一种pdans-bsa复合材料的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及复合型纳米颗粒技术领域，尤其涉及一种pdans-bsa复合材料的制备方法及其应用。
背景技术：2.随着纳米技术的发展，生物分子-纳米颗粒复合物广泛应用于生物医学领域。纳米级生物材料表面修饰被认为是一种有效的改变细胞粘附、生长和定位的方法。被称为蛋白冠(protein corona，pc)的蛋白质涂层是一种优秀、简单、成本效益高的技术，pc可以通过形成蛋白质外壳和纳米颗粒周围的动态层来诱导所需的性能，从而改变纳米结构表面的物理化学特征，如组成、大小、表面电荷、粗糙度和功能。
3.目前，形成pc主要通过有两种途径，第一种途径为细胞培养基中现有的蛋白质被表面吸收，促进细胞与底物的粘附；第二种途径为在使用细胞培养基之前，纳米结构被涂上单一蛋白质或特定的系列蛋白质。
4.现有的利用pc技术的方法虽然在组织工程领域取得了显著的成就，但它们也存在不足，其中，最重要的是异质性反应、所需细胞反应的低效率和生物相容性的低效率、均匀性的损失、高成本。
5.在生物材料中，聚多巴胺(pda)因其生物相容性、亲水性、生物活性和生物粘附性等特性而被认为是一种很有前途的组织工程候选材料。这些性质是由含有儿茶酚胺和羟基官能团引起的。
6.牛血清白蛋白(bsa)是血浆中丰富的多功能蛋白之一，一种带负电荷的球形水溶性蛋白质，结构呈心形，分子量为66kda，由583个氨基酸残基组成，参与重要的生理功能，非糖基化牛血清白蛋白在生物医学领域有很多应用，被称为第一个用于生物医学应用的生物分子。bsa的α-螺旋结构域的氨基酸序列分别为 i(1-195)、ii(196-383)和iii(384-583)。因此，结构动态使bsa在与其他分子相互作用时变得灵活。此外，bsa具有高度的定位于固体表面如纳米颗粒的倾向。
7.因此，本领域的技术人员致力于开发一种利用pc进行表面修饰的方法，通过控制蛋白质纳米级生物材料形成理想的pc，从而影响生物材料与细胞的相互作用。
技术实现要素：8.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是通过控制蛋白质之间的相互作用和聚集、蛋白质的最佳浓度、形状和大小的高度均匀性、蛋白质的结构动力学和生物相容性，有规律地在纳米颗粒表面形成“蛋白冠”，为组织工程提供了一种控制蛋白-纳米粒子相互作用的新方法。
9.为实现上述目的，本发明提供了一种pdans-bsa复合材料制备方法，包括以下步骤：
10.步骤1、合成聚多巴胺纳米球(pda nanosphere，pdans)
11.步骤2、荧光光谱技术测定pdans吸附bsa的吸附性能：
12.步骤3、pdans-bsa复合材料的形成：
13.根据步骤2的结果，将bsa添加到pdans溶液中充分混合，离心洗涤。
14.进一步地，所述步骤1具体为：
15.步骤1.1、在碱性条件下，盐酸多巴胺自发氧化生成pdans；
16.步骤1.2、制备乙醇、异丙醇和去离子水溶液；
17.步骤1.3、将tris-buffer溶液加入到步骤1.2得到的混合物中，同时搅拌，转速为250rpm；通过hcl调整溶液的ph；
18.步骤1.4、将浓度为1.5mg/ml的多巴胺-盐酸逐滴加入到步骤1.3得到的溶液中，至溶液变成深棕色；
19.步骤1.5、避光条件下，步骤1.4得到的溶液在室温下搅拌72小时后，再使用去离子水离心3次，9000rpm，之后置于冷冻干燥机中，-58℃，压力0.5torr，冷冻干燥48小时，获得干黑粉末pdans。
20.优选地，步骤1.3中所述tris-buffer溶液的浓度10mm。
21.优选地，步骤1.3中所述hcl的浓度为1m，将ph调至8.5。
22.进一步地，步骤2具体包括以下步骤：
23.步骤2.1、配制10mm nacl溶液，调整ph为7，用于bsa溶剂化；
24.步骤2.2、用荧光光谱仪测量不同温度下(25、31和37℃)bsa的本征荧光；
25.步骤2.3、在bsa溶液中加入不同浓度的pdans，对体系中的bsa进一步测试荧光发射光谱：
26.激发波长调整为290nm，在300～500nm范围内记录发射光谱，激发和发射的狭缝尺寸设为10nm；
27.优选地，步骤2.3中，加入pdans后，每次孵育时间为3分钟；
28.步骤2.5、数据采用stern-volmer图进行分析。
29.优选地，所述bsa为nacl溶液制备的5μm bsa溶液。
30.优选地，步骤2.3中所述pdans浓度范围为0～62μm。
31.进一步地，所述步骤3具体为将1mg/ml bsa与pdans水溶液在37℃下充分混合10分钟，反应混合物在18000g下离心30分钟，洗涤三次。
32.本发明还提供了一种利用如权利要求1-9所述的任一项制备方法获得的pdans-bsa复合材料再生医学和皮肤疤痕、伤口愈合中的应用。
33.本发明的有益效果：
