分离外泌体的方法
背景技术：1.外泌体是由多种健康的和病变的细胞类型主动分泌的一类细胞源性小细胞外膜囊泡(直径50-100nm)。外泌体可以在正常和病理状态下通过穿梭蛋白质、mrna和微rna来介导细胞、组织和器官水平的微通讯。
2.现在已经认识到外泌体介导体内不同细胞类型之间的细胞间通讯，从而影响正常和病理状态。外泌体中的几种生物实体诸如蛋白质、mrna和微rna，与大多数人类恶性肿瘤的发病机制密切相关，并且它们可以充当用于疾病诊断、预后和治疗的宝贵生物标志物。许多不同的细胞类型和组织都分泌外泌体，并且外泌体的内容物和特征因细胞类型或来源组织而异。因此，外泌体的功能和它们与给定病理的相关性可能因来源组织而异。为此，分离外泌体的组织特异性亚型变得越来越重要。
3.因此，外泌体纯化和分析是快速发展的研究领域，但是，尽管在外泌体纯化和分析方法方面取得了一些进展，但研究仍然面临一些挑战。
4.为了研究外泌体以鉴定生物标志物、了解生物学功能和疾病并找到用治疗剂靶向它们的方法，首先需要从存在于血液和其他生物流体中的大量其他分子和结构中分离这些微观结构。
5.因此，有必要提供一种分离外泌体的方法。
技术实现要素：6.根据本发明的第一方面，提供了一种分离外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：
7.(a)提供包括外泌体的样品；
8.(b)鉴定外泌体上的细胞表面多肽；以及
9.(c)使用外泌体上的细胞表面多肽分离外泌体；
10.其中细胞表面多肽是抗肌萎缩蛋白聚糖(dag)。
11.任选地，所述方法包括以下步骤：
12.(a)提供包括外泌体的样品；
13.(b)鉴定外泌体上的细胞表面多肽；
14.(c)为细胞表面多肽提供结合配偶体；
15.(d)使结合配偶体与样品接触；
16.(e)分离结合配偶体，以及
17.(f)分离外泌体；
18.其中细胞表面多肽是抗肌萎缩蛋白聚糖(dag)。
19.任选地，样品是生物样品。进一步任选地，样品是来自人的生物样品。
20.任选地，样品是生物流体样品。进一步任选地，样品是来自人的生物流体样品。
21.任选地，生物流体样品选自脑脊液(csf)、腹膜液、胸膜液、羊水、间质液、血管内液、透细胞液和细胞内液。任选地，来自人的生物流体样品选自脑脊液(csf)、腹膜液、胸膜液、羊水、间质液、血管内液、透细胞液和细胞内液。
22.任选地，样品是血液样品。进一步任选地，样品是来自人的血液样品。任选地，样品是全血样品。进一步任选地，样品是来自人的全血样品。任选地，样品是血清样品。进一步任选地，样品是来自人的血清样品。优选地，样品是来自人的血清样品。
23.任选地，样品是生物组织样品。进一步任选地，样品是来自人的生物组织样品。任选地，样品包含生物组织。进一步任选地，样品包含来自人的生物组织。
24.任选地，样品是生物软组织样品。进一步任选地，样品是来自人的生物软组织样品。任选地，样品包含生物软组织。进一步任选地，样品包含来自人的生物软组织。
25.任选地，生物组织选自内胚层组织、中胚层组织和外胚层组织。任选地，样品包含选自内胚层组织、中胚层组织和外胚层组织的生物组织。进一步任选地，样品包含来自人的选自内胚层组织、中胚层组织和外胚层组织的生物组织。
26.任选地，中胚层组织是轴旁中胚层组织。
27.任选地，中胚层组织是肌组织。
28.任选地，肌组织选自骨骼(横纹)肌组织；平滑(非横纹)肌组织；和心脏(半横纹)肌组织。
29.任选地，肌组织包含选自骨骼(横纹)肌细胞；平滑(非横纹)肌细胞；和心脏(半横纹)肌细胞的细胞。
30.任选地，肌组织包含选自骨骼(横纹)成肌细胞；平滑(非横纹)成肌细胞；和心脏(半横纹)成肌细胞的细胞。
31.任选地，肌组织包含选自骨骼(横纹)肌管；平滑(非横纹)肌管；和心脏(半横纹)肌管的细胞。优选地，肌组织包含平滑(无横纹)肌管。
32.任选地，细胞表面多肽是人抗肌萎缩蛋白聚糖(dag)。
33.任选地，细胞表面多肽是由uniprotkb登录号q14118定义的人抗肌萎缩蛋白聚糖(dag)。
34.任选地，细胞表面多肽选自α-抗肌萎缩蛋白聚糖和β-抗肌萎缩蛋白聚糖。
35.任选地，细胞表面多肽选自人α-抗肌萎缩蛋白聚糖和人β-抗肌萎缩蛋白聚糖。优选地，细胞表面多肽是人α-抗肌萎缩蛋白聚糖。
36.任选地，细胞表面多肽的结合配偶体能够结合细胞表面多肽。
37.任选地，细胞表面多肽的结合配偶体是能够结合细胞表面多肽的抗体。
