一种新型冠状病毒n蛋白高效可溶性表达的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒n蛋白 高效可溶性表达的方法。
背景技术：2.基于血清学的检测技术具有成本低、速度快、灵敏度高及易操作 等特点，适合新型冠状病毒感染人群及疫苗接种人群的快速、大规模 检测，目前利用特异蛋白建立快速检测血清技术已经成为一种重要确 诊依据。
3.sars-cov-2n蛋白是冠状病毒中一种具有高度免疫原性的磷 蛋白，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关(lancet,2020 (10224):565-74)。sars-cov-2n蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白 中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗sars-cov-2n蛋白的高 水平抗体，因此可以利用sars-cov-2n蛋白建立快速检测新型冠状 病毒的血清抗体方法。而提高该蛋白的可溶性表达水平对新型冠状病 毒检测试剂盒制备和大幅降低成本具有重要意义。
4.目前在sars-cov-2n蛋白表达中，比较常用的是大肠杆菌表达 系统，其目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强，操作简 单便捷，易于放大，适合低成本大量表达目的蛋白。大肠杆菌的最适 生长温度在37～39℃之间，但此温度下极易生成包涵体蛋白。
技术实现要素：5.本发明在研究中发现，基于sars-cov-2n蛋白原始序列获得高 水平可溶性sars-cov-2n蛋白表达需要在适当条件下诱导，对实验 设备条件要求高且实验周期长。
6.本发明的目的是提供一种优化的sars-cov-2n蛋白基因序列， 并建立基于该序列利用大肠杆菌获得sars-cov-2n蛋白的方法，可 以实现sars-cov-2n蛋白在常规条件下的可溶性高效表达，解决生 产成本高、生产周期长的问题，为免疫学快速诊断、制备单抗、开展 解析蛋白结构研究等提供基础。
7.第一方面，本发明请求保护一种新型冠状病毒n蛋白基因序列， 所述新型冠状病毒n蛋白基因序列如seq id no.1所示。
8.使用在线密码子优化工具(expoptimizer)进行密码子优化，原 始序列为ncbi上下载的编码sars-cov-2n蛋白的全长序列。本发明 通过对系统打分靠前的几个备选序列进行改造，手动修改部分碱基， 获得了如seq id no.1所示的新型冠状病毒n蛋白基因序列，seq idno.1所示的新型冠状病毒n蛋白基因序列的可溶性蛋白表达水平可 达菌体总可溶蛋白的80％以上，明显高于同样条件下原始菌株的表达 量。
9.第二方面，本发明请求保护含有seq id no.1所示新型冠状病毒 n蛋白基因序列的表达载体。
10.第三方面，本发明请求保护含有seq id no.1所示新型冠状病毒 n蛋白基因序列的重组菌。
11.第四方面，本发明提供一种新型冠状病毒n蛋白表达的方法， 采用如seq id no.1所示的新型冠状病毒n蛋白基因序列构建表达 载体，并将所述表达载体转化至大肠杆菌中。
12.在本发明提供的方法中，成功转化表达载体的大肠杆菌菌液 od
600
达到0.6-0.8时，进行新型冠状病毒n蛋白诱导表达。
13.在本发明提供的方法中，诱导表达的条件是向成功转化表达载体 的大肠杆菌中，加入终浓度为0.4-0.5mm的iptg；37-39℃诱导3-4h。
14.具体地，作为本发明的一个具体实施方式，本发明提供的新型冠 状病毒n蛋白表达的方法，包括：
15.(1)将如seq id no.1所示的基因序列，连入表达载体pet28a， 转化至大肠杆菌bl21(de3)中；
16.(2)取表达菌单克隆接种至含有100μg/ml kan+抗生素的lb 液体培养基中，培养过夜；
17.(3)将过夜菌液加到新鲜lb液体培养基中，至od
600
达到0.6-0.8， 加入iptg至终浓度为0.4-0.5mm，37-39℃诱导3-4h。
18.本发明还提供了一种新型冠状病毒n蛋白，所述新型冠状病毒n 蛋白采用上述方法诱导表达得到。
19.根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述新型冠状病 毒n蛋白基因序列或上述的方法，在提高可溶性新型冠状病毒n蛋 白表达量中的应用。
20.以及上述新型冠状病毒n蛋白基因序列或上述的新型冠状病毒 n蛋白，在提高新型冠状病毒血清检测准确度中的应用。
21.本发明的有益效果在于：
22.本发明获得一种优化后的新型冠状病毒n蛋白基因序列，采用优 化后的新型冠状病毒n蛋白基因序列可以实现，在常规条件下，高效 表达可溶性新型冠状病毒(sars-cov-2)n蛋白。
23.具体地，本发明利用优化后的sars-cov-2n蛋白基因序列建立 的蛋白表达方法，明显提高常规条件下可溶sars-cov-2n蛋白的表 达。
