生成生物分子的方法和系统
交叉引用
1.本技术要求于2019年11月15日提交的美国临时专利申请号62/935,637的权益，该临时专利申请的全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
背景技术：2.按需生产分子的能力在诸如制药和生命科学研究的各个领域都具有重大意义。制造的生物分子可能含有杂质，杂质增加生物分子制备的成本以及制备生物分子所需的时间。特别地，制备蛋白质的成本可主要是从反应混合物中纯化蛋白质的成本。
技术实现要素：3.本文认识到，需要改进的生物分子合成方法，其可在较低强度的操作条件下实现更高纯度的产品。本公开内容提供了用于生成生物分子(例如多肽或蛋白质)的方法和系统。本公开内容的方法和系统可以实现高纯度(例如，纯度为至少60％、70％、80％、90％、95％或更高)的生物分子的形成。
4.在一个方面，本公开内容提供了一种无细胞生物分子反应系统，其具有包含易位子和/或信号肽酶蛋白质的膜。易位子蛋白质可以提供选择性通道，其允许在无细胞反应溶液中合成的生物分子通过膜移动，同时不允许杂质分子移动。信号肽酶分子可以从生物分子上切割信号区，以从膜上释放分子，并允许收集分子。与单独的无细胞合成相比，这种基于膜的系统可以显著更高的纯度生成生物分子，并且由于存在两个反应区，可以提供新的反应工程化条件。
5.在另一方面，本公开内容提供了一种用于生成生物分子的方法，包括：(a)提供腔室，所述腔室包含第一部分、第二部分以及将所述第一部分与所述第二部分分离的膜，所述第一部分包含所述生物分子的多个无细胞前体，其中所述膜包含孔；(b)使用来自所述第一部分的所述多个无细胞前体的至少一个子集来形成所述生物分子；以及(c)在(b)期间或之后，将所述生物分子的至少一部分通过所述孔易位到所述第二部分中。
6.在一些实施方案中，所述膜包含脂质双层。在一些实施方案中，所述脂质双层为支撑脂质双层。在一些实施方案中，所述脂质双层包含一种或多种易位子蛋白质。在一些实施方案中，所述方法还包括(d)从所述腔室的所述第二部分去除所述生物分子。在一些实施方案中，所述去除包括至多约两次纯化操作。在一些实施方案中，所述去除不包括纯化操作。在一些实施方案中，所述生物分子还包含n端易位信号序列。在一些实施方案中，在(c)之后，从所述生物分子中去除所述n端易位信号序列。在一些实施方案中，所述易位基本上与所述生物分子的所述形成同时发生。在一些实施方案中，所述易位在所述生物分子的所述形成之后发生。在一些实施方案中，所述易位以共翻译方式发生。在一些实施方案中，所述生物分子为多肽。在一些实施方案中，所述多肽为蛋白质，其中所述蛋白质的至少一部分在所述第一部分中形成并在所述第二部分中折叠。在一些实施方案中，所述孔的横截面大于所述生物分子的横截面。在一些实施方案中，所述腔室是流道的一部分。在一些实施方案
中，所述无细胞前体不包含所述生物分子。在一些实施方案中，(c)包括在(b)之后将全部所述生物分子通过所述孔易位到所述第二部分中。在一些实施方案中，(c)在(b)期间进行。在一些实施方案中，(c)在(b)之后进行。
7.在另一方面，本公开内容提供了一种用于生成生物分子的系统，包括：腔室，所述腔室包含第一部分，所述第一部分被配置为包含所述生物分子的多个无细胞前体；第二部分；和多孔膜，所述多孔膜将所述第一部分与所述第二部分分离，其中所述多孔膜包含脂质双层，并且其中所述脂质双层包含一种或多种易位子蛋白质。
8.在一些实施方案中，所述脂质双层为支撑脂质双层。在一些实施方案中，所述多孔膜包含亲水性聚砜、介孔二氧化硅或介孔氧化铝。在一些实施方案中，所述亲水性聚砜具有至多约100千道尔顿的截留分子量。在一些实施方案中，所述一种或多种易位子蛋白质包括一种或多种选自secyeg、secy、sece、secg、sec61p的蛋白质和注射小体(injectosome)。在一些实施方案中，所述多个无细胞前体不包含一种或多种细胞。在一些实施方案中，所述多个无细胞前体包含脱氧核糖核酸(dna)。在一些实施方案中，所述dna编码所述生物分子。在一些实施方案中，所述生物分子为蛋白质，并且其中所述第二部分包含所述蛋白质最佳折叠的条件。在一些实施方案中，所述生物分子为核酸分子、蛋白质、抗原、多肽、酶或化学品。在一些实施方案中，所述支撑脂质双层包含一种或多种信号肽酶蛋白质。
9.在另一方面，本公开内容提供了一种用于生成无细胞合成腔室的方法，包括：(a)提供包含第一部分和第二部分的腔室，其中所述第一部分和所述第二部分由多孔膜分离；(b)应用包含多个蛋白脂质体的溶液，其中所述多个蛋白脂质体包含脂质双层和一种或多种易位子蛋白质；以及(c)使所述多个蛋白脂质体与所述多孔膜反应，其中所述反应包括使所述多个蛋白脂质体解离以在所述多孔膜上形成脂质双层，其中所述脂质双层包含所述一种或多种易位子蛋白质。
10.在一些实施方案中，所述脂质双层为支撑脂质双层。在一些实施方案中，所述溶液包含不含所述一种或多种易位子蛋白质的多个脂质体。在一些实施方案中，所述一种或多种易位子蛋白质的浓度由所述蛋白脂质体与所述多个脂质体的比例控制。在一些实施方案中，所述蛋白脂质体在大小上基本上均匀。在一些实施方案中，所述蛋白脂质体通过脂质体与所述易位子蛋白质的无细胞前体的温育而生成。
11.在另一方面，本公开内容提供了一种用于生成多肽的方法，包括(a)使用包含编码所述多肽的脱氧核糖核酸分子的无细胞溶液来生成核糖核酸分子，(b)使用所述核糖核酸分子来生成所述多肽，以及(c)引导所述多肽穿过设置在膜中的孔。
12.在一些实施方案中，在(c)之后，所述多肽以至少60％的纯度存在。在一些实施方案中，(a)-(c)在至多1天的时间段内进行。在一些实施方案中，所述膜不是胶束的一部分。在一些实施方案中，所述膜是平面的。在一些实施方案中，所述多肽包含非天然n端信号序列。在一些实施方案中，所述孔包含一种或多种易位子蛋白质。在一些实施方案中，所述膜包含一种或多种信号肽酶蛋白质。在一些实施方案中，所述多肽为蛋白质。
13.在另一方面，本公开内容提供了一种用于生成生物分子的系统，包括：腔室，所述腔室包含第一部分，所述第一部分被配置为包含所述生物分子的多个无细胞前体；第二部分；和多孔膜，所述多孔膜将所述第一部分与所述第二部分分离，其中所述多孔膜包含脂质双层，并且其中所述脂质双层包含一种或多种信号肽酶蛋白质。
14.在一些实施方案中，所述一种或多种信号肽酶蛋白质包括lepb。在一些实施方案中，所述脂质双层还包含一种或多种易位子蛋白质。在一些实施方案中，所述脂质双层为支撑脂质双层。
15.在另一方面，本公开内容提供了一种用于生成生物分子的系统，包括：腔室，所述腔室包含第一部分、第二部分以及将所述第一部分与所述第二部分分离的膜，所述第一部分被配置为包含所述生物分子的多个无细胞前体，其中所述膜包含孔；控制器，所述控制器包括一个或多个计算机处理器，所述计算机处理器被单独或共同配置为引导用于生成所述生物分子的方法，所述方法包括：(i)使用来自所述第一部分的所述多个无细胞前体的至少一个子集来形成所述生物分子；以及(ii)在(i)期间或之后，将所述生物分子的至少一部分通过所述孔易位到所述第二部分中。
16.在一些实施方案中，所述方法还包括从所述腔室的所述第二部分去除所述生物分子。在一些实施方案中，所述方法还包括去除n端易位信号序列。在一些实施方案中，所述易位基本上与所述生物分子的所述形成同时发生。在一些实施方案中，所述易位在所述生物分子的所述形成之后发生。在一些实施方案中，所述易位以共翻译方式发生。
17.本公开内容的另一方面提供了一种包含机器可进行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可进行代码在由一种或多种计算机处理器执行时实现上述或本文其他地方的任何方法。
18.本公开内容的另一方面提供了一种系统，该系统包括一种或多种计算机处理器和与其耦合的计算机存储器。计算机存储器包括机器可进行代码，其在由一种或多种计算机处理器执行时实现上述或本文其他地方的任何方法。
