1.本发明涉及免疫层析技术领域，尤其涉及一种检测血小板抗体的试剂卡及制备方法。
背景技术：2.临床血小板输注一种重要的临床输血治疗手段，尤其是对治疗血小板缺乏引起的出血倾向、血小板功能性障碍具有重要价值。但是血小板抗体的产生会导致血小板输注无效或者输注效果差等现象出现，尤其是长期多次输血维持治疗的患者极易产生血小板相关抗体，从而导致许多严重并发症的发生。
3.人类血小板表面具有复杂的血型抗原，这些抗原是由遗传决定的，通常分为血小板特异性的非特异性抗原。非特异性抗原与红细胞血型、hla、抗原有关；特异性抗原由血小板特有的抗原决定族组成，表现出血小板独特的遗传多态性，不存在于其它细胞和组织。给患者反复注输血小板，可于血清中产生血小板同种抗体，当输入血小板后，可产生抗原体的免疫反应症状，输入的血小板也会迅速破坏。血小板产生的抗体主要是针对血小板特异抗原和hla抗原，反应严重时可产生输血后血小板减少症，或称输血后紫癖，可于输血后几周左右发生。新生儿救灾可发生一种新生儿免疫性血小板减少症，系由胎儿与母亲血小板型不合所致类似新生儿溶血病之发病机制。因此，在输注血小板前对其进行抗体检测极具重要的临床意义。
4.但是，相关技术中，对血小板抗体的检测方法普遍存在操作繁琐，使得检测时间增加的问题。
技术实现要素：5.本发明的目的在于提供一种检测血小板抗体的试剂卡及制备方法，旨在利用荧光标记物标记方法，提供一种操作简单高效的检测试剂卡。
6.为实现上述目的，第一方面，本发明还提供一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，包括：
7.分别制作样品垫和释放垫；
8.制备荧光标记物；
9.基于所述荧光标记物和鼠抗人血小板单克隆抗体制造荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体；
10.基于所述释放垫和所述荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体制造包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫；
11.将检测膜粘贴在衬板上，并将鼠二抗稀释液喷涂到所述检测膜上形成质控线，将人二抗稀释液喷涂到所述检测膜上形成检测线，所述鼠二抗稀释液由鼠二抗加入印膜缓冲液稀释而成，所述人二抗稀释液由人二抗加入印膜缓冲液稀释而成；
12.将所述衬板、所述样品垫、所述包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗
体释放垫和吸水纸按顺序组装得到检测血小板抗体的试剂卡。
13.通过采用上述方式对试剂卡进行制备，使得制备流程更加简化直接，使得制备更加方便，并使用所述荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体使得检测更加准确，从而提高整个流程的工作效率。
14.进一步地，所述荧光标记物为量子点微球或荧光素中任意一种。
15.进一步地，所述分别制作样品垫和释放垫包括：
16.将玻璃纤维材料或聚酯纤维材料浸没在样品垫缓冲液中，浸没30～60min，然后干燥间干燥5h以上，湿度控制在30％以下，得到所述样品垫；
17.将玻璃纤维材料或聚酯纤维材料浸没在释放垫缓冲液中，浸没30～60min，然后干燥间干燥5h以上，湿度控制在30％以下，得到所述释放垫。
18.进一步地，所述释放垫缓冲液的组分包括：质量百分浓度为0.1％～2％的牛血清白蛋白、质量百分浓度为1％～2％的蔗糖、10mmol/l～50mmol/l且ph8.0～9.0的三羟甲基氨基甲烷、质量百分浓度为0.1％～0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.02％～0.1％的proclin300以及纯化水。
19.进一步地，所述荧光标记物为所述量子点微球时，所述制备荧光标记物的具体步骤包括：
20.将第一量子点聚苯乙烯微球纯化后分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第一量子点聚苯乙烯微球水分散液，然后取3ml所述第一量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，以12000r/min的转速离心去除pah聚电解质，得到第二量子点聚苯乙烯微球；
21.将所述第二量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第二量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml所述第二量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，以12000r/min的转速离心去除多余的pss聚电解质，得到第三量子点聚苯乙烯微球；
22.将所述第三量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第三量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml所述第三量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pah聚电解质，得到第四量子点聚苯乙烯微球；
23.将所述第四量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第四量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml所述第四量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pss聚电解质，得到第五量子点聚苯乙烯微球；
24.将所述第五量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第五量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml所述第五量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pah聚电解质，得到第六量子点聚苯乙烯微球；