24.本发明所述方法获得的可溶性蛋白表达水平可达菌体总可溶蛋 白的80％以上，明显高于同样条件下原始菌株的表达量。
25.本发明提供的方法，克服了现有技术中，需要在最适条件下对包 涵体进行变性复性来使蛋白具有活性；本发明提供的方法操作简单、 实验周期短并且能够降低成本，满足大规模生产需求。
附图说明
26.图1为本发明sars-cov-2n蛋白原始序列与优化序列比对。
27.图2为本发明sars-cov-2n蛋白优化前与优化后37℃4h条件 下诱导表达结果图，其中(a)为优化前表达结果，1为诱导表达沉淀， 2为诱导表达上清；(b)为优化后表达结果，1为诱导表达沉淀，2为 诱导表达上清。
28.图3为本发明sars-cov-2n蛋白鉴定结果，其中(a)为蛋白纯 化后结果图；(b)为
his标签抗体的wb结果；(c)为n蛋白鼠单抗的 wb结果。
29.图4为本发明两个不同优化后sars-cov-2n蛋白37℃4h条件 下诱导表达结果图，其中1为未诱导表达蛋白对照；2为优化后序列2 的可溶表达蛋白；3为优化后序列1的可溶表达蛋白。
具体实施方式
30.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
31.实施例1sars-cov-2n蛋白基因序列优化
32.使用在线密码子优化工具(expoptimizer)进行密码子优化。
33.原始序列为ncbi上下载的编码sars-cov-2n蛋白的全长序列， 打开在线密码子优化工具(expoptimizer) https://www.novopro.cn/tools/codon-optimization.html。选择序列类型为 dna/rna，输入上述sars-cov-2n蛋白基因序列，选择表达宿主 e.coli(大肠杆菌)，选择限制性内切酶位点为bamhi和xhol，后点击 提交。
[0034][0035][0036]
在使用密码子优化工具进行优化后，所获得的序列信息有多套。 本发明针对系统打分靠前的几个备选序列进行改造，手动修改部分碱 基后。最终得到的基因序列如seq id no.1所示：
[0037]
atgtctgataacggtccgcagaaccagcgtaatgctccgcg cattacctttggtggtcctagcgattccaccggtagcaaccaga acggcgaacgttccggtgcacgctctaaacagcgccgtccgca aggtctgccgaacaacacggcttcttggttcaccgcgctgact cagcacggtaaagaggacctgaaatttccgcgtggccagggcg tgccaatcaatactaactcctctccggatgaccagatcggctact atcgtcgcgccactcgtcgtattcgtggtggcgacggcaaaatg aaagatctgtccccgcgttggtacttttattacctgggtactggt ccggaagcaggtctgccgtatggtgcaaacaaagatggcatca tttgggtcgcgactgaaggcgctctgaacaccccaaaagatca catcggcactcgtaacccggctaacaacgcagcaattgttctgc agctgccacagggtaccactctgccgaagggtttttacgctga aggttctcgtggcggttcccaggcaagctcccgttcttcttccc gttctcgcaacagctctcgcaactctaccccgggttcttctcgc ggtacttccccggctcgtatggctggtaacggtggtgatgcggc tctggctctgctgctgctggatcgtctgaaccaactggaatcta aaatgtctggtaaaggccagcagcagcagggtcagactgtaac caaaaaaagcgctgctgaagcgtccaagaaaccgcgtcagaa acgcactgccactaaagcatacaacgttacccaagcgtttggtc gtcgtggtccagaacagacccagggcaacttcggtgaccagg aactgattcgtcaaggtaccgactacaaacactggccgcaaat cgcgcagttcgcaccgtccgcttccgctttctttggcatgtccc gtattggtatggaagttactccgtccggcacttggctgacctata cgggtgcgattaaactggacgacaaagatcctaacttcaaaga ccaggttattctgctgaacaagcacatcgacgcttataaaactt tcccgccgaccgaaccgaaaaaagacaaaaaaaaaaaagcgg atgaaactcaggctctgccgcagcgtcagaaaaaacagcaga ccgttactctgctgccagccgctgatctggacgatttctctaaa cagctgcagcagtctatgagctccgcggactccacccaggca。
