一种蜂花粉蛋白的制备方法

1.本发明涉及生化技术领域，具体为一种蜂花粉蛋白的制备方法。


背景技术：

2.蜂花粉是蜜蜂采集被子植物雄株或裸子植物小孢子囊内的花粉细胞，形成的团粒状 物，其中的营养物质极其丰富，含有多种氨基酸、维生素、微量元素、黄酮类物质等250 多种物质，且营养成分搭配合理，是人类天然食品中的瑰宝。目前，国内销售主要是以 油菜、茶花和莲花蜂花粉为主，还有一些我国特有的且具有较高营养价值的，例如五味 子蜂花粉。
3.蛋白质在蜂花粉中的含量相当丰富，它不仅含有大分子的蛋白还含有易于人体吸收 的小分子生物活性肽。其中油菜花粉、玉米花粉的总氨基酸量及必需氨基酸总量分别为 24.01％和10.68％、16.99％和6.93％，氨基酸组成都相对较好。另有研究显示，油菜蜂花 粉中的氨基酸种类高达18种，且必需氨基酸与总氨基酸之比分别为53.62％和48.71％， 均高于世界粮农组织推荐的优质蛋白氨基酸构成的理想模式(33.90％)，这进一步表明 蜂花粉是优质蛋白的重要来源之一。
4.但是在现有的蜂花粉蛋白提取方法中，获得蛋白产品得率较低，所含的脂类及其他 杂质较多，因此需要对蜂花粉蛋白的提取方法进行改进。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种蜂花粉蛋白的制备方法，以提高所得蛋白产品的得率和 品质。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种蜂花粉蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：
8.1)脱脂处理：将原花粉用溶剂进行脱脂处理并晾干，得到脱脂花粉；
9.2)破壁处理：将脱脂花粉于水中溶解后置于超声波细胞粉碎机中超声处理，获得 破壁花粉溶液；
10.3)蛋白分离：分离破壁花粉溶液中的蛋白。
11.优选地，所述脱脂过程在索氏提取器中进行，将花粉包装后放入索氏提取器，经石 油醚提取回流，晾干后获得脱脂花粉。
12.更优选，原花粉在脱脂前首先用粉碎机粉碎，过筛后进行脱脂。
13.优选地，脱脂花粉的破壁处理采用温差超声破壁处理，脱脂花粉经冷冻后于热水中 溶解，然后降温，于水浴锅中搅拌，再于超声下处理。具体而言，脱脂花粉首先于-20℃ 下冷冻12-24h，迅速加入80℃热水搅拌使花粉溶解，花粉与热水的料液比为1g：5ml， 即刻冷却至45℃，并放入42℃恒温水浴锅中，持续搅拌6h，然后花粉液置于超声波细 胞粉碎机处理，设置超声强度400w(67％)，超声时间30min，超声开2s，超声关2s。
14.在步骤3)中，优选地，破壁花粉溶液用蒸馏水稀释，调节至碱性使蛋白溶出，离 心
取上清液，调节至等电点使蛋白沉淀，离心弃上清，得到分离蛋白。
15.更具体而言，破壁花粉溶液的稀释比为1g：30ml料液比，用1mol/l naoh溶液调 节ph至10.0，在55℃的恒温水浴锅中持续搅拌80min使蛋白溶出，以3500rpm的转速 离心20min并取出上清液，用1mol/l盐酸将上清液调节至ph4.0后静置10min，以 3500rpm离心20min，弃上清，得到分离蛋白。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过本发明方法，能够改变所得蜂花粉蛋 白的粒径大小，提高了所得蜂花粉蛋白的溶解度、乳化性和起泡性。
附图说明
17.图1是三种例示性花粉破壁前后的花粉微观结构，其中r：油菜蜂花粉；s：五味 子蜂花粉；c：玉米蜂花粉。ru：破壁油菜蜂花粉；su：破壁五味子蜂花粉；cu：破 壁玉米蜂花粉；
18.图2是本发明方法中三种例示性蜂花粉提取蛋白质得率，其中ru：破壁油菜蜂花 粉；su：破壁五味子蜂花粉；cu：破壁玉米蜂花粉；
19.图3是三种例示性花粉分离蛋白破壁前后的粒径分布，其中r:油菜花粉蛋白；ru: 破壁油菜花粉蛋白；s:五味子花粉蛋白；su:破壁五味子花粉蛋白c:玉米花粉蛋白；cu: 破壁玉米花粉蛋白；