38.任选地，抗体选自能够结合细胞表面多肽的单克隆抗体和能够结合细胞表面多肽的多克隆抗体。优选地，抗体是能够结合细胞表面多肽的单克隆抗体。
39.任选地，抗体是igg同种型。进一步任选地，抗体是igg2同种型。更进一步任选地，抗体是igg2a同种型。更进一步任选地，抗体是migg2a同种型。优选地，抗体是migg2a同种型。
40.任选地，细胞表面多肽的结合配偶体包含能够结合细胞表面多肽的抗体和固体支持物。
41.任选地，固体支持物是珠。
42.任选地，固体支持物是亲水性珠。
43.任选地或另外地，固体支持物是ph中性珠。
44.任选地，固体支持物是环氧树脂珠。进一步任选地，固体支持物是环氧树脂包被的
珠。更进一步任选地，固体支持物是具有环氧基团的珠。
45.任选地，固体支持物是磁珠。进一步任选地，固体支持物是顺磁珠。更进一步任选地，固体支持物是超顺磁珠。优选地，固体支持物是超顺磁珠。
46.任选地，珠具有1.0-4.5μm的直径。优选地，珠具有2.8μm的直径。
附图说明
47.现将参考附图来描述本发明的实施方案，其中：
48.图1是来自健康人类受试者的培养以形成分化的肌管的成肌细胞的培养基的蛋白印迹分析；
49.图2是来自血清的细胞培养外泌体免疫捕获的蛋白印迹分析；
50.图3a是分离肌肉外泌体的示意图；
51.图3b是被能够结合细胞表面多肽(肌膜蛋白)的抗体沉降的循环囊泡的蛋白印迹分析；并且
52.图4是来自健康受试者(h)的循环肌肉外泌体免疫捕获的蛋白印迹分析。
53.材料和方法
54.参与者和伦理批准
55.根据欧洲建议和法国立法，从btr(研究组织库，欧盟网络eurobiobank的合作伙伴)获得来自健康受试者的三角肌活检。
56.血清样品获得自帕金森病患者以及年龄和性别匹配的健康受试者。此协议(nct02305147)被当地伦理委员会批准，并且所有受试者都根据机构指南签署了知情同意书。
57.肌肉干细胞提取和培养
58.简而言之，肌肉活检如先前所述(bigot等，2015)被机械分离，并接种于增殖培养基[1体积m199、4体积达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)、20％胎牛血清(体积:体积)、25ug.ml-1
胎球蛋白、0.5ng.ml-1
bfgf、5ng.ml-1
egf、5ug.ml-1胰岛素]。肌原细胞群的富集使用cd56磁珠、并针对肌原性使用抗结蛋白抗体，如之前所述(bigot等，2015)。细胞群的至少80％对结蛋白呈阳性。然后如先前所述(thorley等，2016)将成肌细胞永生化。然后将永生化成肌细胞分化成肌管，用dmem冲洗3次后除去任何fbs残留物，并在dmem中培养3天。
[0059]
血清样品
[0060]
简而言之，使用红色顶管通过静脉穿刺收集血液样品，并使其在室温下凝结30分钟。在4℃以4,000g离心10分钟后，将血清在干冰上速冻并保持在-80℃直至处理。
实施例
[0061]
现在将参考以下非限制性实施例来描述本发明的实施方案：
[0062]
实施例1
[0063]
肌肉外泌体的分离
[0064]
为了确定多肽抗肌萎缩蛋白聚糖(dag)是否存在于肌肉外泌体内部或表面(膜嵌入的，并且因此是抗体可接触的)，测试了市售的抗dag抗体(靶向不同形式的多肽)是否能够结合从细胞培养基中提取的肌肉外泌体。
[0065]
为了实现这一点，应用了两个相反的测试：(1)外泌体是否被市售的外泌体标志物阳性的抗dag抗体沉降？；以及(2)外泌体是否被多肽抗肌萎缩蛋白聚糖(dag)阳性的外泌体标志物沉降？这样，只有当市售抗dag抗体靶向的多肽抗肌萎缩蛋白聚糖(dag)的形式存在于外泌体表面时，这两项测试才会返回阳性结果。使用这种方法，显示我们能够确定α-抗肌萎缩蛋白聚糖(由dag1基因编码)可被抗体接触，并且因此适于免疫亲和性沉降(参见图1)。
[0066]
总之，分离并培养来自健康人类受试者的肌肉活检的成肌细胞以形成如上所述的分化肌管。培养3天后，根据制造商的说明使用总外泌体分离试剂从800,000个肌细胞的培养基中分离出外泌体。
[0067]
为了从细胞培养基中分离外泌体，将总外泌体分离试剂(来自细胞培养基；life technologies
tm
)以1:2的体积比添加到细胞培养基中，并在4℃下孵育过夜。然后通过在10,000x g下离心60分钟来沉淀外泌体，并丢弃消耗的培养基。将外泌体颗粒重新悬浮在200μl pbs中，并在-80℃下保存直至需要。