25.将所述第六量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第六量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml所述第六量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的
pss聚电解质，制得沉积有三层聚电解质层的量子点微球，其中每层聚电解质层都包括聚丙烯胺盐酸盐形成的内层和聚苯乙烯磺酸钠形成的外层，且聚苯乙烯磺酸钠形成的外层沉淀在聚丙烯胺盐酸盐形成的内层表面。
26.进一步地，在所述荧光标记物为所述量子点微球时，所述基于所述荧光标记物制造荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体的具体步骤包括：
27.加入鼠抗人血小板单克隆抗体，室温摇床孵育2h，以使鼠抗人血小板单克隆抗体与所述量子点微球结合；
28.加入0.5ml的量子点微球封闭液，孵化2.5h，然后以12000r/min的速度离心30min，离心2次，在温度条件为4℃保存，得到所述荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体。
29.进一步地，所述基于所述释放垫和所述荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体制造包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫包括：
30.将所述荧光物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体用量子点稀释缓冲液稀释至0.5μmol/l～2μmol/l；
31.利用划膜喷金仪，将所述量子点稀释缓冲液稀释至0.5μmol/l～2μmol/l的所述荧光物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体，以0.5μl/cm～2μl/cm的量喷涂在所述释放垫上，干燥0.5h～2h，以得所述包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫。
32.第二方面，本发明提供一种检测血小板抗体的试剂卡，包括衬板，检测膜设置在所述衬板上，检测线和质控线分别设置在所述检测膜上，吸水纸安装在所述衬板上，并覆盖所述检测膜靠近质控线的一端，释放垫安装在所述衬板上，所述释放垫的一端覆盖所述检测膜靠近所述检测线的一端，所述样品垫设置在所述衬板上，并覆盖所述释放垫的另一端，所述释放垫包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体，所述检测线由人二抗稀释液形成，所述质控线由鼠稀释液形成。
33.第三方面，本发明还提供一种检测血小板抗体的方法，包括：
34.收集患者血清样本；
35.收集供者血液制备血小板悬液，在血小板悬液中加入裂解液，充分裂解后在转速为1000rpm条件下离心5min后取上层清液，得到供者血小板溶液；
36.血清样本与供者血小板溶液混合孵育后，加入样本稀释液混匀，得到检测样品，所述样本稀释液包括浓度为0.01～0.03mol/l、ph7.2的pbs缓冲液、质量百分浓度为0.1％～2％的海藻糖、质量百分浓度为0.1％～1％的牛血清白蛋白(bsa)或酪蛋白、质量百分浓度为0.05％～0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.01％～0.1％的proclin300；
37.将所述检测样品滴加到所述试剂卡的加样孔内；
38.将所述试剂卡插入仪器，选择仪器自动计时3min～10min，以t/c的cut off为0.3进行判读，并打印结果。
39.第四方面，本发明还提供一种检测血小板抗体的试剂盒，包含检测血小板抗体的试剂卡和sd卡。
40.通过上述方式得到的试剂卡采用由荧光标记物制造标记的鼠抗人血小板单克隆抗体，在使用时可以直接和血小板抗体结合以避免被洗涤，然后直接通过检测线和质控线以展示结果，可以更加方便地对人血小板抗体进行标记和检测，从而使得检测更加方便快捷。
附图说明
41.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
42.图1是本发明的第一实施例的一种检测血小板抗体的试剂卡的结构图；
43.图2是本发明的第一实施例的一种检测血小板抗体的检测方法流程图；
44.图3是本发明的第二实施例的一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法的流程图；
45.图4是本发明的第三实施例的一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法的流程图；
46.图5是本发明的第四实施例的一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法的流程图。
47.附图标记：
48.1-样品垫、2-包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体的释放垫、3-检测膜、4-吸水纸、5-衬板、6-检测线、7-质控线。
具体实施方式
49.为了使本发明申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明申请，并不用于限定本发明申请。
50.应了解，在本发明申请实施例的描述中，多个(或多种)的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、“第五”、“第六”等只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
51.血小板抗原系指用同种免疫抗体检测出的血小板表面抗原。根据抗原的分布情况,血小板抗原可以分为两大类型:一类是与其他细胞或组织共有的抗原,包括hla(hmunaleukoeyte、ntigens升i类抗原,abh抗原,le、i及p抗原等,另一类是存在于血小板膜糖蛋白上的特异抗原(gpla,gplb,gpilb,gpila等),即hap(humnaplatelctanigine)s抗原,其多态性由糖蛋白中氨基酸排列顺序决定。人们所关注的主要是血小板表面的血小板特异性抗原hap和hla。