20.图4是三种花粉蛋白的破壁前后微观形态对比，其中r:油菜花粉蛋白；ru:超声油 菜花粉蛋白；s:五味子花粉蛋白；su:超声五味子花粉蛋白；c:玉米花粉蛋白；cu:超声 玉米花粉蛋白；
21.图5是三种花粉分离蛋白及其破壁对照的溶解度曲线，其中r:油菜花粉蛋白；ru: 破壁油菜花粉蛋白；s:五味子花粉蛋白；su:破壁五味子花粉蛋白；c:玉米花粉蛋白； cu:破壁玉米花粉蛋白。
具体实施方式
22.下面将结合本发明的具体实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所 有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.蜂花粉是优质的蛋白质提取原料，其中不仅含有大分子的蛋白还含有易于人体吸收 的小分子生物活性肽。本文选取油菜蜂花粉、玉米蜂花粉及五味子花粉3种作为例示性 实施例进行蛋白质提取研究，选用温差-超声相结合的破壁工艺，通过等电点沉淀法分 离蛋白，并进行冷冻干燥，最终获得具有速溶效果的蜂花粉冻干蛋白。通过对3种蜂花 粉分离蛋白的得率、微观结构与功能性质的研究，探讨发现，油菜蜂花粉的蛋白得率最 高，溶解性最好，在性质上与其余两种花粉有所参差。进一步研究发现，采用温差-超 声相结合的破壁工艺能改变花粉蛋白的粒径大小，从而提高其溶解度、乳化性和起泡性。
24.花粉细胞壁较为特殊，有比较坚硬的外壁，且包含孢粉素、纤维素和花粉素等致密 物质，其存在不仅可以抵抗极高的温度和极大的压力、还可以耐腐蚀，对于物理、化学 及生物酶的降解都较稳定。这层花粉壁极为坚硬，人类胃肠道难以消化，因此需进行特 殊的破壁处理，使其中的营养成分大量释放出来，这样得到的产品才得以被人体消化吸 收。结合
对实验室的器材条件及实验可行性的考量，最终采用温差-超声复合破壁法对 花粉进行破壁。由于不同蜂花粉的蛋白质得率、结构和功能存在差异，本实验的研究对 蜂花粉蛋白的开发及利用具有重要的意义。
25.此外，蛋白提取工艺的选取也十分重要。不同提取方法对蛋白品质具有影响，脱脂 前处理可以显著降低蛋白中黄酮类含量和重金属含量，并得出先醇提脱脂后通过等电点 沉淀法提取的蛋白含量最高，且具有较高的氨基酸含量。由此可见，先脱脂后再采用等 电点沉淀法的蛋白提取工艺相较于其他蛋白提取工艺更具优势，这也是本文选取此种工 艺的原因。
26.下面将结合具体实施例对本发明的方案进行说明。
27.1.实验材料与设备
28.1.1样品原料
[0029][0030]
1.2试剂与仪器
[0031]
1.2.1主要试剂(均为分析纯或化学纯)
[0032][0033]
1.2.2主要仪器与设备
[0034][0035]
2.实验方法
[0036]
2.1样品前处理
[0037]
将原花粉用粉碎机粉碎，过筛，进行脱脂处理，即将粉碎花粉用纱布分装包裹、棉 线系口，放入索氏提取器，经石油醚提取回流两次后，取出晾干。脱脂后的花粉密封分 装，放入-20℃冰箱备用。
[0038]
2.2花粉温差-超声破壁处理
[0039]
根据胡筱波
[8]
等人，经前处理的花粉置于-20℃冰箱冷冻24h后，以料液比1：5(g/ml) 迅速加入80℃热水搅拌，使花粉溶解，即刻冷却至45℃，并放入42℃恒温水浴锅中， 持续搅拌6h。取少许温差破壁花粉制片，将其余花粉液置于超声波细胞粉碎机处理，设 置超声强度400w(67％)，超声时间30min，超声开2s，超声关2s，同样取少许制片， 在显微镜下观察破壁情况。
[0040]
2.3花粉分离蛋白的制备
[0041]
破壁处理后的花粉溶液加蒸馏水至1：30料液比，混匀。用1mol/l naoh溶液调节 ph至10.0，在55℃的恒温水浴锅中持续搅拌80min后，以3500rpm的转速离心20min 并取出上清液。用1mol/l盐酸将上清液调节至ph4.0后静置10min，以3500rpm离心 20min，弃上清，得到分离蛋白，用蒸馏水洗涤两次，以免过多浪费。将所得蛋白液调 至ph7.0(中性)，一部