[0068]
然后使用抗cd63抗体、via41抗dag抗体或dag-6f4抗dag抗体对从培养基中分离的外泌体进行免疫亲和纯化。对于从细胞培养基中分离的肌肉外泌体的共免疫沉淀(co-ip)，根据制造商的说明使用dynabeads
tm
抗体偶联试剂盒(life technologies
tm
)将α-dag抗体(dag-6f4；dshb)与dynabeads
tm
m-270环氧树脂珠(life technologies
tm
)偶联。
[0069]
简而言之，将5μg抗体与1mg珠偶联，并在室温(rt)下轻轻搅拌孵育16-24小时。然后用提供的洗涤缓冲液洗涤珠，并按照建议保存直至需要。
[0070]
接下来，将1mgα-dag包被的珠等分到各个ip条件下，并用900μl含有100mm nacl的1x ip缓冲液(life technologies
tm
)洗涤。然后用pureproteome
tm
磁性支架捕获珠，并将上面制备的外泌体悬浮液稀释至400μl，添加到α-dag偶联的珠中，并在rt下颠倒旋转孵育3小时。
[0071]
接下来，磁性捕获珠，并保留上清液用于分析外泌体消耗。然后用1ml pbs-bsa(0.1％)将珠洗涤两次，并根据下游应用，直接从珠中裂解外泌体或从珠中洗脱出外泌体。
[0072]
对于cd63和cd81四次跨膜蛋白的蛋白质印迹和检测，在非还原条件下通过将15μl 4x nupage
tm
lds缓冲液添加到珠中来裂解外泌体，并在冰上孵育30min。然后磁性捕获珠，并且将蛋白质转移到新管中，并在70℃下加热10min。然后将45μl蛋白质加载到nupage
tm
4-12％bis-tris midi凝胶(life technologies
tm
)，并在1x nupage
tm
mops sds运行缓冲液(life technologies
tm
)中以200v运行50min，之后使用干式印迹系统(life technologies
tm
)转移至聚偏氟乙烯(pvdf)膜。
[0073]
使用ibind
tm
flex western系统和一抗(cd81，克隆m38和cd63，克隆ts63；1:1,000稀释；life technologies
tm
)以及适当的二抗(山羊抗小鼠hrp，1:4,000稀释)进行免疫印迹。使用pierce
tm
ecl蛋白质印迹底物和uvp chemidoc-it2成像仪检测化学发光信号。
[0074]
在所有情况下，沉降材料对cd63外泌体标志物呈阳性，证明抗dag能够沉降肌肉外泌体。
[0075]
实施例2
[0076]
从血清中免疫捕获细胞培养外泌体
[0077]
为了测试来自复杂起始材料(如血清)的肌肉外泌体的免疫捕获是否会被来自内源性血清igg的竞争阻碍，将来自细胞培养基的肌肉外泌体注射到获得自帕金森病患者以
及年龄和性别匹配的健康受试者的人血清样品中(如上所述的协议nct02305147)，并且如上所述进行co-ip。
[0078]
总之，将来自健康受试者(h)的200μl血清与来自培养基的在800,000个成肌细胞分化成肌管的3天培养期间分泌的肌肉外泌体一起注射。然后将含有注射的外泌体的血清与约6.7x107个包被有抗dag1抗体(morris,g.e.存放在发育研究杂交瘤库(dshb)作为dshb杂交瘤产品dag-6f4的dag-6f4)的磁珠一起孵育3h。如上所述，使用磁性支架捕获和洗涤珠。然后用nupage缓冲液切割捕获的肌肉外泌体，并将其加载到凝胶中，以使用如上所述的对外泌体标志物cd63和cd81具有特异性的抗体进行蛋白印迹分析。
[0079]
来自细胞培养基的外泌体成功地从人血清样品中分离出来，从而证实抗dag1珠能够从生物流体中捕获外泌体，而不受内源性抗原的显著干扰(参见图2)。
[0080]
实施例3
[0081]
循环肌肉外泌体提取
[0082]
为了测试是否可以使用抗dag1免疫亲和方法从血清中分离循环肌肉外泌体，使用了来自人类受试者的血清。
[0083]
总之，为了从人血清样品中分离外泌体，首先通过以2000x g离心30min清除200ul血清中的碎片。接下来，根据制造商的说明，使用总外泌体分离试剂(来自血清；life technologies
tm
)分离外泌体，但体积有所改变。具体地，将20μl而不是推荐的40μl分离试剂添加到血清样品中，并将样品涡旋并使其在冰上孵育30min，随后以10,000x g离心10min。然后除去上清液并保存，用于外泌体消耗的下游分析，并将颗粒重新悬浮在200μl pbs中，并在-80℃下保存直至需要。