52.目前已有22个血小板抗原被正式命名,相应基因的dna序列也已清楚。其中12个抗原被列入6个遗传系统,为hap-1a、lb；hap2a、2b；hap3a、3b；hap4a、4b；hap5a、sb和hap15a、15b,其余抗原尚未达到系统标准。
53.相关技术中，对血小板抗体的检测方法有免疫细胞化学法、固相凝集法、微柱凝胶免疫法3种：
54.(1)免疫细胞化学法。该方法原理是血小板抗体与dami细胞上的gpⅱb/ⅲa等抗原结合，使其与igg发生反应，然后连接链亲和霉素-碱性磷酸酶复合物，从而作用于底物
fast-red显色。颜色呈红色则检测结果为阳性。缺点是实验要求高、操作复杂，需要特定的仪器设备，不利于基层医疗工作开展，成本高等。
55.(2)微柱凝胶免疫法。微柱凝胶免疫法技术利用传统抗原-抗体反应，若血小板上结合了血小板抗体，则红细胞上抗igg结合血小板抗体，导致凝胶介质中央有明显滞留，反之则在离心后沉降于凝胶介质底部。该技术用于临床具有方便、经济等优势，但血小板本身又有易活化、自身凝集的特点，且实验所需血小板悬液是随机采用的多人份o型机采血小板，其抗原谱不明，因此在实际临床工作中容易造成结果判读误差。
56.(3)固相凝集法。其检测原理是将待检血清或血浆加入到已包被抗人血小板单克隆抗体的微量反应板上进行反应，若待检血清或血浆中含有血小板抗体，则该抗体能够与检测孔中血小板单层结合，不能与检测孔中血小板单层结合的成分则被洗涤、清除。加入抗人igg及抗人igg致敏红细胞来指示反应结果。若待检样本中含有血小板抗体，则指示细胞会平铺在检测孔底部，即提示结果阳性，而阴性反应为指示细胞聚集于检测孔底部中央。缺点是操作繁琐、不支持单个样本检测。
57.免疫层析技术(immunochromatographic test strip，icts)是将膜层析技术与免疫标记相结合的检测技术。作为快速诊断试剂，因其操作简便、检测时间短、成本低廉、适用于现场检测(point-of-care test,poct)等优点，在生物医学、食品安全、农药残留、环境污染物检测中已得到广泛应用。免疫层析中常常引入标记材料，如胶体金、彩色乳胶、上转换颗粒、荧光素等，以可视化检测区抗原抗体反应。新型发光材料量子点(quantum dots)更是因为其优异的光学特性在免疫生物学和临床检验学等研究中显示出极大的应用价值。
58.基于上述相关技术，本发明申请提供一种检测血小板抗体的试剂卡、制备方法、检测血小板抗体的方法以及检测血小板抗体的试剂盒。
59.第一实施例
60.请参阅图1，本发明申请提供一种检测血小板抗体的试剂卡，包括：
61.衬板5，检测膜3设置在衬板5上，检测线6和质控线7分别设置在检测膜3上，吸水纸4安装在衬板5上，并覆盖检测膜3靠近质控线7的一端，包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体的释放垫2安装在衬板5上，包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体的释放垫2的一端覆盖检测膜3靠近检测线6的一端，样品垫1设置在衬板5上，并覆盖包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体的释放垫2的另一端，检测线6由人二抗稀释液形成，质控线7由鼠二抗稀释液形成。
62.通过上述实施例得到的试剂卡采用由荧光标记物制造标记的鼠抗人血小板单克隆抗体，在使用时可以直接和血小板抗体结合以避免被洗涤，然后直接通过检测线6和质控线7以展示结果，可以更加方便地对人血小板抗体进行标记和检测，从而使得检测更加方便快捷。
63.在本发明申请的一些实施例中，其中检测膜3可以是硝酸纤维素膜或醋酸纤维素莫或尼龙膜或聚四氟乙烯膜中的至少一种，衬板5可以为pvc板，鼠抗人血小板单克隆抗体为特异性针对hap-1a、lb；hap2a、2b；hap3a、3b；hap4a、4b；hap5a、sb和hap15a、15b中的一种或多种，本实施例对此并不作具体地限定。
64.基于上述方案，申请人进行了：
65.一、实验室性能验证
66.按照方法学鉴定，达到如下指标：
67.1、最低检测限
68.将血小板抗体的灵敏度参考品1:2、1:6、1:18、1:54稀释，稀释度为1:2、1:6的参考品检测应全为阳性，稀释度为1:18、1:54的参考品检测应全为阴性，本发明检测试剂卡的灵敏度符合要求。
[0069][0070]
2、阴性符合率
[0071]
检测20份血小板抗体阴性参考品，抗体结果全部为阴性，结果可见检测试剂卡的阴性符合率为100％。
[0072][0073]
3、阳性符合率
[0074]
检测20份血小板抗体阳性参考品抗体结果全部为阳性，结果可见检测试剂卡的阳性符合率为100％。
[0075][0076]
4、重复性
[0077]
取同一批号的检测试剂10人份，检测重复性参考品(r)，检测结果一致，检测结果
应均为阳性。
[0078][0079]
二、临床适用性验证
[0080]
将300份血清样本测值与医院临床确诊结果进行对比，比较本发明试剂卡与样本临床检测结果的阴阳性符合率，实验结果表明试剂卡的检测结果与核酸检测结果阴阳性符合率为99.33％。
[0081][0082]
请参阅图2，在上述试剂卡的基础上，本发明申请还提供一种检测血小板抗体的方法，包括：
[0083]
s101收集患者血清样本；
[0084]
具体的，采用正确医用技术收集血液样本(离后的血清血浆样本应在室温条件下4小时内完成检测；若不能及时检测，血清、血浆样本在2～8℃保存可储存24小时；长期于-20℃以下密封，保存避免反复冻融。本实施例优先选择血清样本进行检测。使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。
[0085]
s102收集供者血液制备血小板悬液，在血小板悬液中加入裂解液，充分裂解后转速为1000rpm条件下离心5min后取上层清液，得到血小板溶液；
[0086]