分进行超声处理作为样品对照组，设置超声强度360w(60％)， 超声时间20min，超声时间开2s，关2s。将未超声与超声后的花粉蛋白液分装在平皿 中，预冷冻后进行冷冻干燥。
[0042]
2.4花粉分离蛋白功能性质及结构的测定
[0043]
2.4.1花粉微观结构观察
[0044]
采用光学显微镜观察花粉破壁先后的微观结构。
[0045]
2.4.2蛋白质得率的测定
[0046]
采用凯氏定氮法测定花粉和冻干粉中的总蛋白含量，得率的计算按照下述公式：蛋 白质得率＝(冻干粉中总蛋白的质量/花粉中总蛋白的质量)
×
100
[0047]
2.4.3蛋白粒径的测定
[0048]
将3种花粉分离蛋白与超声对照组分别配置2mg/ml的样品分散液，用激光粒度仪 进行测定。将异硫氰酸荧光素溶于二甲基亚砜中，配置成浓度为0.1％mg/ml的荧光染 剂(避光保存)。取0.5ml的2mg/ml蛋白溶液于离心管中，加入5μl荧光染液，混 匀后用移液枪吸取5μl样液置于载玻片上，附盖玻片后在荧光显微镜下观察拍照。
[0049]
2.4.4蛋白质溶解性测定
[0050]
2.4.4.1试剂与标准品制备
[0051]
①
试剂：试剂a：1g碳酸钠+0.02g氢氧化钠+50ml磷酸缓冲液(pbs)
[0052]
试剂b：0.5g硫酸铜+1g酒石酸钾钠+100mlpbs
[0053]
试剂a、b按体积比50：1混匀，现配现用
[0054]
②
蛋白标准品：pbs配制牛血清蛋白标准品溶液2mg/ml，涡旋混匀，备用。
[0055]
2.4.4.2标准曲线
[0056]
用移液枪精密量取蛋白标准溶液0ml(空白)、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、 1.0ml分别置于试管中，加入pbs补至1ml，涡旋备用。
[0057]
2.4.4.3lowry法测定
[0058]
配制2mg/ml样品溶液，按1：5加入试剂，静置10min，再加入0.5mlfolin-酚试 剂，迅速混匀，在25℃恒温水浴中水浴30min后，在酶标仪上测定吸光度值，设置波 长650nm，以pbs为空白对照。根据标准品蛋白溶液浓度和吸光度值绘制标准曲线， 并以此计算样品溶液中水溶性蛋白含量。
[0059]
2.4.4起泡性及起泡稳定性测定
[0060]
采用搅打发泡法测定：用ph7.0的磷酸盐缓冲液配制4mg/ml蜂花粉蛋白溶液，分 别取10ml样品于50ml离心管中，在均质机上以23000rpm的速度搅打30s，迅速读取 泡沫体积v0(估读)，重复三次。静置10min后再次读取泡沫体积，记为v
10
，平行三 次。计算起泡性和起泡稳定性fs＝v
10
/v0×
100％。
[0061]
2.4.5乳化性测定
[0062]
参照klompong等的测定方法进行简化，分别取10ml样品于50ml离心管中，加 入2ml金龙鱼大豆油，在ph7.0时用高剪切分散乳化机以23000rpm的速度混合30s后， 立即从最底部吸50μl乳状液加入到5ml0.1％(w/v)sds溶液中，混匀后迅速测定吸光度 值(a0)；在室温静置10min后以相同方法取样，测得吸光度值(a
10
)，波长500nm，0.1％ sds作空白对照。乳化活性(ea)用零时刻的吸光度表征，即ea＝a0；乳化稳定性(es) 用乳化稳定指数(esi)表示：
[0063]
(其中δa＝a
10-a0)
[0064]
2.4.6表面疏水性(h0)测定
[0065]
将花粉蛋白溶于0.01m磷酸缓冲液(ph7.0)中，配置成2mg/ml的浓度，取1ml 于离心管中，另取1ml样品加入1mlpbs，稀释成1mg/ml蛋白溶液，并按浓度梯度稀 释成0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml，0.03125mg/ml，加入5μl 浓度为80mm的ans溶液，迅速混匀,在λex＝390nm，λem＝470nm处进行测定。绘制吸 光度-蛋白浓度曲线，其斜率为蛋白表面疏水性。