34.1)表面改性制备方法简单、快速，不再需要表面功能化或使用任何技术来修饰表面；
35.2)通过计算蛋白质与纳米粒子的最佳反应比例：采用优化后的浓度进行表面改性，使其具有理想的形状和粗糙度以及均匀性，更好的控制蛋白质对纳米材料的表面改性
36.3)形成具有动态特性的pc薄层：所述蛋白质层在10层以下形成，这些蛋白质吸附层纳米颗粒提供了动态表面；
37.4)避免聚合：bsa与pdans相互作用是一层控制一层形成，bsa-bsa相互作用有序形成，pc层的形成没有形成均匀表面，没有出现明显的蛋白聚集。
38.5)层的灵活性：由于在pdans上采用了bsa表面，同时保持了bsa的结构动态，通过pc技术提出的层比现有的表面改性方法更加灵活；
39.6)与现有方法相比，本方法具有成本效益；
40.7)提高纳米颗粒的生物相容性，应用于生物医学，特别是骨组织工程，有利于提高骨组织工程表面改性效率。
附图说明
41.图1是通过bsa修饰pdans表面的示意图；
42.图2是pdans合成原理图；
43.图3是盐酸多巴胺与pdans的ftir光谱；
44.图4是pdans的fe-sem显微图；
45.图5是bsa与pdans的相互作用光谱图；
46.图6是bsa与pdans结合的热力学结果示意图；
47.图7是pdans-bsa复合材料形成示意图；
48.图8是pdans-bsa复合材料的fe-sem显微图；
49.图9是骨髓间充质干细胞附着在pdans上的fe-sem显微图；
50.图10是骨髓间充质干细胞附着在pdans-bsa复合材料的fe-sem显微图。
具体实施方式
51.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
52.实施例1、pdans合成
53.1.在碱性条件下，盐酸多巴胺自发氧化生成pdans。
54.2.异丙醇、乙醇和去离子水混合物
55.3.将tris-buffer(10mm)溶液加入到酒精/水的混合物中，同时轻轻地搅拌(250 rpm)。
56.4.通过hcl(1m)将ph调至8.5。
57.5.将制备好的溶液用浓度为1.5mg/ml的多巴胺-盐酸(以去离子水为标准)直接逐滴稀释。
58.6.盐酸多巴胺以30滴/分钟的速度滴加。
59.7.溶液变成了浅棕色，然后是深棕色。
60.8.在一间黑暗的房间里，最后的混合物在室温下搅拌72小时。
61.9.温度-58℃，压力0.5torr，去水离心3次，9000rpm，再置于冷冻干燥机中，冷冻干燥48小时。
62.10.制备了干黑粉末pdans。
63.如图2所示，在碱性条件下合成了pdans，如图3所示，ftir光谱证实了pdans 的形成，如图4所示由fe-sem得到的pdans为球形，尺寸在400nm范围内。
64.实施例2、pdans与bsa最佳吸附情况
65.1.用nacl溶液制备bsa溶液(5μm)。
66.2.配制10mm nacl溶液，调整ph为7，用于牛血清白蛋白溶剂化。
67.3.用荧光光谱仪测量不同温度下(25、31和37℃)的bsa的本征荧光。
68.4.在bsa溶液中加入不同浓度的pdans(0-62μm)进行结合测定。
69.5.激发波长调整为290nm。
70.6.在300～500nm范围内记录发射光谱。
71.7.激发和发射的狭缝尺寸设为10nm。
72.8.加入pdans后，每次交互孵育时间为3分钟。
73.9.数据采用stern-volmer图进行分析。
74.如图5所示，bsa的固有荧光在pdans的存在下被淬灭，说明pdans与bsa 相互作用。
75.如图5所示，bsa的结构并没有因为pdans的相互作用而发生明显的变化；如图6所示bsa与pdans的比例为1:1，显示了制备pc的最佳浓度。
76.实施例3、pdans-bsa复合材料的形成
77.1.根据结合结果，将1mg/ml bsa与pdans水溶液在37℃下充分混合10分钟。
78.2.为获得pdans-bsa复合材料，将反应混合物在18000g下离心30分钟。
79.3.为了除去溶液中的游离蛋白质，将混合物洗涤三次。
80.如图7和8所示，bsa作为均匀的pc层涂覆在pdans表面，pc的形成没有改变pdans的形状，也没有聚集。
81.实施例4:细胞附着的表面性质
82.如图9和图10所示，pc层的形成增强了细胞和纳米颗粒表面之间的相互作用。通过计算出最佳的蛋白质-纳米颗粒相互作用比例，就有可能创造出一种不聚集的均匀的pc层，这就导致了表面修饰，改善了细胞与表面的相互作用。
83.1)本发明技术设计中最重要的部分是计算蛋白质与纳米颗粒的最佳反应比例，形成一层薄薄的蛋白冠。正如技术解决方案部分所提到的，光谱和计算方法是测量结合比例的关键，表明蛋白质和纳米颗粒的最佳比例。在纳米颗粒的最佳浓度下，蛋白质结构不会因纳米颗粒的存在而发生变性。