具体的，分别采集抗凝全血，转速设定为900rpm进行离心l0min,取上层富血小板血浆即prp。将该富血小板血浆在转速为3800rpm下离心5min，弃上层清液，取压积血小板用含有质量浓度为0.5％的edta且ph为7.2的pbs洗涤3次，最后一次洗涤后弃去上层清液，并用管壁上残留液体浮压积血小板。加入裂解液(ph为7.4的tris-hcl缓冲液和体积分数为0.5％的tritonx-100)，充分裂解后转速为1000rpm条件下离心5min后取上层清液备用。
[0087]
s103血清样本与供者血小板溶液混合孵育1min～10min，加入样本稀释液并混匀，得到检测样品；
[0088]
需要说明的是，本技术实施例的样本稀释液由浓度为0.01～0.03mol/l且ph7.2的
pbs缓冲液、质量百分浓度为0.1％～2％的海藻糖、质量百分浓度为0.1％～1％的牛血清白蛋白(bsa)或酪蛋白、质量百分浓度为0.05％～0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.01％～0.1％的proclin300制成，用于对患者血清进行稀释，使得检测效果更佳准确。
[0089]
s104将检测样品滴加到检测试剂盒的加样孔内；
[0090]
具体的，患者血清取20μl加入40μl血小板溶液中，混匀后孵育1min～10min，加入60μl的样本稀释液并混匀，取80μl垂直滴加于加样孔内。
[0091]
需要说明的是，在将检测样品滴加到检测试剂盒的加样孔内之前，还可以进行准备和校准，具体的，准备可以为，取出检测卡、稀释液、患者血清和供者血小板，平衡至室温后，拆开检测卡的铝箔袋包装并混匀液体组分。校准可以为，确认sd卡与试剂盒批号匹配，将sd卡插入干式免疫荧光分析仪中，具体操作步骤详见规定型号仪器的使用说明。
[0092]
s105将检测试剂卡插入仪器，选择仪器自动计时3min～10min，选择仪器自动计时3min～10min，以t/c的cut off为0.3进行判读，并打印结果。
[0093]
通过上述方式可以更加简单快速地对血小板抗体进行检测，从而可以提高检测效率。
[0094]
第二实施例
[0095]
请参阅图3，本发明还提供一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，包括：
[0096]
s201分别制作样品垫1和释放垫；
[0097]
s202制备荧光标记物；
[0098]
s203基于荧光标记物和鼠抗人血小板单克隆抗体制造荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体；
[0099]
s204基于释放垫和荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体制造包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫2；
[0100]
s205将检测膜3粘贴在衬板5上，并将鼠二抗稀释液喷涂到检测膜上形成质控线7，将人二抗稀释液喷涂到检测膜上形成检测线6，鼠二抗稀释液由鼠二抗加入印膜缓冲液稀释而成，人二抗稀释液由人二抗加入印膜缓冲液稀释而成；
[0101]
s206将衬板5、样品垫1、包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫2和吸水纸4按顺序组装得到检测血小板抗体的试剂卡。
[0102]
通过采用上述方式对试剂卡进行制备，使得制备流程更加简化直接，使得制备更加方便，并使用所述荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体使得检测更加准确，从而提高整个流程的工作效率。
[0103]
第三实施例
[0104]
量子点，又称半导体纳米晶，粒径约2-28纳米，主要由ii～ⅵ族或iii～v族元素组成，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光。
[0105]
具体地，量子点标记具有以下多个优势：
[0106]
1、光稳定性好：具有很好的光稳定性，耐光漂白，适用于长时间稳定激发动态观察以及结果存档；
[0107]
2、斯托克斯位移大：多色激发干扰小，光谱对称、stokes位移大，可通过调整激发光波长或使用滤光片，消除背景，提高灵敏度；
[0108]
3、激发光谱宽：发射光谱较窄且呈对称分布使得量子点可以用于多种组分的多色
标记，实现多组份同步检测；
[0109]
4、生物相容性好：尤其是经过各种化学修饰之后，可以进行特异性连接，细胞毒性低，对生物体危害小，更适用于生物活体标记和检测；
[0110]
5、荧光寿命长：有机荧光染料的荧光寿命一般仅为几纳秒，而量子点的荧光寿命可持续数十纳秒(20ns-50ns)，这使得光激发后，大多数生物自发荧光已经衰变，而量子点荧光仍然存在，此时即可得到无背景干扰的荧光信号，提高灵敏度。
[0111]
在上述相关技术和第二实施例的基础上，请参阅图4，本发明申请提供一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，且荧光标记物采用量子点微球，包括：
[0112]
s301分别制作样品垫1和释放垫；
[0113]
此步骤中，样品垫1的制备方法包括：将玻璃纤维材质或聚酯纤维材质浸没在样品垫缓冲液中，浸没30～60min，然后干燥间干燥5h以上，湿度控制在30％以下，得到样品垫1。需要说明的是，样品垫缓冲液可以包括
[0114]
10mmol/l～50mmol/l且ph8.0～9.0的三羟甲基氨基甲烷(tris)、质量百分浓度为0.1％～0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.02％～0.1％的proclin300、以及余量的纯化水。
[0115]
释放垫的制备方法包括：将玻璃纤维材质或聚酯纤维材质浸没在释放垫缓冲液中，浸没30～60min，然后干燥间干燥5h以上，湿度控制在30％以下，得到释放垫。释放垫缓冲液的组分包括：质量百分浓度为0.1％～2％的牛血清白蛋白(bsa)、质量百分浓度为1％～2％的蔗糖、10mmol/l～50mmol/l和ph8.0～9.0的三羟甲基氨基甲烷(tris)、质量百分浓度为0.1％～0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.02％～0.1％的proclin300以及纯化水。
[0116]
s302制备量子点微球，具体步骤是：
[0117]
