一种ape1响应型靶向药物递送载体及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及纳米材料与肿瘤学技术领域，具体涉及一种ape1响应型靶向药物递送载体及其制备方法和应用。
背景技术：2.肿瘤微环境是由多种细胞类型组成的复杂组织，包括血管内皮细胞、肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞、肿瘤干细、周细胞以及非细胞成分，如细胞外基质和分泌的细胞外分子。肿瘤微环境与正常细胞有很大不同，如由于肿瘤细胞快速增殖而血管来不及生长导致的血管异常；肿瘤深部血管疏松缺乏足够的氧气导致的缺氧环境，促进糖酵解产生乳酸，形成较低ph的细胞环境。同时，致密而紊乱的细胞也会导致细胞间质压增强，促进药物外排而产生耐药性，如何有效治疗肿瘤依旧为世纪难题。
3.传统抗癌药物临床毒副作用大、依从性差，治疗效果也非常有限。酶作为一种具有代表性的内源性刺激，参与多种关键的生理过程，在许多疾病相关的微环境中表现出不同的表达水平。与其他类型的刺激相比，利用酶作为刺激具有许多优点。酶是内源性的，不需要添加外部刺激，如磁场、超声或光，这提供了固有的生物相容性和生物安全的优点。此外，大多数酶反应快速、高效，反应条件温和(温和温度、ph和水溶液)。酶也可以对其底物表现出非凡的特异性和选择性，从而可以产生可控的化学反应和生物反应。到目前为止，蛋白酶、酯酶、磷酸酶、激酶和氧化还原酶是报道最广泛的酶类刺激物。随着对酶活性的深入了解，许多酶被用作肿瘤诊断或预后的生物标志物。诊断探针可以通过将酶识别底物与成像剂连接来设计，通过酶对底物进行特异性酶处理后，探针可以恢复其信号，从“关闭”到“打开”状态。在另一个重要的应用中，探索酶敏感的前药，以实现治疗药物在靶组织中的选择性激活，同时减少毒性副作用。
4.无嘌呤无嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,ape1)是一种具有dna修复和转录调节功能的多功能蛋白质，在控制细胞对氧化应激反应方面具有多重作用，是真核细胞中主要的无嘌呤无嘧啶核酸内切酶，在所有dna损伤的碱基切除修复(ber)通路中起关键作用。ape1能特异性识别和水解5'端附近的dna无嘌呤无嘧啶(ap)位点，产生一个带有3'-羟基和5'-脱氧核糖磷酸基的缺口，或通过其氧化还原功能激活某些转录因子的dna结合活性。在正常细胞中，ape1主要存在于细胞核中。在大多数肿瘤细胞中，由于旺盛的复制转录活动，不仅是细胞核，细胞质中也会有较高的酶浓度，且浓度是正常细胞内的数倍。近年来的研究表明，ape1的表达量及其在细胞内分布的变化与癌细胞的增殖、分化和凋亡等密切相关，如乳腺癌，非小细胞肺癌，前列腺癌。且ape1在血清中的含量也会随着人体的病变发生变化，因此ape1可以作为肿瘤检测的生物标志物。现有技术公开了一种磁性复合纳米颗粒，该磁性复合纳米颗粒表面通过亲和素-生物素连接的含脱碱基位点dna双链可被目标蛋白脱碱基核酸内切酶i特异性地识别和切割；虽然改专利记载可与将其内的荧光基团替换成抗癌药物，但是如何将药物替换上去，替换何种药物可以更好的发挥靶向递药的作用，仍需进一步研究。
技术实现要素：5.本发明要解决的技术问题是克服现有靶向递药载体的不足，提供一种ape1响应型靶向药物递送载体及其制备方法和应用。
6.本发明的目的在于提供一种ape1响应型靶向药物递送载体的制备方法。
7.本发明的目的在于提供所述制备方法制备的ape1响应型靶向药物递送载体。
8.本发明的目的在于提供所述ape1响应型靶向药物递送载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
10.一种ape1响应型靶向药物递送载体的制备方法，包括以下步骤：
11.s1.将药物溶液与双链结构的ap-dna溶液混合，室温避光孵育0.5～1.5h，制备得到载药ap-dna复合物；
12.s2.将步骤s1制备得到的载药ap-dna复合物与亲和素修饰的磁性纳米材料的溶液混合，室温充分反应，洗涤，即得ape1响应型靶向药物递送载体。