[0084]
如上所述，从200μl血清中沉淀出外泌体。然后如上所述，将总循环外泌体与包被有抗dag1抗体的磁珠一起孵育3h。然后如上所述使用磁体分离和洗涤珠。然后使用nupage缓冲液从肌肉外泌体中提取蛋白质，并将其加载到凝胶上以进行蛋白印迹分析(参见图3a)。蛋白印迹分析显示，由靶向肌肉膜蛋白的抗体沉降的囊泡对外泌体标志物cd63和cd81呈阳性，证明了使用抗dag1从血清中分离肌肉外泌体的免疫亲和方法的可行性(参见图3b)。
[0085]
实施例4
[0086]
来自健康受试者的循环肌肉外泌体的免疫捕获
[0087]
为了确定是否可以用抗dag1珠从健康对照的血清中分离出循环肌肉外泌体，将样品体积增加至500μl，并如上所述进行免疫沉淀。还测试了不同洗脱缓冲液从抗dag1分离珠切割捕获的外泌体的能力。
[0088]
总之，外泌体从500μl血清中沉淀出来。然后如上所述，将总循环外泌体与包被有抗dag1抗体的磁珠一起孵育3h。如上所述，使用磁性支架捕获和洗涤珠。然后使用nupage缓冲液(np)、8m尿素缓冲液或市售洗脱缓冲液(eb)切割捕获的肌肉外泌体，并将其加载到凝胶中，以使用如上所述的对外泌体标志物cd63和cd81具有特异性的抗体进行蛋白印迹分析。
[0089]
随着样品体积的增加，从健康对照的血清中成功捕获到cd63和cd81阳性的肌肉外泌体(参见图4)。不同洗脱缓冲液的测试也证实了相对于低ph洗脱缓冲液，nupage缓冲液和8m尿素缓冲液在切割捕获的外泌体方面最有效。
技术特征：1.一种分离外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包括外泌体的样品；(b)鉴定所述外泌体上的细胞表面多肽；(c)为所述细胞表面多肽提供结合配偶体；(d)使所述结合配偶体与所述样品接触；(e)分离所述结合配偶体，以及(f)分离所述外泌体；其中所述细胞表面多肽是抗肌萎缩蛋白聚糖(dag)。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是生物流体样品。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品是血清样品。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述样品包含生物组织。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述样品包含选自内胚层组织、中胚层组织和外胚层组织的生物组织。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述中胚层组织是肌组织。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肌组织包含选自骨骼(横纹)肌细胞；平滑(非横纹)肌细胞；和心脏(半横纹)肌细胞的细胞。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞表面多肽是α-抗肌萎缩蛋白聚糖。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞表面多肽的结合配偶体是能够结合所述细胞表面多肽的抗体。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述细胞表面多肽的结合配偶体包含能够结合所述细胞表面多肽的抗体和固体支持物。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述固体支持物是磁珠。
技术总结本发明涉及一种分离外泌体的方法。具体地，本发明涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：提供包括外泌体的样品；鉴定所述外泌体上的细胞表面多肽；以及使用所述外泌体上的所述细胞表面多肽分离所述外泌体。可以研究通过本发明的方法分离的外泌体，以用于鉴定生物标志物、了解生物功能和疾病，并找到用治疗剂靶向它们的方法。它们的方法。它们的方法。
技术研发人员：S
受保护的技术使用者：阿尔斯特大学
技术研发日：2020.12.04
技术公布日：2022/11/1