将第一量子点聚苯乙烯微球纯化后分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第一量子点聚苯乙烯微球水分散液，然后取3ml第一量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，以12000r/min的转速离心去除pah聚电解质，得到第二量子点聚苯乙烯微球；
[0118]
将第二量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第二量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml第二量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，以12000r/min的转速离心去除多余的pss聚电解质，得到第三量子点聚苯乙烯微球；
[0119]
将第三量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第三量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml第三量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pah聚电解质，得到第四量子点聚苯乙烯微球；
[0120]
将第四量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第四量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml第四量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pss聚电解质，得到第五量子点聚苯乙烯微球；
[0121]
将第五量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第五量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3mll第五量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚丙
烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pah聚电解质，得到第六量子点聚苯乙烯微球；
[0122]
将第六量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第六量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml第六量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pss聚电解质，制得沉积有三层聚电解质层的量子点微球，其中每层聚电解质层都包括聚丙烯胺盐酸盐形成的内层和聚苯乙烯磺酸钠形成的外层，且聚苯乙烯磺酸钠形成的外层沉淀在聚丙烯胺盐酸盐形成的内层表面。
[0123]
需要说明的是，本技术实施例中的“第一量子点聚苯乙烯微球”、“第二量子点聚苯乙烯微球”、“第三量子点聚苯乙烯微球”、“第四量子点聚苯乙烯微球”、“第五量子点聚苯乙烯微球”以及“第六量子点聚苯乙烯微球”可以为，含有不同聚电解质层的量子点聚苯乙烯微球，其中聚电解质可以包括，pah聚电解质或者pss聚电解质。
[0124]
需要说明的是，本技术实施例中的“第一量子点聚苯乙烯微球水分散液”、“第二量子点聚苯乙烯微球水分散液”、“第三量子点聚苯乙烯微球水分散液”、“第四量子点聚苯乙烯微球水分散液”、“第五量子点聚苯乙烯微球水分散液”以及“第六量子点聚苯乙烯微球水分散液”可以为，相同浓度，但含有不同聚电解质层的量子点聚苯乙烯微球水分散液，其中聚电解质可以包括，pah聚电解质或者pss聚电解质。
[0125]
可以理解的是，本实施例中的量子点微球可以为，cdte/cds、cds/zns、cdse/cds、cdse/zns、inp/zns、znse/zns中的一种或多种，量子点微球的直径可以为2nm～28nm。
[0126]
在本发明申请的一些实施例中，制备量子点微球使用的聚丙烯胺盐酸盐(pah)溶液的浓度可以为，1～4mg/ml，溶剂可以为超纯水，聚苯乙烯磺酸钠(pss)溶液的浓度可以为1～3mg/ml，溶剂可以为超纯水。
[0127]
在本发明申请的一些实施例中，量子点微球的制备方法可以为，通过将电解质层组成成分中的，聚丙烯胺盐酸盐(pah)溶液浓度保持不变，聚苯乙烯磺酸钠(pss)溶液浓度保持不变后，对量子点聚苯乙烯微球的浓度进行确认，经过实验得知，量子点聚苯乙烯微球浓度为2.5-4mg/ml时，可以达到基本相同的信号强度，其中，当量子点聚苯乙烯微球浓度为3mg/ml时，量子点微球的信号强度更好。
[0128]
s303基于量子点微球和鼠抗人血小板单克隆抗体制造量子点微球标记的鼠抗人血小板单克隆抗体；
[0129]
在本发明申请的一些实施例中，当荧光标记物为量子点微球时，量子点微球标记鼠抗人血小板单克隆抗体的步骤可以包括：一定量的量子点微球中加入edc和sulfo-nhs,加磷酸盐缓冲液补液并不停地混合溶液,室温下反应一定时间。加入鼠抗人血小板单克隆抗体，恒温振荡反应一定时间。加入一定量甘氨酸封闭量子点上未反应的羧基。将偶联反应所得到的产物离心,所得沉淀即为纯化的偶联有量子点的鼠抗人血小板单克隆抗体。
[0130]
具体步骤是：将1mg量子点微球加入10ml磷酸盐缓冲液中，分散均匀。加入0.8mg的鼠抗人血小板单克隆抗体，室温摇床孵育2h，使鼠抗人血小板单克隆抗体与量子点微球结合。加入0.5ml的量子点微球封闭液，孵化2.5h，然后以12000r/min的速度离心30min，离心2次，在温度条件为4℃保存，得到量子点微球标记的鼠抗人血小板单克隆抗体。
[0131]
需要说明的是，量子点微球封闭液可以由质量百分浓度为5％～10％的牛血清白
蛋白(bsa)、质量百分浓度为0.01％～0.05％的nan3、以及余量的纯化水组成。
[0132]