13.本发明所述载药ap-dna复合物是指dna双链碱基对之间插入有目标药物的双链结构的ap-dna；所述ap-dna是指具有ap位点的双链dna。
14.本发明所述ape1响应型靶向药物递送载体是所述载药ap-dna复合物的双链结构的ap-dna与亲和素修饰的磁性纳米材料连接。
15.本发明所述双链结构的ap-dna包括第一单链和所述第二单链，所述第一单链/或第二单链的序列中含有ap位点，第一单链或第二单链上可含有1个或1个以上的ap位点；含有1个以上的ap位点的ap位点数目：可每隔10个碱基存在1个ap位点，cg含量没有特殊要求，不形成g四联体的情况下越高越好。
16.优选地，步骤s1中所述孵育为：10～30℃避光孵育1～1.5h。
17.进一步优选地，步骤s1中所述孵育为：10～30℃避光孵育1h。
18.优选地，步骤s1中所述药物溶液与双链结构的ap-dna溶液以摩尔比为25：1～6混合。
19.进一步优选地，步骤s1中所述药物溶液与双链结构的ap-dna溶液以摩尔比为25：1～5混合。
20.更进一步优选地，步骤s1中所述药物溶液与双链结构的ap-dna溶液以摩尔比为25：5混合。
21.优选地，步骤s2中所述室温充分反应为：5～30℃反应1min～3h。
22.优选地，步骤s2中所述室温充分反应为：5～30℃反应3h。
23.优选地，步骤s1中所述双链结构的ap-dna包括第一单链和第二单链，所述第一单链或第二单链的序列长度为30～100bp。
24.优选地，所述第一单链为序列为5
’‑
tgagctcaagxcgtaacc-3’的dna-18，其中，x代表ap位点；所述第二单链为序列为5
’‑
ggttacgacttgagctcactcaagcagttgatcctttggaaaaaaa-3’的dna-46。
25.优选地，所述第一单链和第二单链混合的摩尔比为1：0.5～1.5。
26.进一步优选地，所述第一单链和第二单链混合的摩尔比为1：1。
27.优选地，所述步骤s1中所述药物溶液中的药物为阿霉素或铂类药物。
28.进一步优选地，所述铂类药物为顺铂、卡铂、奈达铂或奥沙利铂。
29.进一步优选地，所述步骤s1中所述药物溶液中的药物为阿霉素。
30.优选地，步骤s2中所述亲和素修饰的磁性纳米材料为亲和素修饰的羧基二氧化硅四氧化三铁(fe3o4@sio
2-cooh)。
31.利用上述制备方法制备得到的ape1响应型靶向药物递送载体也在本发明的保护范围之内。
32.所述ape1响应型靶向药物递送载体在制备抗肿瘤药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
33.优选地，所述应用中，肿瘤为前列腺癌、甲状腺癌、食道癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、直肠癌中的一种或多种。
34.本发明中的“ap-dna”是指含有ap位点的dna片段，在没有限定的情况下，ap-dna可以选择来源于任意生物体内的含有ap位点的dna片段，或选自现有数据库中含有ap位点的dna片段，还可以为人工合成的含有ap位点的dna片段。只要是将含有ap位点的dna片段与纳米材料进行组装形成药物递送载体，即属于本发明的保护范围内。
35.相比现有技术，本发明具有以下有益效果：
36.本发明提供了一种ape1响应型靶向药物递送载体，该药物载体将核酸修复酶ape1作为触发纳米载体的释药“开关”，当纳米粒进入肿瘤细胞后迅速被ape1特异性识别并切割，以实现协同靶向递送药物。本发明的ape1响应型靶向药物递送载体能够通过磁靶向灵活准确地主动靶向肿瘤组织，提高药物在肿瘤部位的富集效率，增强药物的治疗效果，降低毒副作用；为癌症的精准靶向治疗提供了一种新的途径和研究方向。
附图说明
37.图1为本发明提供的ape1响应型靶向药物递送载体的示意图。
38.图2为本发明实施例2不同dna浓度的ap-dna/dox复合物荧光光谱。
39.图3为本发明实施例2中dox的标准曲线。
40.图4为本发明实施例2各纳米粒的水合粒径、zeta电位的测试结果(a)和si@ad@d/d的透射电镜图(b)。
41.图5为本发明si@ad@d(fam)纳米粒与不同浓度ape1反应的荧光值。