19.通过下面的详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中，仅示出和描述本公开内容的说明性实施方案。将会认识到，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和描述本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。援引并入
20.本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指示通过引用并入一样。在通过援引并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相抵触的程度上，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类相抵触的材料。
附图说明
21.本发明的新颖特征在所附权利要求书中特别地阐述。通过参考以下详细描述以及附图(在本文也称为“图(figure)”和“图(fig.)”)将获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，所述详细描述阐述了其中利用本发明的原理的说明性实施方案，在这些附图中：
22.图1是用于生成生物分子的示例过程的示意图。
23.图2是用于生成无细胞合成腔室的过程的流程图的示例。
24.图3是用于生成多肽的过程的示例流程图。
25.图4a
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图4d是用于生成流动池腔室的方法的示例
26.图5是包含蛋白质的支撑脂质双层的示例。
27.图6a
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图6b是用于生成包含膜的腔室并使用该腔室生成生物分子的过程的示例。
28.图7a
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图7c是用于生成生物分子的过程的示例。
29.图8示出了被编程或以其他方式配置为实现本文提供的方法的计算机系统。
具体实施方式
30.尽管已经在本文中示出和描述了本发明的各个实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。
31.每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3相当于大于或等于1、大于或等于2或大于或等于3。
32.每当术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”在一系列两个或多个数值中的第一个数值之前时，术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”适用于该系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1相当于小于或等于3、小于或等于2或小于或等于1。
33.如本文所用，术语“孔”通常是指能够允许物质从一个位置移动到另一个位置的通道或导管。孔可具有至少一个开口。在一些示例中，孔具有至少两个开口。孔可以具有微米或纳米级的横截面(例如，直径)。孔可具有至多为1微米(um)、500纳米(nm)、400nm、300nm、200nm、100nm或更小的横截面。横截面的大小可调整为大于待形成的生物分子(例如，多肽或蛋白质)的最长横截面。孔可以是纳米孔(例如，横截面为至多1um的孔)。孔可以是生物分子(诸如蛋白质(例如，α溶血素、易位子蛋白等))的一部分(例如，包含嵌入脂质双层中的孔的生物材料)，或固态材料(诸如例如，介电材料)的一部分(例如，孔可在介电材料内形成)，或其组合(例如，包含孔的生物分子可定位在固态材料中的孔上方)。
34.如本文所用，术语“多肽”通常是指包含至少两个氨基酸的生物分子。多肽可以是蛋白质。
35.如本文所用，术语“无细胞”通常是指细胞外部的材料。诸如例如，在细胞溶解或透化时，可从细胞释放无细胞材料。无细胞材料可在细胞外部的环境中生成(例如，在反应器中生成，由细胞的外部蛋白质生成等)。无细胞材料可在其中存在细胞的一种或多种组分(例如，细胞内组分，诸如例如酶、核糖体等)的无细胞环境中提供或生成。
36.在一个方面，本公开内容提供了一种用于生成生物分子的方法。例如，生物分子可以是多肽或核酸分子。生物分子可以是多肽(例如，蛋白质)。生物分子可以是核酸分子，诸如脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)分子。
37.一种用于生成生物分子的方法可包括提供腔室，该腔室包含第一部分、第二部分以及将第一部分与第二部分分离的膜，第一部分包含生物分子的多个无细胞前体。该膜可包括孔。可以使用来自第一部分的多个无细胞前体的至少一个子集来形成生物分子。可以将生物分子通过孔易位到第二部分中。
38.图1是用于生成生物分子的示例过程100的示意图。在操作110中，过程100可包括提供腔室，该腔室包含第一部分、第二部分和将第一部分与第二部分分离的膜，所述第一部分包含多个生物分子的无细胞前体。
39.腔室可由塑料(例如，聚乙烯、聚苯乙烯、树脂、聚四氟乙烯等)、金属(例如，铝、铁、铜)、基于纤维的材料(例如，碳纤维等)等或其任何组合形成。腔室可包含多个部分。腔室可包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多部分。腔室可包含至多约10、9、8、7、6、5、4、3个或更少部分。腔室可被配置有环境控制装置(例如，温度控制器、压力控制器等)、监控装置(例如，热电偶、ph计、光学光谱仪等)、电极等，或其任何组合。腔室可以是流道的一部分。例如，腔室可以是如图4a
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4d所示的流道的一部分。在一些情况下，腔室可能不包含多孔膜。例如，代替于将腔室配置为包含支撑脂质双层，可反而将腔室配置为具有非支撑脂质双层。腔室可包含液滴微流控系统。例如，腔室可为被配置为分离包含无细胞前体溶液的单个液滴的流腔室。腔室可包含多个孔。多个孔可被配置为包含多个脂质双层。多个孔可被配置为使得在提高多个孔中的液位时，多个脂质双层可以接触以形成单个脂质双层，以供如本文其他地方所述使用。
40.多个腔室可以串联或并联耦合在一起。例如，多个腔室可以并联连接以提高生成生物分子的生产量。在另一示例中，多个腔室可以串联连接，其中第一腔室的产物可以用作第二腔室中的试剂。在该示例中，生物分子可经翻译后修饰或掺入生物功能化支持物中。串联耦合在一起的多个腔室可被配置为使得后面的腔室包含一种或多种被配置为分析生物分子的分析仪器。以这种方式，多个腔室可被配置为芯片实验室。多个腔室的后续腔室可被配置为使生物分子生物功能化、将生物活性元件缀合到生物分子等，或其任何组合。可通过在腔室的第一部分中的分析生物分子的共表达以及生物分子与分析生物分子的后续反应来分析生物分子。例如，多个dna模板可以在第一部分中同时表达，产生多个不同的蛋白质，这些蛋白质可以易位到第二部分并反应以形成可检测的复合物。
41.流道腔室可包括中空纤维反应腔室。例如，腔室可以是中空纤维，中空纤维被配置为在纤维的壁内具有易位子蛋白质，易位子蛋白质被配置为从纤维中去除生物分子。流道可在闭端腔室中终止。闭端腔室可被配置为聚集生物分子以进行去除。闭端腔室可被配置具有一种或多种如本文其他地方所述的分析仪器。闭端腔室可包括可去除腔室。可去除腔室可以是旋转板、旋转柱、过滤室等，或其任何组合。