其中，磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液)组成为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，抗体为鼠抗人血小板单克隆抗体(针对hap-1a、lb；hap2a、2b；hap3a、3b；hap4a、4b；hap5a、sb和hap15a、15b等抗原中的一种或多种)。
[0133]
其中，抗体为鼠抗人血小板单克隆抗体(针对hap-1a、lb；hap2a、2b；hap3a、3b；hap4a、4b；hap5a、sb和hap15a、15b等抗原中的一种或多种)。
[0134]
s304基于释放垫和量子点微球标记的鼠抗人血小板单克隆抗体制造包被有标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫2；
[0135]
将量子点微球标记的鼠抗人血小板单克隆抗体用量子点稀释缓冲液稀释至0.5μmol/l～2μmol/l，然后用划膜喷金仪以0.5μl/cm～2μl/cm的量喷涂在释放垫上，干燥0.5h～2h，得到包被有标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫2。
[0136]
需要说明的是，上述实施例中的量子点稀释缓冲液由质量百分浓度为0.1％～2％的牛血清白蛋白(bsa)、质量百分浓度为1％～2％的蔗糖、10mmol/l～50mmol/l、ph8.0～9.0的三羟甲基氨基甲烷(tris)、质量百分浓度为0.1％～0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.02％～0.1％的proclin300、以及余量的纯化水组成。
[0137]
s305将检测膜3粘贴在衬板5上，并将鼠二抗稀释液喷涂到检测膜3上形成质控线7，将人二抗稀释液喷涂到检测膜3上形成检测线6，鼠二抗稀释液由鼠二抗加入印膜缓冲液稀释而成，人二抗稀释液由人二抗加入印膜缓冲液稀释而成。
[0138]
在本技术实施例中，衬板5可以为pvc板，检测膜3的组成成分可以为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜或尼龙膜或聚四氟乙烯膜中的至少一种，具体方式是将检测膜3粘贴到衬板5上，固定质控线7鼠二抗的前提下对搭配人二抗浓度进行筛选优化。将选定的人二抗用印膜缓冲液分别稀释成个浓度规格的样品，浓度分别为0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、2mg/ml，搭配用印膜缓冲液稀释成0.8mg/ml的鼠二抗浓度进行确定。将人二抗稀释液用划膜喷金仪以1μl/cm的量喷涂在检测膜3上，干燥0.5h制得检测线6；将人二抗稀释液用划膜喷金仪以1μl/cm的量喷涂在检测膜3上，干燥0.5h制得质控线7。
[0139]
需要说明的是，上述实施例中的印膜缓冲液由浓度为0.01～0.03mol/l、ph7.2的pbs缓冲液、质量百分浓度为0.1％～2％的海藻糖、浓度为5mmol/l～10mmol/l的乙二胺四乙酸(edta)、质量百分浓度为0.01％～0.1％的proclin300组成。
[0140]
在本发明申请的一些实施例中，人二抗浓度和人二抗浓度可以通过对照的方式进行确认，例如，当人二抗浓度0.6mg/ml～1.0mg/ml时，满足实验要求，则选取人二抗浓度为0.6mg/ml～1.0mg/ml。
[0141]
s306将衬板5、样品垫1、包被有标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫2和吸水纸4按顺序组装得到检测血小板抗体的试剂卡。
[0142]
此步骤中，将制得的粘贴有检测膜3的衬板5、步骤s301制备的得到的样品垫1、步骤s304制得的包被有标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫2、吸水纸4按照由上到下、由内到外的顺序组装得到检测血小板抗体的试剂卡。
[0143]
上述实施例主要采用量子点微球进行标记，量子点，又称半导体纳米晶，粒径约2-28纳米，主要由ii～ⅵ族或iii～v族元素组成，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光，可以进行特异性连接，细胞毒性低，对生物体危害小，更适用于生物活体
标记和检测，使得检测结果更好。
[0144]
第四实施例
[0145]
请参阅图5，在第二实施例的基础上，本发明提供一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，且荧光标记物为荧光素，包括：
[0146]
s401分别制作样品垫1和释放垫；
[0147]
此步骤与第二实施例相同，不在赘述。
[0148]
s402制备荧光素；
[0149]
荧光素采用异硫氰酸荧光素、羟基荧光素、四氯荧光素、四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明中的任意一种。
[0150]
s403基于荧光素和鼠抗人血小板单克隆抗体制造荧光素标记的鼠抗人血小板单克隆抗体；
[0151]
在本发明申请的一些实施例中，当荧光标记物为荧光素时，荧光素标记鼠抗人血小板单克隆抗体的步骤可以包括：取一定量鼠抗人血小板单克隆抗体，用标记反应液透析多次，将荧光素溶于dmso中，配制一定浓度。将一定量荧光素缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光反应一定时间。加入nh4cl，终止反应一段时间。将标记产物在pbs中透析多次，至透析液清亮。
[0152]
具体方法是：取2mg/ml鼠抗人血小板单克隆抗体(针对hap-1a、lb；hap2a、2b；hap3a、3b；hap4a、4b；hap5a、sb和hap15a、15b等抗原中的一种或多种)5ml，用标记反应液4℃透析3次，将荧光素溶于dmso中，配制浓度20mg/ml。将75ul荧光素缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光4℃反应8h。加入5m的nh4cl 50ul～200ul，4℃终止反应2h。将标记产物在pbs中透析4次以上，至透析液清亮。
[0153]
其中标记反应液可以采用碳酸氢钠、碳酸钠与氯化钠中的任意一种。
[0154]