[0066]
2.4.7巯基(sh)的测定
[0067]
2.4.7.1溶剂的配制
[0068]
b试剂：按200ml蒸馏水(ph8.0)中加入2.08g三羟甲基氨基甲烷(tris)，1.36g 甘氨酸，0.296gna2edta的比例配制。
[0069]
2.4.7.2测定方法
[0070]
将花粉冻干蛋白溶于b试剂中，使蛋白最终浓度为2mg/ml，置于25℃恒温摇床 24h，在6000rpm下离心15min。每组取上清液3ml加入30l ellman试剂(4mgdtnb/mlb液)，混匀后室温静置15min。设置波长412nm，测取吸光度值，计算样品蛋白中游 离巯基的含量。
[0071]
2.4.8游离氨基的测定
[0072]
2.4.8.1opa溶剂的制备
[0073]
用2ml95％乙醇溶液溶解80mgopa(邻苯二甲醛)，再加入50ml0.01m硼酸缓冲 液(ph9.7)、5ml20％sds和200μlβ-巯基乙醇，加水定容至100ml。
[0074]
2.4.8.2测定方法
[0075]
将样品蛋白溶于0.01m硼酸缓冲液(ph9.7)，配置成2mg/ml的浓度，取200μl 加入到4mlopa溶液中，混匀后90℃水浴加热5min，以l-赖氨酸为标准品，硼酸缓冲 液为空白对照，在酶标仪上波长340nm处测定吸光度值，并计算游离氨基的含量。
[0076]
2.5数据分析
[0077]
所有实验都进行三次平行，数据计算平均值和标准偏差，并采用ibm spss statistics23及statistix 9软件进行anova显著性分析(p《0.05)，采用originpro 2008软件进 行绘图。
[0078]
3.结果分析
[0079]
3.1破壁效果
[0080]
图1展示了三种蜂花粉温差-超声破壁前后的细胞壁完整性与破壁程度对比，可清 晰看出，破壁处理后的花粉细胞壁有一至多处缺口，并伴有内容物溢出。对比发现，在 相同破壁条件下，油菜蜂花粉破壁率最高，较易破壁；玉米蜂花粉破壁率相对较低。
[0081]
3.2蛋白质得率
[0082]
由图2可知，破壁处理后利用等电点沉淀法提取3种花粉蛋白得率有显著差异，其 中油菜蜂花粉蛋白质得率最高，达到79.8％；而玉米蜂花粉蛋白质得率相对较低，说明 蛋白质得率一定程度上受到花粉破壁率的影响，破壁率越高，内容物析出越多，越易提 取出更多蛋白质。
[0083]
3.3蛋白质粒径
[0084]
图3显示了三种花粉蛋白在中性条件下采用破壁工艺处理前后的粒径分布的差异。 可以看出破壁处理可以显著降低蛋白质的粒径。三种蛋白质相比较，破壁玉米蜂花粉蛋 白在中性条件下具有较小的粒径。
[0085]
图4显示了三种花粉蛋白在中性条件下采用破壁工艺处理前后的微观结构的差异。 可以看出破壁处理可以显著降低蛋白质的聚集。
[0086]
3.4蛋白溶解性
[0087]
图5显示了在不同ph条件下三种花粉蛋白采用破壁工艺处理前后的溶解性的差异。 可以看出破壁处理可以显著提升蛋白质的溶解性。三种蛋白质相比较，破壁油菜花粉蛋 白在中性条件下具有较高的溶解性。
[0088]
3.5花粉蛋白乳化特性评价
[0089]
表1显示了在中性(ph7.0)条件下三种花粉蛋白采用破壁工艺处理前后的乳化活 性和乳化稳定性的差异。可以看出破壁处理可以显著提升蛋白质的乳化性和乳化稳定性。 三种蛋白质相比较，油菜花粉蛋白具有较高的乳化活性，五味子花粉蛋白具有较高的乳 化稳定性。
[0090]
表1破壁处理对蜂花粉蛋白乳化性、起泡性、表面疏水性、游离巯基和氨基含量的 影响
[0091]
其中，r:油菜花粉蛋白；ru:破壁油菜花粉蛋白；s:五味子花粉蛋白；su:破壁五味子花 粉蛋白；c:玉米花粉蛋白；cu:破壁玉米花粉蛋白
[0092][0093]
3.6花粉蛋白起泡特性评价
[0094]
表1显示了在中性(ph 7.0)条件下三种花粉蛋白采用破壁工艺处理前后的起泡性 和起泡稳定性的差异。可以看出破壁处理可以显著提升蛋白质的起泡性和起泡稳定性。 三种蛋白质相比较，破壁后的五味子花粉蛋白具有较高的起泡性，破壁玉米花粉蛋白具 有较高的起泡稳定性。