42.膜可包含支撑脂质双层。支撑脂质双层可以支撑在膜上。例如，可在膜上形成支撑脂质双层。在该示例中，支撑脂质双层可以穿过膜中的孔。支撑脂质双层可包含一种或多种分子，该分子包括亲水性头和疏水性尾。可形成支撑脂质双层的分子的示例包括但不限于磷脂(例如，磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱)、取代磷脂(例如，具有一种或多种取代基的磷脂)、脂肪酸(例如，羧酸)、异戊烯醇、甾醇、糖脂、聚酮化合物、甘油脂、鞘脂、其他脂质等，或其任何组合。膜可包含孔。孔可以是支撑脂质双层内的蛋白质。例如，跨膜蛋白质可以定位在膜中的孔的上方，以形成孔，该孔被配置为允许生物分子从第一部分易位到第二部分。孔的横截面可大于生物分子的横截面。孔的横截面可大于生物分子变性构象的横截面。例如，孔可以足够大，以允许变性蛋白质穿过孔。孔的横截面可大于同源低聚复合物或异源低聚复合物的横截面。同源或异源低聚复合物可以是由生物分子低聚形成的复合物。例如，多肽可以与其他多肽低聚，并且孔的横截面可大于低聚物。
43.支撑脂质双层可包含一种或多种蛋白质。一种或多种蛋白质可被配置为使生物分子易位穿过膜。例如，生物分子可以通过由蛋白质形成的膜中的孔。一种或多种蛋白质可包
括一种或多种易位子蛋白质。例如，一种或多种易位子蛋白质可包括secyeg。在另一个示例中，一种或多种易位子蛋白质可包括sec61p。一种或多种蛋白质可包括一种或多种注射小体。一种或多种蛋白质可包括一种或多种溶血素(例如，α溶血素)。一种或多种蛋白质可包括一种或多种成孔毒素。一种或多种蛋白质可包括一种或多种信号肽酶、信号肽水解酶、三磷酸腺苷合成酶、被配置为进行翻译后修饰的酶、其他伴侣蛋白、areolysin(例如，以进行蛋白质测序)等，或其任何组合。支撑脂质双层可包含两个或多个支撑脂质双层。两个或多个支撑脂质双层可能彼此具有不同的蛋白质。
44.生物分子可以是抗体、抗体结合蛋白质、蛋白质、大分子、酶、核酸分子、碳水化合物、多肽、化学品等，或其任何组合。生物分子可为多肽。多肽可为蛋白质的至少一部分。生物分子可为生物活性分子。生物活性分子可为药物分子。例如，可以在第一部分中生成小分子治疗药物，并通过易位到第二部分来纯化。在另一个示例中，可在第一部分中生成药理学活性抗体，并随后将其易位到第二部分中经历折叠以具有药理学活性。化学品可以是小分子、药理学活性蛋白质、毒素等，或其任何组合。
45.该生物分子可包含末端易位信号序列。末端易位信号序列可为n端易位信号序列。末端易位信号序列可被配置为使生物分子能够通过孔易位。例如，末端易位信号序列可为天然易位蛋白质的信号序列。在该示例中，末端易位信号序列可以允许生物分子通过易位蛋白质移动。
46.在另一操作120中，过程100可包括使用来自第一部分的多个无细胞前体的至少一个子集来形成生物分子。无细胞前体可能不包含生物分子。例如，无细胞前体可包含生物分子的组分，但不包括完整的生物分子。无细胞前体可包括均质细胞的至少一部分。例如，无细胞前体可以是细胞的均质裂解物。在另一个示例中，无细胞前体可以是最小的一组纯化重组蛋白质。无细胞前体可包含细胞体(例如，细胞器)。无细胞前体可包含底物(例如，肽、核酸、糖等)。无细胞前体可包含一种或多种能源(例如，三磷酸腺苷等)。无细胞前体可包含一种或多种核酸(例如，脱氧核糖核酸、核糖核酸等)。一种或多种核酸可编码生物分子。
47.无细胞前体可包含多个不同的核酸模板。多个核酸模板可为至少约2、5、10、50、100、500、1,000、5,000、10,000个或更多的核酸模板。多个核酸模板可包含至多约10,000、5,000、1,000、500、100、50、10、5、3个或更少的核酸模板。可将多个不同的核酸模板同时引入腔室的第一部分。多个不同的核酸模板可导致多个不同生物分子的生成。例如，可以形成多种不同的蛋白质并通过膜易位。在该示例中，在易位之后，蛋白质可以与结合靶蛋白质的结合部分相互作用，而其他蛋白质则被冲洗走。在该示例中，结合的蛋白质可以被洗脱，随后测序或以其他方式使用。生物分子的形成可包括使用一种或多种酶(例如，用于形成核酸的核酸聚合酶、用于形成蛋白质的核糖体等)。例如，rna可以被送入核糖体，并使用核糖体翻译为多肽。在另一个示例中，dna分子可以使用聚合酶翻译为rna分子。
48.在另一操作130中，过程100可包括在操作120期间或之后，将生物分子的至少一部分通过孔易位到第二部分中。易位可基本上与生物分子的形成同时发生。例如，可形成生物分子并且几乎在其形成时通过孔易位。在该示例中，生物分子可在第二腔室中改变构象(例如，蛋白质生物分子可在第二腔室中折叠)。易位可在生物分子的形成之后发生。例如，生物分子可以在第一部分生成，然后扩散到膜上，然后在seca atp酶的驱动下，它可以穿过膜到达第二部分。在该示例中，可建立生物分子的浓度以增加向第二部分中的扩散。在一些情况
下，伴侣蛋白可能存在于第一部分中，以在通过膜易位之前将生物分子保持在未折叠状态。易位可能以共翻译的方式发生。例如，多个无细胞前体可以开始生物分子的生成，生物分子可以移动到膜中的孔中，并且生物分子可以在形成后直接易位到第二部分中。易位可以是主动易位(例如，能量被用于通过孔易位生物分子)。例如，易位可包括使用三磷酸腺苷为易位提供能量。在另一示例中，可施加电场以促进生物分子通过孔的扩散。易位可以是被动易位(例如，生物分子可以在没有输入能量的情况下易位)。
49.生物分子在通过孔易位后可经历一种或多种构象变化。生物分子在通过孔易位后可经历一种或多种折叠转变。例如，蛋白质生物分子可在第一部分中形成并在第二部分中折叠。腔室的第一和第二部分内的条件可能不同。例如，第一部分中的条件可针对生物分子的合成进行优化，而第二部分中的条件可针对折叠或其他构象变化进行优化。条件的示例包括但不限于离子强度、伴侣蛋白分子的存在或不存在、酶(例如，被配置为赋予翻译后修饰的酶)的存在或不存在等，或其任何组合。
50.支撑脂质双层可包含一种或多种信号肽酶蛋白质。信号肽酶蛋白质可被配置为在通过孔易位之后切割生物分子的一部分。例如，生物分子可以生成为具有被信号肽酶切割的n端信号序列。信号肽酶亚基的示例包括但不限于spc3p、spc2p、spc1p、sec11、spc12、spc18、spc21、spc22/23和spc25。信号肽酶的示例包括但不限于lepa和lepb。在支撑脂质双层中包含信号肽酶蛋白质可允许如下的生物分子生成方案，其中生物分子生成为具有易位信号序列，以促进跨支撑脂质双层的易位，随后易位信号序列被去除以生成纯且完整的生物分子。支撑脂质双层可包含一种或多种信号肽水解酶蛋白质。信号肽水解酶蛋白质可被配置为消化在被信号肽酶切割后可能留在膜中的信号肽。包含信号肽水解酶可以减少信号肽在膜中的积聚，提高膜的寿命。
51.在操作130之后，过程100可包括从生物分子中去除n端易位信号序列。例如，信号肽酶可用于从生物分子中切割n端易位信号序列，从而生成生物分子。或者，生物分子可以生成为不具有n端易位信号序列。生物分子可生成为具有其他附加序列(例如，其他信号转导序列、二级结构域等)。其他附加序列可在生物分子形成后从生物分子中去除。
52.在一些情况下，可以进行操作140。在操作140中，过程100可包括从腔室的第二部分去除生物分子。去除生物分子可包括破坏支撑脂质双层。例如，可使用加压气体迫使包含生物分子的溶液流出第二部分。去除生物分子可包括溶剂的流动。例如，流动池装置可用于从第二部分收集生物分子。去除可包括一次或多次纯化操作。纯化操作的示例包括但不限于色谱操作(例如，亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法)、萃取操作(例如，溶剂萃取、成盐反应等)、离心操作(例如，过滤离心、超速离心等)、过滤操作(例如，纸过滤、切向流过滤、超滤、渗滤等)、冻干操作、磁分离(例如，去除金属纳米颗粒标记的试剂/伴侣蛋白等)等，或其任何组合。例如，去除可包括将包含生物分子的溶液通过过滤器和凝胶色谱柱。去除可包括至少约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多纯化操作。去除可包括至多约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1次或更少的纯化操作。去除可能不包括纯化操作。在去除之后，从生物分子中分离出来的试剂可重新用于形成其他生物分子。
53.在另一方面，本公开内容提供了一种用于生成生物分子的系统。该系统可包括腔室。腔室可包含第一部分，所述第一部分被配置为包含生物分子的多个无细胞前体。该腔室可包括第二部分。该腔室可包括将第一部分与第二部分分离的多孔膜。多孔膜可包含脂质