s404基于释放垫和荧光素标记的鼠抗人血小板单克隆抗体制造包被有标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫2；
[0155]
具体方式是将荧光素标记的鼠抗人血小板单克隆抗体用标记稀释缓冲液稀释至0.5μmol/l～2μmol/l，然后用划膜喷金仪以0.5μl/cm～2μl/cm的量喷涂在释放垫上，干燥0.5h～2h。
[0156]
需要说明的是，上述实施例中的标记稀释缓冲液由质量百分浓度为0.1％～2％的牛血清白蛋白(bsa)、质量百分浓度为1％～2％的蔗糖、10mmol/l～50mmo l/l且ph8.0～9.0的三羟甲基氨基甲烷(tris)、质量百分浓度为0.1％～0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.02％～0.1％的proclin300、以及余量的纯化水组成。
[0157]
s405将检测膜3粘贴在衬板5上，并将鼠二抗稀释液喷涂到检测膜3上形成质控线7，将人二抗稀释液喷涂到检测膜3上形成检测线6，鼠二抗稀释液由鼠二抗加入印膜缓冲液稀释而成，人二抗稀释液由人二抗加入印膜缓冲液稀释而成；
[0158]
s406将衬板5、样品垫1、包被有标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫2和吸水纸4按顺序组装得到检测血小板抗体的试剂卡。
[0159]
步骤s405和s406与实施例2相同，不再赘述。
[0160]
荧光素是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。采用上述方式可以
更加有效率地制备包被有标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫，采用荧光素作为标记物后，使得检测效果更加显著，且灵敏度更好。
[0161]
另一方面，本实施例还提供一种检测血小板抗体的试剂盒，该试剂盒可以包括第一实施例的一种检测血小板抗体的试剂卡和sd卡，该sd卡中含有标准曲线。
[0162]
在本发明申请的一些实施例中，检测样本加入试剂卡后，将试剂卡插入干式免疫荧光分析仪，读取检测样本中血小板抗体的信号值，将sd卡插入干式免疫荧光分析仪中，根据检测样本中血小板抗体的信号值和sd卡中的标准曲线得出血小板抗体的浓度值。
[0163]
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。
技术特征：1.一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，其特征在于，包括：分别制作样品垫和释放垫；制备荧光标记物；基于所述荧光标记物和鼠抗人血小板单克隆抗体制造荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体；基于所述释放垫和所述荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体制造包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫；将检测膜粘贴在衬板上，并将鼠二抗稀释液喷涂到所述检测膜上形成质控线，将人二抗稀释液喷涂到所述检测膜上形成检测线，所述鼠二抗稀释液由鼠二抗加入印膜缓冲液稀释而成，所述人二抗稀释液由人二抗加入印膜缓冲液稀释而成；将所述衬板、所述样品垫、所述包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫和吸水纸按顺序组装得到检测血小板抗体的试剂卡。2.如权利要求1所述的一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，其特征在于，所述荧光标记物为量子点微球或荧光素中任意一种。3.如权利要求1所述的一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，其特征在于，所述分别制作样品垫和释放垫包括：将玻璃纤维材料或聚酯纤维材料浸没在样品垫缓冲液中，浸没30～60min，然后干燥间干燥5h以上，湿度控制在30％以下，得到所述样品垫；将玻璃纤维材料或聚酯纤维材料浸没在释放垫缓冲液中，浸没30～60min，然后干燥间干燥5h以上，湿度控制在30％以下，得到所述释放垫。4.如权利要求3所述的一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，其特征在于，所述释放垫缓冲液的组分包括：质量百分浓度为0.1％～2％的牛血清白蛋白、质量百分浓度为1％～2％的蔗糖、10mmol/l～50mmol/l且ph8.0～9.0的三羟甲基氨基甲烷、质量百分浓度为0.1％～0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.02％～0.1％的proclin300以及纯化水。5.如权利要求2所述的一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，其特征在于，所述荧光标记物为所述量子点微球时，所述制备荧光标记物的具体步骤包括：将第一量子点聚苯乙烯微球纯化后分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第一量子点聚苯乙烯微球水分散液，然后取3ml所述第一量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，以12000r/min的转速离心去除pah聚电解质，得到第二量子点聚苯乙烯微球；将所述第二量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第二量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml所述第二量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，以12000r/min的转速离心去除多余的pss聚电解质，得到第三量子点聚苯乙烯微球；将所述第三量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第三量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml所述第三量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pah聚电解质，得到第四量子点聚苯乙烯微球；