84.2)纳米颗粒不造成蛋白质变性很重要，蛋白质的任何结构变性都会导致pc层的有序结构的丧失。在不同浓度的pdans存在下，蛋白固有荧光有规律地熄灭，表明蛋白结构没有明显变化。因此，光谱研究表明，与纳米颗粒相互作用后，蛋白质结构不被降解。
85.3)如上所述，必须考虑最佳蛋白冠形成参数。正如技术方案中提到的，培养时间是一个需要精确调整的因素，以便获得尺寸相同、分布均匀的纳米粒子-蛋白质电晕。此外，分离的条件，包括考虑g值的温度和转速，必须正确调整。他们的最佳调整导致了相同大小的纳米粒子-均匀分布的蛋白冠，这在技术解决方案部分也提到了。
86.因此，基于上述，本发明的独特实施例是通过分析蛋白质-纳米颗粒相互作用的结合特性，在纳米颗粒表面创建均匀有序的pc层。通过在孵育过程中找到蛋白质和纳米颗粒浓度的最佳比例，然后进行孵育，就形成了一个薄的、均匀的、有序的层。在这一过程中，孵育时间和温度是重要因素。另一个关键步骤是计算出蛋白质和纳米颗粒的最佳浓度，并控制其复合物的形成，薄的pc层才能用于组织工程。本发明对创建用于组织工程的薄pc层至关重要，该薄pc层是通过测量蛋白质-纳米颗粒络合的结合参数来控制的。
87.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
技术特征：1.一种pdans-bsa复合材料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、合成pdans步骤2、荧光光谱技术测定pdans对bsa的吸附情况：步骤3、pdans-bsa“蛋白冠”的形成：根据步骤2的结果，将bsa添加到pdans溶液中充分混合，离心洗涤。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体为：步骤1.1、在碱性条件下，盐酸多巴胺自发氧化生成pdans；步骤1.2、异丙醇与去离子水按照体积比2:5混合；步骤1.3、将tris-buffer溶液加入到步骤1.2得到的混合物中，同时搅拌，转速为250rpm，使用hcl调整ph；步骤1.4、将浓度为1.5mg/ml的多巴胺-盐酸逐滴加入到步骤1.3得到的溶液中，至溶液变成深棕色；步骤1.5、避光条件下，步骤1.4得到的溶液在室温下搅拌72小时后，再使用去离子水离心3次，9000rpm，之后置于冷冻干燥机中，-58℃，压力0.5torr，冷冻干燥48小时，获得干黑粉末pdans。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1.3中所述tris-buffer溶液的浓度10mm。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1.3中所述hcl的浓度为1m，将ph调至8.5。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2具体包括：步骤2.1、配制10mm nacl溶液，调整ph为7，用于bsa溶剂化；步骤2.2、使用荧光光谱仪分别检测在25、31和37℃温度下的bsa的本征荧光；步骤2.3、在bsa溶液中加入不同浓度的pdans测定bsa的荧光发射光谱：激发波长调整为290nm，在300～500nm范围内记录发射光谱，激发和发射的狭缝尺寸设为10nm；步骤2.4、数据采用stern-volmer图进行分析。6.如权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，所述bsa为nacl溶液制备的5μm bsa溶液。7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2.3中所述不同浓度pdans加入bsa溶液中，每次反应孵育时间为3分钟。8.如权利要求5或7所述的制备方法，其特征在于，步骤2.3中所述pdans浓度范围为0～62μm。9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体为将1mg/ml bsa与pdans水溶液在37℃下充分混合10分钟，反应混合物在18000g下离心30分钟，洗涤三次。10.利用如权利要求1～9所述的任一项制备方法获得的pdans-bsa复合材料在再生医学和皮肤疤痕、伤口愈合中的应用。
技术总结本发明公开了一种PDANS-BSA复合材料的制备方法及其应用，包括PDANS合成、荧光光谱技术测定PDANS对BSA吸附情况和PDANS表面BSA“蛋白冠”的形成，本发明技术方案制备过程简单、快速，能获得理想的形状、粗糙度以及均匀性，提高纳米颗粒的生物相容性，有利于生物分子-纳米颗粒复合物在生物医学中的应用。颗粒复合物在生物医学中的应用。颗粒复合物在生物医学中的应用。
技术研发人员：丁显廷 贝法利德
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2022.06.28
技术公布日：2022/11/1