双层。脂质双层可包含一种或多种易位子蛋白质。脂质双层和易位子蛋白质可如本文其他地方所述。生物分子可以是如本文其他地方所述的生物分子。脂质双层可以为支撑脂质双层。
54.多孔膜可包含聚合物膜。聚合物膜可包括聚砜、聚醚砜、聚四氟乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯腈丁二烯苯乙烯、聚酰胺、聚乳酸、聚苯并咪唑、聚碳酸酯、聚醚砜、聚甲醛、聚醚醚酮、聚醚酰亚胺、聚乙烯、聚苯醚、聚苯硫醚、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯等，或其任何组合。聚合物膜可以是亲水的。例如，多孔膜可包含亲水性聚砜。聚合物膜可以是疏水的。聚合物膜可以是功能化的。例如，聚合物膜可以用臭氧处理以在聚合物上生成表面羟基。聚合物膜可具有至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、175、200或更多千道尔顿的截留分子量。聚合物膜可具有至多约200、175、150、140、130、120、110、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、1或更少千道尔顿的截留分子量。聚合物膜可具有由前述值中的任意两个限定的范围内的截留分子量。例如，聚合物膜可具有约80至110千道尔顿的截留分子量。多孔膜可包含介孔材料(mesoporous material)。介孔材料的示例包括但不限于介孔金属氧化物(例如，介孔氧化铝、介孔氧化钛等)、介孔二氧化硅、介孔盐(例如，介孔碳酸镁等)和介孔碳。多孔膜可以是经处理的膜。处理的示例包括但不限于，将一种或多种其他材料应用于膜(例如，金属镀层、聚合物涂层等)、使膜功能化(例如，将一种或多种化学物质(例如，羧基化聚合物、表面活性剂、钝化剂等)应用于膜)等，或其任何组合。多孔膜可以包含包含孔(例如，多孔)的其他材料，诸如例如多孔玻璃基板、多孔介电材料基板、多孔金属基板、基于纤维的多孔基板(例如，纸基板)等，或其任何组合。
55.支撑脂质双层可包含一种或多种蛋白质。一种或多种蛋白质可被配置为使生物分子易位穿过膜。例如，生物分子可以通过由蛋白质形成的膜中的孔。一种或多种蛋白质可包括一种或多种易位子蛋白质。例如，一种或多种易位子蛋白质可包括secyeg。一种或多种蛋白质可包括一种或多种注射小体。一种或多种蛋白质可包括一种或多种溶血素(例如，α溶血素)。一种或多种蛋白质可包括一种或多种成孔毒素。一种或多种蛋白质可以是如本文其他地方所述的一种或多种蛋白质。
56.多个无细胞前体可不包含一种或多种细胞。多个无细胞前体可通过一种或多种细胞的裂解和均质而生成。例如，可以裂解多个大肠杆菌(e.coli)细胞，并且细胞的内容物可以用作无细胞前体。一种或多种无细胞前体可包含脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、一种或多种氨基酸、一种或多种辅因子(例如，镁、铁、维生素、矿物质等)、核糖体、合成酶、核酸酶等，或其任何组合。dna和/或rna可编码生物分子。例如，dna可编码多肽的氨基酸。或者，第一部分可包含一种或多种细胞。细胞可被配置为生成生物分子，且膜可用于将生物分子与细胞分离。例如，在第一部分中，细胞可以将生物分子分泌到溶液中。在该示例中，该溶液可包含被配置为将生物分子保持在未折叠状态的伴侣蛋白(例如，secb)和将生物分子翻译穿过脂质双层的活性转运体(例如，seca atp酶、分子马达)或被配置为将生物分子穿梭到脂质双层，与脂质双层融合，从而将生物分子转运到第二部分的囊泡(例如，融合囊泡)。在该示例中，注射小体可用于通过脂质双层转运生物分子。
57.第二部分可以包含与第一部分不同的环境。不同的环境可以是不同的温度、溶剂体系(例如，极性、溶剂混合物等)、离子强度、其他分子(例如，辅因子、结合底物等)的存在
或不存在、伴侣蛋白分子的存在或不存在、翻译后修饰酶的存在或不存在等，或其任何组合。例如，可将第二部分保持在低于第一部分的离子强度下。在该示例中，静电屏蔽在第二部分中可能较低，从而允许生物分子的不同部分之间增加的相互作用。
58.在另一方面，本公开内容提供了一种用于生成无细胞合成腔室的方法。该方法可包括提供包含第一部分和第二部分的腔室。第一部分和第二部分可由多孔膜分离。可将包含多个蛋白脂质体的溶液施加到多孔膜上。多个蛋白脂质体可包含脂质双层和一种或多种易位子蛋白质。多个蛋白脂质体可与多孔膜反应。反应可包括多个蛋白脂质体的解离以在多孔膜上形成支撑脂质双层。支撑脂质双层可包含一种或多种易位子蛋白质。
59.图2是用于生成无细胞合成腔室的过程200的流程图的示例。在操作210中，过程200可包括提供包含第一部分和第二部分的腔室。第一部分可通过多孔膜与第二部分分离。腔室可以是如本文其他地方所述的腔室。例如，腔室可以是流腔室。
60.在另一操作220中，过程200可包括应用包含多个蛋白脂质体的溶液。多个蛋白脂质体可包含脂质双层和一种或多种易位子蛋白质。在一些情况下，多个蛋白脂质体可能不包含一种或多种易位子蛋白质。例如，蛋白脂质体可以是脂质体。在该示例中，脂质体可用于生成支撑脂质双层，并且在形成支撑脂质双层之后，可向支撑脂质双层添加一种或多种易位子蛋白质。也可使用形成支撑脂质双层的其他方法，诸如例如，脂质堆积，然后等离子体蚀刻。
61.该溶液可包含多个不含一种或多种易位子蛋白质的脂质体。不含一种或多种易位子蛋白质的脂质体可与多个蛋白脂质体具有相同的组成。例如，脂质体和蛋白脂质体均可包含popc。可通过调节脂质体与蛋白脂质体的比例将易位子蛋白质的浓度调节至预定值。例如，通过生成含有比蛋白脂质体更多的脂质体的溶液，并将该溶液应用到多孔膜上，可以形成含有稀释的易位子蛋白质的脂质双层。
62.蛋白脂质体和/或脂质体可以在大小上基本上均匀。蛋白脂质体和/或脂质体可具有至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多的大小分布。蛋白脂质体和/或脂质体可具有至多约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的大小分布。蛋白脂质体和/或脂质体可由通过孔挤出生成。蛋白脂质体和/或脂质体可通过在水性溶液中使脂质复水来生成。蛋白脂质体和/或脂质体可通过超声生成。蛋白脂质体和/或脂质体可通过其他过程形成，诸如例如，patil等人的“novel methods for liposome preparation”，chemistry and physics of lipids volume 177,2014年1月,第8-18页doi号10.1016/j.chemphyslip.2013.10.011中所述的那些，其全部内容通过引用并入。蛋白脂质体和/或脂质体的大小可为至少约为10、50、100、250、500、1,000或更多纳米。蛋白脂质体和/或脂质体的大小可为至多约为1,000、500、250、100、50、10或更少纳米。
63.蛋白脂质体可通过脂质体与易位子蛋白质的无细胞前体温育来生成。例如，可以使用编码易位子蛋白质的rna和/或dna以及无细胞核糖体在无细胞反应中生成易位子蛋白质，并且可以将脂质体引入无细胞反应混合物中并温育，直到易位子蛋白质掺入脂质体中。蛋白脂质体可通过使用包含脂质体的溶液对干燥的易位子蛋白质复水来生成。例如，包含易位子蛋白质的溶液可以冻干，然后在包含蛋白脂质体的溶液中复水。蛋白脂质体可通过洗涤剂交换法来生成。例如，可将溶解在洗涤剂中的蛋白质添加到包含胶束的溶液中，并且蛋白质可以从洗涤剂中交换以掺入胶束中。在另一示例中，可将溶解于洗涤剂中的蛋白质
添加到包含单层囊泡的溶液中，并且蛋白质可从洗涤剂中交换以掺入单层囊泡中。蛋白脂质体可通过将易位子蛋白质溶液与脂质体溶液混合来生成。例如，易位子可以在溶液中整合到脂质体中。