[0038]
seq id no.1与原始序列进行比对，identity＝75.32％，如图1所示。
[0039]
seq id no.1的序列分析(密码子偏好参数分析)，使用codonw
[0040]
1.4.2软件进行密码子偏好参数分析(见表1)。
[0041]
表1密码子偏好性参数分析结果
[0042][0043]
实施例2 sars-cov-2n蛋白表达质粒构建及诱导表达
[0044]
将实施例1得到的sars-cov-2n蛋白基因序列，连接至pet28a 表达质粒上，转化至大肠杆菌bl21(de3)中。
[0045]
挑取阳性单克隆菌接种于2ml含有100μg/ml kan+抗生素的lb液 体培养基中，在37℃，180rpm的摇床内培养过夜；过夜菌液按1:100 接种于200ml含有100μg/ml kan+抗生素的新鲜lb培养基中，37℃， 180rpm培养到od
600
为0.6-0.8，加入iptg至终浓度为0.5mm，37℃， 180rpm继续诱导4h。诱导表达后的200ml大肠杆菌菌液进行离心， 8000rpm,15min，收集菌体，pbs洗两次。将菌体悬于裂解缓冲液(20 mm tris-hcl,ph 7.5)中，60w，超声6s，间歇12s，处理30min。 12000rpm离心30min收集上清，用0.2μm滤膜过滤。对表达上清进行 sds-page实验，结果如图2所示，与原始序列相比，优化后表达的 可溶性sars-cov-2n蛋白含量明显增加。
[0046]
实施例3 sars-cov-2n蛋白的western blot鉴定
[0047]
在完成实施例2的sds-page蛋白电泳后，进行转膜。甲醇活化pvdf膜2-4分钟，海绵、滤纸和胶用转膜液浸泡。湿转电泳仪转膜条 件为：350ma，30min。用含0.1％tween20的tris缓冲液(tbst)洗 膜3次，每次10min；加入封闭液(1
×
tbs+0.5％脱脂奶粉+0.05％的 tween20)，常温封闭4小时后，用tbst洗膜3次，每次10min；分别加 入1:3000的鼠抗his一抗和鼠抗n蛋白一抗稀释液，4℃过夜。tbst洗 膜3次，每次10min，加入1:5000的二抗反应液(辣根过氧化酶标记羊 抗鼠二抗)，室温1h，tbst洗膜3次，每次10min。a液和b液1：1混 合，滴在pvdf膜上，拍照。结果如图3所示。图3的结果显示，本发 明优化后的sars-cov-2n蛋白基因序列能够得到高特异性的 sars-cov-2n蛋白。
[0048]
对比例1可溶性sars-cov-2n蛋白表达量对比
[0049]
本对比例提供优化后的sars-cov-2n蛋白基因序列和原始序列， 在可溶性sars-cov-2n蛋白表达量上的对比，如图4所示。
[0050]
本对比例中优化后的sars-cov-2n蛋白基因序列包括，seq idno.1及seq id no.2，其中seq id no.2的优化方法与实施例1中提供 的优化方法相同，seq id no.2的碱基没有经过手动调整。
[0051]
seq id no.2基因：
[0052]
atgtcagataatggaccccaaaaccagaggaacgctcctc gcatcaccttcggcggtccatccgatagcaccggtagcaaccaa aacggtgaacgttccggtgcacgttcgaaacagcgtcgcccgc agggtctgccaaacaacacggcgagctggtttaccgcgctgac ccaacatggcaaagaagatctgaaatttccgcgtggtcagggc gtaccgattaataccaattcctctccggatgatcaaatcggttac taccgccgcgcaacacgtagaatccgtggtggcgacggcaaga tgaaagacctgagcccgcgctggtacttctactacctgggcact ggccctgaggcaggtttgccgtacggagcgaacaaagacggta ttatctgggttgctactgagggggcgttgaacacgcccaaagaccacattggtacccgtaacccggcgaataacgctgctattgttc tgcaactgccgcagggcaccaccctgccgaaaggtttttatgc tgaaggttcgcgcggtggtagccaggcatcttctcgtagctcaa gccgttcccgtaacagcagccgtaattctacgccgggtagttcc agaggtaccagcccggcgcgtatggcaggcaacggcggcgatg ccgcgctggcattactgctcctggatcgtctgaatcagttggag agcaagatgagcggcaaaggtcaacagcaacagggtcaaacg