[0095]
3.7表面疏水性评价
[0096]
表1显示了在中性(ph 7.0)条件下三种花粉蛋白采用破壁工艺处理前后的表面疏 水性的差异。可以看出破壁处理可以显著提升蛋白质的表面疏水性。三种蛋白质相比较， 破壁玉米花粉蛋白具有较高的表面疏水性。
[0097]
3.8游离巯基含量评价
[0098]
表1显示了在中性(ph 7.0)条件下三种花粉蛋白采用破壁工艺处理前后的游离巯 基含量的差异。可以看出破壁处理可以显著提升蛋白质的游离巯基含量。三种蛋白质相 比较，破壁五味子花粉蛋白具有较高的游离巯基含量。
[0099]
3.8游离氨基含量评价
[0100]
表1显示了在中性(ph 7.0)条件下三种花粉蛋白采用破壁工艺处理前后的游离氨 基含量的差异。可以看出破壁处理可以显著提升蛋白质的游离氨基含量。三种蛋白质相 比较，破壁五味子花粉蛋白具有较高的游离氨基含量。
[0101]
本发明未详述之处，均为本领域技术人员的公知技术。
[0102]
最后所要说明的是：以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽 管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发 明的技术方案进行修改和等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵 盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：
1.一种蜂花粉蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）脱脂处理：将原花粉用溶剂进行脱脂处理并晾干，得到脱脂花粉；2）破壁处理：将脱脂花粉于水中溶解后置于超声波细胞粉碎机中超声处理，获得破壁花粉溶液；3）蛋白分离：分离破壁花粉溶液中的蛋白。2.如权利要求1所述的蜂花粉蛋白的制备方法，其特征在于，所述脱脂过程在索氏提取器中进行，将花粉包装后放入索氏提取器，经石油醚提取回流，晾干后获得脱脂花粉。3.如权利要求1或2所述的蜂花粉蛋白的制备方法，其特征在于，原花粉在脱脂前首先用粉碎机粉碎，过筛后进行脱脂。4.如权利要求1所述的蜂花粉蛋白的制备方法，其特征在于，脱脂花粉的破壁处理采用温差超声破壁处理，脱脂花粉经冷冻后于热水中溶解，然后降温，于水浴锅中搅拌，再于超声下处理。5.如权利要求4所述的蜂花粉蛋白的制备方法，其特征在于，脱脂花粉首先于-20℃下冷冻12-24h，迅速加入80℃热水搅拌使花粉溶解，花粉与热水的料液比为1g：5ml，即刻冷却至45℃，并放入42℃恒温水浴锅中，持续搅拌6h，然后花粉液置于超声波细胞粉碎机处理，设置超声强度400w（67%），超声时间30 min，超声开2s，超声关2s。6.如权利要求1所述的蜂花粉蛋白的制备方法，其特征在于，破壁花粉溶液用蒸馏水稀释，调节至碱性使蛋白溶出，离心取上清液，调节至等电点使蛋白沉淀，离心弃上清，得到分离蛋白。7.如权利要求6所述的蜂花粉蛋白的制备方法，其特征在于，破壁花粉溶液的稀释比为1g：30ml料液比，用1mol/l naoh溶液调节ph至10.0，在55℃的恒温水浴锅中持续搅拌80 min使蛋白溶出，以3500rpm的转速离心20 min并取出上清液，用1mol/l盐酸将上清液调节至ph4.0后静置10 min，以3500rpm离心20 min，弃上清，得到分离蛋白。

技术总结
本发明提供了一种蜂花粉蛋白的制备方法，包括脱脂处理、破壁处理和蛋白分离的步骤。采用本发明方法提取蜂花粉蛋白，能改变花粉蛋白的粒径大小，从而提高其溶解度、乳化性和起泡性。性。性。


技术研发人员：张凌翔 刘维敏 于嘉敏 薛峰 李璇
受保护的技术使用者：南京中医药大学
技术研发日：2022.04.29
技术公布日：2022/11/1