64.在另一操作230中，过程200可包括使多个蛋白脂质体与多孔膜反应。反应可包括多个蛋白脂质体的解离以在多孔膜上形成支撑脂质双层。支撑脂质双层可包含一种或多种易位子蛋白质。在一些情况下，可在与腔室分离的多孔膜上生成支撑脂质双层。例如，可在被配置用于形成支撑脂质双层的反应容器中的多孔膜上生成支撑脂质双层。在该示例中，包含支撑脂质双层的多孔膜可从反应容器中去除，并放置在如本文其他地方所述的腔室中。在一些情况下，支撑脂质双层可以形成为不具有任何易位子蛋白质。在形成支撑脂质双层之后，可向支撑脂质双层中添加易位子蛋白质。例如，可在多孔膜上形成支撑脂质双层，并可将包含易位子蛋白质的溶液引至支撑脂质双层，且易位子蛋白质可整合到支撑脂质双层中。支撑脂质双层可由倒置膜囊泡生成。倒置膜囊泡可衍生自一种或多种细胞。例如，大肠杆菌(e.coli)可被配置为以天然方式或通过基因工程生成易位子蛋白质，并且大肠杆菌(e.coli)的细胞可转化为倒置膜囊泡，倒置膜囊泡随后可反应以形成包含易位子蛋白质的支撑脂质双层。从倒置膜囊泡生成支撑脂质双层的过程可能类似于从蛋白脂质体生成支撑脂质双层。例如，倒置膜囊泡可与多孔基板反应以在多孔基板上形成支撑脂质双层。膜可为脂质双层。脂质双层可由一个或多个基板支撑。在一些示例中，脂质双层由多个基板支撑(例如，夹在两个基板之间)。该膜可为固态膜，诸如例如介电材料。固态膜可由例如氧化硅或氮化硅形成。
65.在另一方面，本公开内容提供了一种用于生成多肽的方法。该方法可包括使用包含编码该多肽的脱氧核糖核酸分子的无细胞溶液来生成核糖核酸分子。核糖核酸分子可用于生成多肽。多肽可被引导穿过设置在膜中的孔。
66.图3是用于生成多肽的过程300的示例流程图。在操作310中，过程300可包括使用包含编码该多肽的脱氧核糖核酸分子的无细胞溶液来生成核糖核酸分子。或者，可将已经生成的核糖核酸分子引入到无细胞溶液中。例如，编码蛋白质的核糖核酸可被引入到不包含dna的无细胞溶液中。
67.在另一操作320中，过程300可包括使用核糖核酸分子生成多肽。生成可包括使用一种或多种细胞体(例如，核糖体、肽酶等)。
68.在另一操作330中，过程300可包括引导多肽穿过设置在膜中的孔。该孔可包含蛋白质。蛋白质可包括易位子蛋白质。膜可为支撑脂质双层。膜可为如本文其他地方所述的另一膜。孔和膜可如本文其他地方所述。多肽可包含非天然n端信号序列。例如，rna可编码已被配置为包含末端信号序列的非野生型多肽。末端信号序列可被配置为由信号肽酶蛋白质去除。
69.膜可包含支撑脂质双层。膜可能不是胶束的一部分。例如，膜在溶液中可能不是游离的膜。膜可以是平面的。例如，膜可以是支持物上的平面支撑脂质双层。膜可以基本上是平面的。例如，膜可以应用于粗糙的支持物上。孔可包含一种或多种易位子蛋白质。一种或多种易位子蛋白质可如本文其他地方所述。膜可包含如本文其他地方所述的一种或多种信号肽酶蛋白质和/或一种或多种其他蛋白质。膜可以卷成中空纤维构型(例如，卷成管)。
70.在操作330之后，多肽可以至少约20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的纯度存在。在操作330之后，多肽可以至多约99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、40％、30％、20％或更少的纯度存在。多肽可以上述纯度之一存在，而无需额外的纯化操作。例如，在移动穿过孔之后，多肽的纯度可为至少约60％。在操作330之后，可使用该多肽而无需进一步纯化。纯度可以是生物分子的分子量纯度(例如，完整的生物分子的大小分布)、生物分子的摩尔浓度、生物分子与溶液中其他分子的比率、生物分子与溶液中其他生物分子的比率等，或其任何组合。纯度可以是如本文其他地方所述的腔室的第二部分中的纯度。纯度可以是如本文其他地方所述的膜中的生物分子的纯度。
71.操作310
–
330可在至少约30秒、1分钟(m)、5m、10m、15m、30m、1小时(h)、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、12h、18h、24h、48h、72h、96h或更长的时间段内进行。操作310
–
330可在至多约96h、72h、48h、24h、18h、12h、10h、9h、8h、7h、6h、5h、4h、3h、2h、1h、30m、15m、10m、5m、1m、30s或更短的时间段内进行。
72.在另一方面，本公开内容提供了一种用于生成生物分子的系统。该系统可包括腔室。腔室可包含第一部分，所述第一部分被配置为包含生物分子的多个无细胞前体。该腔室可包含第二部分。该腔室可包含将第一部分与第二部分分离的多孔膜。多孔膜可包含支撑脂质双层。支撑脂质双层可包含一种或多种信号肽酶蛋白质。
73.一种或多种信号肽酶蛋白质可包括如本文其他地方所述的一种或多种信号肽酶蛋白质。例如，一种或多种信号肽酶蛋白质可包括lepb。如本文其他地方所述，支撑脂质双层可包含一种或多种易位子蛋白质。例如，支撑脂质双层可被配置为允许生物分子通过一种或多种易位子蛋白质易位通过多孔膜。
74.图4a
–
图4d是用于生成流动池腔室的方法的示例。流腔室601可包含两个或多个流端口602。腔室601可包含至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的流端口。腔室601可包含至多约10、9、8、7、6、5、4、3个或更少的流端口。例如，腔室可以包含膜一侧的两个流端口和膜另一侧的两个流端口。流端口可与下列项处于流体连通：一个或多个储器(例如，试剂储器、洗涤储器等)、废物处理(例如，废物处置)、表征仪器(例如，色谱、质谱、核磁共振、光学等)、芯片实验室功能(例如，本文其他地方描述的功能)、被配置为生成其他生物分子的其他腔室(例如，第一腔室的输出是第二腔室的无细胞反应混合物的一部分)等，或其任何组合。流端口可位于腔室的同一侧。例如，所有流端口可位于腔室的一侧，以允许从更大的系统中容易插入和去除。
75.腔室可包括由膜603分离的第一部分604和第二部分605。膜可为如本文其他地方所述的膜。例如，膜可包括介孔膜。在膜上生成支撑脂质双层的过程中，多个含有易位子的蛋白脂质体可经由流端口602流入腔室的第一和/或第二部分。在图4b的示例中，溶液606可流入第一部分中。溶液可如本文其他地方所述。例如，溶液可包含多个蛋白脂质体和脂质体。如本文其他地方所述，溶液可与膜反应。例如，溶液可以与膜一起温育，并在膜上反应以形成支撑脂质双层。如本文其他地方所述的，支撑脂质双层可包含一种或多种易位子和/或信号肽酶蛋白质。
76.在反应形成包含易位子和/或信号肽酶蛋白质的支撑脂质双层607后，可通过如图4c所示的一个或多个流端口将无细胞反应混合物608引入腔室中。无细胞反应混合物可流入第一或第二部分中。无细胞反应混合物可如本文其他地方所述。腔室可被配置为在如本
文其他地方所述的足以形成一种或多种生物分子609的条件下容纳无细胞反应混合物。一种或多种生物分子可通过膜易位到腔室的另一部分。一旦进入另一部分中，生物分子在不进行流动时可留在另一部分中。或者，如果在另一部分中存在流动，则生物分子可通过其中一个流端口流出腔室。
77.图4d是一种或多种生物分子形成后的洗涤操作的示例。洗涤610可流入腔室中，以将无细胞反应混合物和/或生物分子从腔室中洗涤出来。洗涤操作可包括流体流向腔室的一部分，但不流向腔室的另一部分。例如，可将加压洗涤应用到第一部分，并且可以通过压力将生物分子驱动到第二部分。在另一示例中，可洗涤第二部分以去除生物分子，同时不洗涤第一部分。在洗涤后，该腔室可重复使用以生成相同或不同的生物分子。例如，可以用dna酶和/或rna酶处理腔室，以去除剩余的反应物。在该示例中，可在重新引入无细胞前体之前引入dna酶和/或rna酶抑制剂。
78.图5是包含蛋白质502的支撑脂质双层501的示例。尽管如图所示，支撑脂质双层501包含三种蛋白质502，但支撑脂质双层501可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000种或更多蛋白质502。支撑脂质双层可以是如本文其他地方所述的支撑脂质双层。例如，支撑脂质双层可包含1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。蛋白质可包括如本文其他地方所述的易位子蛋白质、如本文其他地方所述的信号肽酶蛋白质或其组合。蛋白质在孔上方的定位可允许生物分子通过易位子蛋白质中的孔穿过双层501。