42.图6为本发明dox释放率与时间的曲线图(ape1响应)。
43.图7为本发明dox释放率与时间的曲线图(体外释放)。
44.图8为本发明dox释放率与时间的曲线图(ape1选择)。
45.图9为本发明dox释放率与时间的曲线图(底物)。
46.图10为本发明dox释放率与时间的曲线图(稳定性)。
47.图11为本发明实施例3mcf-7裂解细胞数目与dox释放率的曲线图。
48.图12为本发明实施例4不同浓度纳米粒对mcf-7细胞活性影响结果(n＝5)。
49.图13为本发明实施例4不同浓度纳米粒对lo2细胞活性影响结果(n＝5)。
50.图14为本发明实施例4mcf-7细胞的流式凋亡图(a)和不同纳米粒的总凋亡率(b)；其中，与si@ad@d/d组比，**p《0.01。
51.图15为本发明实施例4mcf-7活死细胞染色图(标尺为100μm)。
52.图16为本发明mcf-7细胞对si@ad@d(fam)的摄取结果(a)和fam的荧光强度(b)(标尺为20μm)。
53.图17为本发明mcf-7与lo2细胞对纳米粒的摄取结果(标尺为20μm)。
54.图18为本发明实施例4mcf-7对si@ad@d/d的摄取结果(a)和各组细胞内dox荧光强度(b)(标尺为20μm，n＝3)。
55.图19为本发明实施例5代表性离体肿瘤图。
56.图20为本发明实施例5肿瘤生长曲线(a)和裸鼠体重相对变化率(b)(n＝6)。
57.图21为本发明实施例5tunel法检测细胞凋亡的荧光图(标尺为100μm)。
58.图22为本发明实施例5肿瘤组织h&e染色图(标尺为200μm)。
59.图23为本发明纳米粒在裸鼠体内的荧光成像图。
60.图24为本发明纳米粒在主要脏器中的荧光成像图(a)纳米粒和荧光强度图(b)(n＝3)。
61.图25为本发明纳米粒在主要脏器的分布图(n＝3)。
62.图26为本发明实施例5主要脏器h&e染色图(标尺为100μm)；其中a为生理盐水组，b为si@ad@d(u)/d组；c为si@ad@d(u)/d+磁组；d为dox组；e为si@ad@d/d组；f为si@ad@d/d+磁组。
63.图27为本发明实施例5血清生化指标的测试结果；其中a为生理盐水组，b为si@ad@d(u)/d组；c为si@ad@d(u)/d+磁组；d为dox组；e为si@ad@d/d组；f为si@ad@d/d+磁组。
具体实施方式
64.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
65.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
66.本发明提供的ape1响应型药物递送载体的示意图如图1所示。
67.实施例1药物递送载体si@ad@d/d纳米粒的制备
68.1.ap-dna的制备
69.利用第一单链dna-18和第二单链dna-46制备ap-dna双链。只要是能互补的两条单链都可以；只能有一条链含有ap位点。
70.第一单链dna-18：含18个碱基，修饰有ap位点，其中x即表示ap位点；第二单链dna-46：含46个碱基。单链dna-18和dna-46以及单链dna-18和单链dna-46荧光修饰后的单链dna(fam)-18和dna(bhq)-46的核酸序列信息如表1所示。
71.表1核酸序列信息
72.名称碱基序列(5
’→3’
)dna-185
’‑
tgagctcaagxcgtaacc-3’dna(fam)-185
’‑
tgagctcaagxcgtaacc-fam-3’dna-465
’‑
ggttacgacttgagctcactcaagcagttgatcctttggaaaaaaa-biotin-3’dna(bhq)-465
’‑
bhq-ggttacgacttgagctcactcaagcagttgatcctttggaaaaaaa-biotin-3’73.备注：表格中的“x”表示ap位点。
74.将终浓度均为0.5μm的dna-18水溶液与dna-46水溶液按摩尔比1:1比例混合，经过
退火得到ap-dna溶液。
75.2.ap-dna/dox复合物的制备