gtgaccaagaagagcgctgcggaagcgtccaagaagccgcgt caaaagcgtaccgccaccaaggcgtataacgtgactcaagcct tcggtcgtcgcggcccggagcagacccagggtaattttggcga tcaagagctgatccgccagggcacggattataaacattggccgc agatcgcccagttcgctccgtctgcgagcgcgttcttcggcatg agcaggatcggcatggaagttaccccgtctggtacgtggcttac ctataccggcgctattaagctggacgacaaggacccgaatttta aggaccaggtcatcctgctgaacaagcacattgatgcatataaa acgtttccgccgaccgagccgaagaaagacaaaaaaaaaaag gcggacgaaacccaggcgctgccgcaacgtcagaaaaagcag cagaccgtgacccttttgccggcggcggacctcgacgacttca gcaaacaattgcagcaatcaatgtcttcggcggatagcaccca agcgtaa。
[0053]
将seq id no.2所示的sars-cov-2n蛋白基因序列进行表达载 体构建，并转化至大肠杆菌bl21(de3)中。表达质粒构建及诱导表达 的方法与实施例2相同。
[0054]
对可溶性sars-cov-2n蛋白表达量进行检测，采用seq idno.1所示sars-cov-2n蛋白基因序列时，可溶性sars-cov-2n蛋 白表达量为5mg/l。
[0055]
采用seq id no.2所示sars-cov-2n蛋白基因序列时，可溶性sars-cov-2n蛋白表达量约为0.5mg/l。
[0056]
采用sars-cov-2n蛋白基因原始序列时，可溶性sars-cov-2 n蛋白表达量约为0.5mg/l。
[0057]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
技术特征：1.新型冠状病毒n蛋白基因序列，其特征在于，所述新型冠状病毒n蛋白基因序列如seq id no.1所示。2.含有权利要求1所述新型冠状病毒n蛋白基因序列的表达载体。3.含有权利要求1所述新型冠状病毒n蛋白基因序列的重组菌。4.一种新型冠状病毒n蛋白表达的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的新型冠状病毒n蛋白基因序列构建表达载体，并将所述表达载体转化至大肠杆菌中。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，成功转化表达载体的大肠杆菌菌液od
600
达到0.6-0.8时，进行新型冠状病毒n蛋白诱导表达。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，诱导表达的条件是向成功转化表达载体的大肠杆菌中，加入终浓度为0.4-0.5mm的iptg；37-39℃诱导3-4h。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括：(1)将如seq id no.1所示的基因序列，连入表达载体pet28a，转化至大肠杆菌bl21(de3)中；(2)取表达菌单克隆接种至含有100μg/ml kan+抗生素的lb液体培养基中，培养过夜；(3)将过夜菌液加到新鲜lb液体培养基中，至od
600
达到0.6-0.8，加入iptg至终浓度为0.4-0.5mm，37-39℃诱导3-4h。8.一种新型冠状病毒n蛋白，其特征在于，所述新型冠状病毒n蛋白采用权利要求4-7任一项所述的方法诱导表达得到。9.权利要求1所述的新型冠状病毒n蛋白基因序列或权利要求4-7任一项所述的方法，在提高可溶性新型冠状病毒n蛋白表达量中的应用。10.权利要求1所述的新型冠状病毒n蛋白基因序列或权利要求8所述的新型冠状病毒n蛋白，在提高新型冠状病毒血清检测准确度中的应用。
技术总结本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒N蛋白高效可溶性表达的方法。本发明将原始的SARS-COV-2N蛋白基因序列进行优化，并手动调整部分碱基，获得如SEQ ID NO.1所示的基因序列。采用本发明提供的优化后的SARS-COV-2N蛋白序列在大肠杆菌中诱导表达时，仅产生极少量的包涵体蛋白。因此，本发明提供的新型冠状病毒N蛋白高效可溶性表达的方法，可以实现低成本、高表达量的效果。高表达量的效果。
技术研发人员：宫雅楠 闫笑梅 房梦飏 尤元海 魏销玥 张建中
受保护的技术使用者：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
技术研发日：2022.04.26
技术公布日：2022/11/1