79.支撑脂质双层可支撑在膜503上。膜可为如本文其他地方所述的膜。例如，膜可包含介孔氧化铝、介孔二氧化硅或介孔聚砜。膜可包含一种或多种孔504。孔的大小可为至少约10纳米(nm)、25nm、50nm、75nm、100nm、150nm、200nm、250nm、500nm、750nm、1,000nm或更大。孔的大小可为至多约1,000nm、750nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm、25nm、10nm或更小。
80.膜503可包括附加结构，诸如例如电极、电引线、温度传感器、蛋白质、细胞体、细胞器等，或其任何组合。例如，生成蛋白质的细胞器可以栓系在与孔相邻的膜上，以允许在细胞器生成蛋白质时蛋白质的易位。在另一个示例中，膜可包括电极，该电机被配置为产生电场以引导生物分子流动通过孔。计算机系统
81.本公开内容提供了被编程用于实现本公开内容的方法的计算机系统。图8示出了计算机系统801，其被编程或以其他方式配置用于执行本公开内容的方法和调控本公开内容的系统。计算机系统801可以调控本公开内容的各个方面，举例而言，诸如生成生物分子或生成无细胞合成腔室的方法。例如，计算机系统可被配置用于控制在腔室内形成生物分子的条件。在另一示例中，计算机系统可以调控形成无细胞合成腔室的条件。计算机系统801可以是用户的电子设备或相对于该电子设备位于远程的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
82.计算机系统801包括中央处理器(cpu，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)805，该中央处理器805可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统801还包括存储器或存储器位置810(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元815(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口820(例如，网络
适配器)，以及外围设备825，诸如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器810、存储单元815、接口820和外围设备825通过诸如主板等通信总线(实线)与cpu 805通信。存储单元815可以是用于储存数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统801可以借助于通信接口820可操作地耦合到计算机网络(“网络”)830。网络830可以是因特网、互联网和/或外联网，或者内联网和/或与因特网通信的外联网。在一些情况下，网络830是电信和/或数据网络。网络830可以包括一个或多个计算机服务器，该一个或多个计算机服务器可以实现分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，借助于计算机系统801，网络830可以实现对等网络，这可以使耦合到计算机系统801的设备能够充当客户端或服务器。
83.cpu 805可以执行一系列机器可读指令，该机器可读指令可以体现为程序或软件。指令可以储存在诸如存储器810之类的存储器位置中。指令可以被引导到cpu 805，其可以随后对cpu 805进行编程或以其他方式配置以实现本公开内容的方法。cpu 805执行的操作的示例可以包括获取、解码、执行和回写。
84.cpu 805可以是诸如集成电路等电路的一部分。系统101的一个或多个其他组件可以包括在电路中。在一些情况下，该电路是专用集成电路(asic)。
85.存储单元815可以储存文件，诸如驱动程序、库和保存的程序。存储单元815可以储存用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统801可以包括一个或多个位于计算机系统801外部的附加数据存储单元(例如，位于通过内联网或因特网与计算机系统801通信的远程服务器上)。
86.计算机系统801可以通过网络830与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统801可以与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如，便携式pc)、平板或板状pc(例如，ipad、galaxy tab)、电话、智能电话(例如，iphone、支持android的设备、)或个人数字助理。用户可以经由网络830访问计算机系统801。
87.如本文所述的方法可以通过储存在计算机系统801的电子存储位置(举例而言，诸如存储器810或电子存储单元815)上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器805执行。在一些情况下，可以从存储单元815检索代码并储存在存储器810上以供处理器805随时访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元815，并且机器可执行指令储存在存储器810上。
88.代码可以被预编译和配置用于与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时编译。代码能够以编程语言供应，该编程语言可被选择以使代码能够以预编译或当场编译的方式执行。
89.本文提供的系统和方法的各个方面，例如计算机系统801，可以在编程中体现。技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制品”，通常为承载于或体现在某种类型的机器可读介质中的机器(或处理器)可执行代码和/或关联数据的形式。机器可执行代码可以储存在电子存储单元上，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘上。“存储”类型介质可以包括计算机、处理器等或其关联模块的任何或所有有形存储器，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，它们可以随时提供非暂时性存储以供软件编程。软件的全部或部分可以不时通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，这样的通信
可以实现将软件从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光陆线网络以及通过各种空中链路使用的那些介质。承载此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所使用，除非限于非暂时的、有形的“存储”介质，诸如计算机或机器“可读介质”之类的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
90.因此，诸如计算机可执行代码之类的机器可读介质可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质例如包括光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，诸如可以用于实现附图中所示的数据库等的存储介质。易失性存储介质包括动态存储器，例如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内总线的线路。载波传输介质可以采用电或电磁信号的形式，或者采用声波或光波的形式，诸如在射频(rf)和红外(ir)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式例如包括：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、cd-rom、dvd或dvd-rom、任何其他光学介质、穿孔卡纸带、任何其他带有孔图案的物理存储介质、ram、rom、prom和eprom、flash-eprom、任何其他存储器芯片或盒、传送数据或指令的载波、传送此类载波的线缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多介质可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器以供执行。
