蛋白受体，尤其优
选epha1-10、epha5或ephb1-6，前列腺特异性抗原前列腺干细胞抗原(psca)和前列腺特异性膜抗原(psma)，胚胎抗原癌胚抗原(cea)和胎儿乙酰胆碱受体，血管内皮生长因子家族成员，上皮细胞粘附分子epcam，甲胎蛋白afp，细胞间粘附分子家族成员，粘蛋白家族成员，促卵泡激素受体(fshr)，人高分子量黑色素瘤相关抗原(hmw-maa)，叶酸结合蛋白fbp，叶酸受体，生长抑素受体，nkg2d受体的配体，细胞因子受体，上皮糖蛋白家族成员，双唾液酸神经节苷脂，磷脂酰肌醇蛋白聚糖，g蛋白偶联受体，碳酸酐酶家族成员，糖抗原家族成员，notch配体，黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)、糖蛋白a33，鸟苷酸环化酶2c和肿瘤特异性聚糖；包括所指定的抗体、抗体片段、蛋白质、肽或低分子量有机配体的突变体和类似物，其中根据权利要求1至8之一所述的靶向模块和所述至少一种其它靶向模块包含不同的靶细胞结合结构域、以及相同的标签结合结构域或标签。10.一种核酸、载体或细胞，其包含编码根据权利要求1至9之一所述的靶向模块的核苷酸序列，用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，其中所述核酸、载体或细胞与包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞联合施用，其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，其中-第一结构域是标签结合结构域或标签，-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且-第三结构域是信号转导结构域，其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。11.根据权利要求10所述的核酸、载体或细胞，其还包含诱导型表达系统，所述诱导型表达系统优选选自tet-on、tet-on advanced、tet-on 3g、t-rex或响应活化t细胞核因子(nfat)的启动子。12.根据权利要求10或11所述的核酸、载体或细胞，其还包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，其中-第一结构域是标签结合结构域或标签，-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且-第三结构域是信号转导结构域，其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。13.一种核酸、载体或细胞，其包含-诱导型表达系统，优选选自tet-on、tet-on advanced、tet-on3g、t-rex、或响应nfat的启动子，以及-编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，其中
‑
第一结构域是标签结合结构域或标签，-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且-第三结构域是信号转导结构域，以及-编码根据权利要求1至9之一所述的靶向模块的核苷酸序列，其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至9之一所述的靶向模块、根据权利要求10至13之一所述的核酸、载体或细胞，用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，其中所述药物组合物与包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞联合施用，其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，其中-第一结构域是标签结合结构域或标签，-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且-第三结构域是信号转导结构域，其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。15.一种药盒，其包含a)根据权利要求1至9之一所述的靶向模块，根据权利要求10至13之一所述的核酸、载体或细胞，和b)包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞，其中所述开关型嵌合抗原受体包含三个结构域，其中-第一结构域是标签结合结构域或标签，-第二结构域是细胞外铰链和跨膜结构域，并且-第三结构域是信号转导结构域，其中所述靶向模块的标签结合结构域与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合，或所述靶向模块的标签与所述开关型嵌合抗原受体的标签结合结构域结合。16.根据权利要求15所述的药盒，其中所述标签是myc-标签、his-标签、来自酵母转录因子gcn4的短线性肽序列、亮氨酸拉链序列、或来自人核蛋白、优选来自人la蛋白的短线性肽序列。17.根据权利要求15或16所述的药盒，其中所述标签结合结构域是与下列标签或序列结合的抗体或抗体片段：myc-标签，his-标签，来自酵母转录因子gcn4的短线性肽序列，亮氨酸拉链序列，或来自人核蛋白、优选来自人la蛋白的短线性肽序列。18.根据权利要求15至17之一所述的药盒，其中所述细胞外铰链和跨膜结构域选自人cd28分子、cd8a链、nk细胞受体、优选自然杀伤群nkg2d的铰链和跨膜结构域；或抗体恒定区的部分，及其组合。19.根据权利要求15至18之一所述的药盒，其中所述信号转导结构域选自：cd28、cd137
(4-1bb)、cd134(ox40)、cd278(icos)、dap10和cd27的胞质区，程序性细胞死亡受体1(pd-1)，细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)，cd3链的胞质区，dap12，cd122(白介素-2受体β)、cd132(白介素-2受体γ)、cd127(白介素-7受体α)、cd360(白介素-21受体)，活化fc受体，及其突变体。20.根据权利要求15至19之一所述的药盒，其中所述靶向模块和/或所述包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞是药物组合物的形式。21.根据权利要求15至20之一所述的药盒，用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中，优选用于治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病。
技术总结本发明涉及一种包含至少一个PD-L1和/或PD-L2结合结构域、和标签结合结构域或标签的靶向模块，用于在哺乳动物中刺激嵌合抗原受体介导的免疫应答的方法中；包含编码所述靶向模块的核苷酸序列的核酸、载体或细胞；包含所述靶向模块和包含编码开关型嵌合抗原受体的核苷酸序列的载体或细胞的药物组合物和药盒。苷酸序列的载体或细胞的药物组合物和药盒。
技术研发人员：阿尔明
受保护的技术使用者：阿文塞勒欧洲有限公司
技术研发日：2021.03.16
技术公布日：2022/11/1