将所述第四量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第四量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml所述第四量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pss聚电解质，得到第五量子点聚苯乙烯微球；将所述第五量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第五量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml所述第五量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚丙烯胺盐酸盐溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pah聚电解质，得到第六量子点聚苯乙烯微球；将所述第六量子点聚苯乙烯微球分散在超纯水中，稀释至浓度为3mg/ml，得到第六量子点聚苯乙烯微球水分散液，取3ml所述第六量子点聚苯乙烯微球水分散液，加入200ml的聚苯乙烯磺酸钠溶液，摇床孵化30min，然后以12000r/min的转速离心去除多余的pss聚电解质，制得沉积有三层聚电解质层的量子点微球，其中每层聚电解质层都包括聚丙烯胺盐酸盐形成的内层和聚苯乙烯磺酸钠形成的外层，且聚苯乙烯磺酸钠形成的外层沉淀在聚丙烯胺盐酸盐形成的内层表面。6.如权利要求2所述的一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，其特征在于，在所述荧光标记物为所述量子点微球时，所述基于所述荧光标记物制造荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体的具体步骤包括：加入鼠抗人血小板单克隆抗体，室温摇床孵育2h，以使鼠抗人血小板单克隆抗体与所述量子点微球结合；加入0.5ml的量子点微球封闭液，孵化2.5h，然后以12000r/min的速度离心30min，离心2次，在温度条件为4℃保存，得到所述荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体。7.如权利要求1所述的一种检测血小板抗体的试剂卡的制备方法，其特征在于，所述基于所述释放垫和所述荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体制造包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫包括：将所述荧光物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体用量子点稀释缓冲液稀释至0.5μmol/l～2μmol/l；利用划膜喷金仪，将所述量子点稀释缓冲液稀释至0.5μmol/l～2μmol/l的所述荧光物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体，以0.5μl/cm～2μl/cm的量喷涂在所述释放垫上，干燥0.5h～2h，以得所述包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫。8.一种检测血小板抗体的试剂卡，采用如权利要求1所述的检测血小板抗体的试剂卡的制备方法制备，其特征在于，所述检测血小板抗体的试剂卡包括衬板，检测膜设置在所述衬板上，检测线和质控线分别设置在所述检测膜上，吸水纸安装在所述衬板上，并覆盖所述检测膜靠近质控线的一端，释放垫安装在所述衬板上，所述释放垫的一端覆盖所述检测膜靠近所述检测线的一端，所述样品垫设置在所述衬板上，并覆盖所述释放垫的另一端，所述释放垫包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体，所述检测线由人二抗稀释液形成，所述质控线由鼠二抗稀释液形成。9.一种检测血小板抗体的方法，采用如权利要求8所述的检测血小板抗体的试剂卡，其特征在于，包括：
收集患者血清样本；收集供者血液制备血小板悬液，在血小板悬液中加入裂解液，充分裂解后在转速为1000rpm条件下离心5min后取上层清液，得到供者血小板溶液；血清样本与供者血小板溶液混合孵育后，加入样本稀释液混匀，得到检测样品，所述样本稀释液包括浓度为0.01～0.03mol/l、ph7.2的pbs缓冲液、质量百分浓度为0.1％～2％的海藻糖、质量百分浓度为0.1％～1％的牛血清白蛋白或酪蛋白、质量百分浓度为0.05％～0.5％的吐温20、质量百分浓度为0.01％～0.1％的proclin300；将所述检测样品滴加到所述试剂卡的加样孔内；将所述试剂卡插入仪器，选择仪器自动计时3min～10min，以t/c的cut off为0.3进行判读，并打印结果。10.一种检测血小板抗体的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求8所述的检测血小板抗体的试剂卡和sd卡。
技术总结本发明涉及免疫层析技术领域，具体涉及一种检测血小板抗体的试剂卡及制备方法，分别制作样品垫和释放垫；制备荧光标记物；基于所述荧光标记物和鼠抗人血小板单克隆抗体制造荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体，然后制造包被有荧光标记物标记的鼠抗人血小板单克隆抗体释放垫；将检测膜粘贴在衬板上，并将鼠二抗稀释液喷涂到所述检测膜上形成质控线，将人二抗稀释液喷涂到所述检测膜上形成检测线，然后组装得到检测血小板抗体的试剂卡。从而利用荧光标记物标记的方法，提供一种操作简单、可高效、准确地检测血小板抗体的检测试剂卡。可以用于临床快速诊断。可以用于临床快速诊断。可以用于临床快速诊断。
技术研发人员：左云国 方陈城 吕航 孙婵
受保护的技术使用者：重庆新赛亚生物科技有限公司
技术研发日：2022.06.16
技术公布日：2022/11/1