91.计算机系统801可以包括电子显示器835或与之通信，该电子显示器835包括用户界面(ui)840，用于例如提供用以输入生物分子的预定性质的控制面板。ui的示例包括但不限于图形用户界面(gui)和基于网络的用户界面。
92.本公开内容的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。算法可以通过在由中央处理器805执行时的软件来实现。例如，算法可以对无细胞反应腔室进行循环以生成生物分子。实施例
93.以下实例说明了本文所述的某些系统和方法，并不旨在进行限制。实施例1
–
包含支撑脂质双层的腔室的制备
94.图6a和图6b是用于生成包含膜602的腔室601并使用该腔室生成生物分子的过程的示例。该腔室可包括入口603。入口可被配置为连接到容器607(例如，注射器、管等)。该容器可被配置为将多个蛋白脂质体引入腔室601的第一部分604。
95.蛋白脂质体可通过使用氮气流蒸发popc脂质中的氯仿溶剂，然后施加真空来形成。干燥popc可在水性缓冲液中复水，并通过100nm孔挤出以生成脂质体。然后，脂质体可以在约37摄氏度下与含有编码secy、sece和secg的dna的无细胞转录/翻译溶液温育3小时，以形成secyeg浸渍的蛋白脂质体。
96.在该示例中，25毫米亲水性聚砜圆盘可用作膜602。膜可在50％乙醇溶液中浸泡以使聚合物膨胀，随后在水中洗涤以去除乙醇。然后，可将膜602放置到腔室601中，且包含secyeg蛋白脂质体以及附加脂质体的溶液606可经由容器616沉积到第一部分604中。该溶液可在环境温度下温育3小时，以在膜602上形成经secyeg浸渍的支撑脂质双层。溶液606可
以是缓冲溶液(例如，ph缓冲的、离子强度缓冲的等)。
97.在形成支撑脂质双层后，可使用加压水线607进行通量测试。加压水线可在1巴的压力下，可测量并记录穿过膜602的水的流动，以确定膜的脂质双层覆盖程度。质量控制测试的其他示例包括但不限于荧光显微镜检术和原子力显微镜检术。例如，荧光显微镜检术图像可用于确认脂质双层中脂质的存在。在该示例中，光漂白可用于确认脂质是双层而不是固定化的未破裂脂质体。如果确定覆盖程度是可接受的，则可使用腔室和膜形成生物分子。实施例2
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生物分子的制备
98.图7a
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图7c是用于生成生物分子的过程的示例。可将无细胞反应混合物703注入包含膜702的腔室701的第一部分704中，诸如在实施例1中生成的腔室。无细胞反应混合物可通过使大肠杆菌(e.coli)细胞均质而生成。可使用多个12,000rcf离心使裂解物分层以产生无细胞反应混合物。混合物可在135,000rcf下再次离心，以去除倒置膜囊泡，并可在-80℃下储存以备将来使用。
99.当将裂解物703添加到腔室701中时，也可以添加一种或多种编码生物分子的核酸序列。例如，可添加编码β-半乳糖苷酶、trxa或ompa的dna以形成这些蛋白质，尽管可以通过类似的方法形成其他蛋白质。一种或多种核酸序列可包含编码n端易位信号序列的部分。可以向裂解物中添加诸如能量分子(例如，三磷酸腺苷)和底物(例如，肽)的附加组分。腔室可保持在37℃以允许产物生物分子的生成并允许生物分子通过膜702易位。
100.在生物分子的形成和易位之后，可经由移液管或其他流体输送装置705从第一部分704中去除无细胞溶液。此时，生物分子可驻留在腔室701的第二部分706中。可将第一部分704冲洗一次或多次以去除任何额外的无细胞前体，并在第一部分中留下清洁溶液707。冲洗可在低流速下进行，以避免剪切支撑脂质双层。
101.为了回收生物分子，可将加压气体708(例如，空气、氮气等)冲入腔室，并破裂支撑脂质双层。然后可将第一和第二部分的内容物收集到容器709中并去除。或者，可以使用流体输送管代替容器以将生物分子从腔室中去除。
102.尽管本文针对单个入口和出口腔室进行了描述，但实施例中的方法可用于流动池设置。流动池设置的示例可在图4a-图4d中找到。在流动池设置中，无细胞溶液和产品生物分子两者都可以不断流过流动池。流动池设置的一个优点是可以实现生物分子的连续生产。此外，流动池设置可以提高处理速度，以及降低机械成本。实施例3-蛋白质合成的自动化测试
103.与本文其他地方所述的系统可操作地耦合的计算机系统可用于为生物分子合成提供自动化设计和测试平台。尽管本文就蛋白质合成进行了描述，但也可以形成本文其他地方所述的其他生物分子。
104.由于本文其他地方所述的方法和系统的处理时间相对较短(例如，约3小时、约5分钟、约30秒等)，因此可以生成连续流系统，例如，具有各自配置为每小时产生约0.01mg蛋白质的100个腔室，总系统速率为每小时1mg。计算机可以基于耦合到腔室的分析仪器来确定系统的每个腔室是否可以(i)继续表达该腔室的蛋白质产物以生成额外的蛋白质用于分析，或者(ii)开始制造不同的蛋白质(例如，完全不同的蛋白质或由至少一个其他腔室生成的蛋白质)。停止(ii)的决定可能基于已经收集了足够的蛋白质信息，以了解继续生产该蛋
白质的价值。增加生成特定蛋白质的腔室的数量的决定可以通过确定蛋白质是否有前景来做出，这是通过对当前形成蛋白质的腔室进行分析来确定的。通过引导额外的腔室形成蛋白质，可以更高的量和/或更快的速度供应蛋白质。
105.在另一个示例中，腔室可被配置为持续生成蛋白质，并且合成的结果可以由可操作地耦合到该腔室的计算机监控。腔室的反应条件可以改变，且计算机可以跟踪此类变化的影响。以这种方式，可以实时优化腔室正在进行的合成，以提高合成过程的效率。
106.尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。并非意图通过说明书中提供的特定示例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文中的实施方案的描述和图示并不意味着以限制性的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的具体描述、构造或相对比例，其取决于各种条件和变量。应该理解的是，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，可以预期的是，本发明还应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同形式。意图是，所附权利要求限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
技术特征：1.一种用于生成生物分子的方法，包括：(a)提供腔室，所述腔室包含第一部分、第二部分以及将所述第一部分与所述第二部分分离的膜，所述第一部分包含所述生物分子的多个无细胞前体，其中所述膜包含孔；(b)使用来自所述第一部分的所述多个无细胞前体的至少一个子集来形成所述生物分子；以及(c)在(b)期间或之后，将所述生物分子的至少一部分通过所述孔易位到所述第二部分中。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述膜包含脂质双层。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述脂质双层为支撑脂质双层。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述脂质双层包含一种或多种易位子蛋白质。5.根据权利要求1所述的方法，还包括(d)从所述腔室的所述第二部分去除所述生物分子。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述去除包括至多约两次纯化操作。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述去除不包括纯化操作。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物分子还包含n端易位信号序列。9.根据权利要求8所述的方法，其中在(c)之后，从所述生物分子中去除所述n端易位信号序列。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述易位基本上与所述生物分子的所述形成同时发生。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述易位在所述生物分子的所述形成之后发生。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述易位以共翻译方式发生。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物分子为多肽。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多肽为蛋白质，其中所述蛋白质的至少一部分在所述第一部分中形成并在所述第二部分中折叠。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述孔的横截面大于所述生物分子的横截面。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述腔室是流道的一部分。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述无细胞前体不包含所述生物分子。18.根据权利要求1所述的方法，其中(c)包括在(b)之后将全部所述生物分子通过所述孔易位到所述第二部分中。19.根据权利要求1所述的方法，其中(c)在(b)期间进行。20.根据权利要求1所述的方法，其中(c)在(b)之后进行。21.一种用于生成生物分子的系统，包括：腔室，所述腔室包含：第一部分，所述第一部分被配置为包含所述生物分子的多个无细胞前体；第二部分；和多孔膜，所述多孔膜将所述第一部分与所述第二部分分离，其中所述多孔膜包含脂质双层，并且其中所述脂质双层包含一种或多种易位子蛋白质。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述脂质双层为支撑脂质双层。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述多孔膜包含亲水性聚砜、介孔二氧化硅或介
孔氧化铝。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述亲水性聚砜具有至多约100千道尔顿的截留分子量。25.根据权利要求21所述的方法，其中所述一种或多种易位子蛋白质包括一种或多种选自secyeg、secy、sece、secg、sec61p的蛋白质和注射小体。26.根据权利要求21所述的方法，其中所述多个无细胞前体不包含一种或多种细胞。27.根据权利要求21所述的方法，其中所述多个无细胞前体包含脱氧核糖核酸(dna)。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述dna编码所述生物分子。29.根据权利要求21所述的方法，其中所述生物分子为蛋白质，并且其中所述第二部分包含所述蛋白质最佳折叠的条件。30.根据权利要求21所述的方法，其中所述生物分子为核酸分子、蛋白质、抗原、多肽、酶或化学品。31.根据权利要求21所述的方法，其中所述支撑脂质双层包含一种或多种信号肽酶蛋白质。32.一种用于生成无细胞合成腔室的方法，包括：(a)提供包含第一部分和第二部分的腔室，其中所述第一部分和所述第二部分由多孔膜分离；(b)应用包含多个蛋白脂质体的溶液，其中所述多个蛋白脂质体包含脂质双层和一种或多种易位子蛋白质；以及(c)使所述多个蛋白脂质体与所述多孔膜反应，其中所述反应包括使所述多个蛋白脂质体解离以在所述多孔膜上形成脂质双层，其中所述脂质双层包含所述一种或多种易位子蛋白质。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述脂质双层为支撑脂质双层。34.根据权利要求32所述的方法，其中所述溶液包含不含所述一种或多种易位子蛋白质的多个脂质体。35.根据权利要求33所述的方法，其中所述一种或多种易位子蛋白质的浓度由所述蛋白脂质体与所述多个脂质体的比例控制。36.根据权利要求32所述的方法，其中所述蛋白脂质体在大小上基本均匀。37.根据权利要求32所述的方法，其中所述蛋白脂质体通过脂质体与所述易位子蛋白质的无细胞前体的温育而生成。38.一种用于生成多肽的方法，包括(a)使用包含编码所述多肽的脱氧核糖核酸分子的无细胞溶液来生成核糖核酸分子，(b)使用所述核糖核酸分子生成所述多肽，以及(c)引导所述多肽穿过设置在膜中的孔。39.根据权利要求38所述的方法，其中在(c)之后，所述多肽以至少60％的纯度存在。40.根据权利要求38所述的方法，其中(a)-(c)在至多1天的时间段内进行。41.根据权利要求38所述的方法，其中所述膜不是胶束的一部分。42.根据权利要求42所述的方法，其中，所述膜是平面的。43.根据权利要求38所述的方法，其中所述多肽包含非天然n端信号序列。
44.根据权利要求38所述的方法，其中所述孔包含一种或多种易位子蛋白质。45.根据权利要求38所述的方法，其中所述膜包含一种或多种信号肽酶蛋白质。46.根据权利要求38所述的方法，其中所述多肽为蛋白质。47.一种用于生成生物分子的系统，包括：腔室，所述腔室包含：第一部分，所述第一部分被配置为包含所述生物分子的多个无细胞前体；第二部分；和多孔膜，所述多孔膜将所述第一部分与所述第二部分分离，其中所述多孔膜包含脂质双层，并且其中所述脂质双层包含一种或多种信号肽酶蛋白质。48.根据权利要求47所述的系统，其中所述一种或多种信号肽酶蛋白质包括lepb。49.根据权利要求47所述的系统，其中所述脂质双层还包含一种或多种易位子蛋白质。50.根据权利要求47所述的系统，其中所述脂质双层为支撑脂质双层。51.一种用于生成生物分子的系统，包括：腔室，所述腔室包含第一部分、第二部分以及将所述第一部分与所述第二部分分离的膜，所述第一部分被配置为包含所述生物分子的多个无细胞前体，其中所述膜包含孔；控制器，所述控制器包括一个或多个计算机处理器，所述计算机处理器被单独或共同配置为引导用于生成所述生物分子的方法，所述方法包括：(i)使用来自所述第一部分的所述多个无细胞前体的至少一个子集来形成所述生物分子；以及(ii)在(i)期间或之后，将所述生物分子的至少一部分通过所述孔易位到所述第二部分中。52.根据权利要求51所述的系统，其中所述方法还包括从所述腔室的所述第二部分去除所述生物分子。53.根据权利要求51所述的系统，其中所述方法还包括去除n端易位信号序列。54.根据权利要求51所述的系统，其中所述易位基本上与所述生物分子的所述形成同时发生。55.根据权利要求51所述的系统，其中所述易位在所述生物分子的所述形成之后发生。56.根据权利要求51所述的系统，其中所述易位以共翻译方式发生。
技术总结本公开内容提供了用于生成生物分子的方法和系统。该方法和系统可以包括使用多孔膜。本公开内容还提供了生成多孔膜的方法和系统。本公开内容还提供了生成多孔膜的方法和系统。本公开内容还提供了生成多孔膜的方法和系统。
技术研发人员：大卫
受保护的技术使用者：机器生物公司
技术研发日：2020.11.13
技术公布日：2022/11/1