76.称取盐酸阿霉素0.0029g，加无酶水溶解于15ml离心管中，配制成500μm的阿霉素溶液(dox溶液)，避光贮存。将上述制备的终浓度为0.5μm的ap-dna溶液与终浓度为2.5μm的dox溶液混合，震荡混匀，室温避光孵育1h，即得ap-dna/dox复合物(d/d)。
77.3.药物递送载体(si@ad@d/d)的制备
78.取浓度5mg/ml的羧基二氧化硅四氧化三铁磁性纳米粒(fe3o4@sio
2-cooh，苏州诺德派森医药科技有限公司)100μl，超声分散1min后，与现配的edc溶液和sulfo-nhs溶液混合，使混合液中edc终浓度为4mg/ml，sulfo-nhs终浓度为10mg/ml，将混合液置于37℃恒温摇床上羧基活化反应15min；然后再立即加入终浓度为0.2mg/ml的亲和素溶液(avidin)溶液(使最终混合液体积为500μl)，置于恒温摇床室温反应过夜(12h)。反应后将反应液置于磁力架上，进行磁分离，吸除上清液，用1
×
pbs洗涤三次，最后用等体积1
×
pbs分散，得到表面修饰有亲和素(avidin)的磁性纳米粒(磁性纳米材料)si@ad。
79.将上述制备所得的终浓度为5μm的ap-dna/dox复合物(d/d)与终浓度为0.5mg/ml的si@ad混合，室温震荡反应3h，用无酶水洗涤三次后分散在等体积的无酶水里，即得药物递送载体si@ad@d/d纳米粒。
80.实施例2不同因素对si@ad@d/d纳米粒的影响
81.1.dna与dox的结合比例si@ad@d/d纳米粒的影响
82.按照实施例1中ap-dna/dox复合物的制备方法，将终浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6μm的dna-18水溶液分别与同浓度的dna-46水溶液按摩尔比1:1比例混合，退火形成ap-dna双链，得到不同浓度的ap-dna溶液。将终浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6μm的各浓度的ap-dna溶液中分别加入终浓度为2.5μm的dox溶液，震荡混匀，室温避光孵育1h，得到不同dna浓度的ap-dna/dox复合物(d/d)。将不同dna浓度的ap-dna/dox复合物分别取100μl加至96孔酶标板中，选择激发波长480nm，扫描不同dna浓度的ap-dna/dox复合物的荧光光谱，观察dna与dox的结合比例对各ap-dna/dox复合物的影响。
83.不同dna浓度的ap-dna/dox复合物荧光光谱如图2所示，终浓度为2.5μm的dox，与不同浓度的dna(即ap-dna)孵育后，dox的荧光强度随着dna浓度的提高而下降，当dna终浓度为0.5μm时，dox的荧光强度不再降低，表明浓度0.5μm的dna能完全淬灭浓度2.5μm dox的荧光，即2.5μm浓度的dox能全部插入0.5μm浓度的ap-dna中，由此可知ap-dna与dox的最佳结合摩尔比为1:5(5:25)。
84.2.dox标准曲线的制备
85.取实施例1制备的dox溶液，分别配制浓度为0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.4μm、0.8μm、1μm的dox溶液，每个浓度dox溶液分别取100μl加至96孔酶标板中，在300nm～800nm波长范围内扫描吸收光谱，连续测定3次，取平均值，得到最大激发波长(λex)为480nm；在500nm～800nm波长范围内扫描荧光光谱，激发波长设定为480nm，测得最大发射波长(λem)为594nm，然后在最大激发波长480nm和最大发射波长为594nm下测定dox的荧光强度。根据荧光强度和dox的浓度，绘制标准曲线，dox的标准曲线如图3，荧光强度(y)与dox的浓度(x)的线性关系为：y＝1.667x+0.114。
86.3.纳米粒粒径和电位的测试
87.利用实施例1的方法制备为未载dox、修饰有ap-dna和亲和素的si@ad@d纳米粒。
88.将制备的si@ad@d和实施例1制备的：fe3o4@sio
2-cooh(si-cooh)、si@ad、si@ad@d/d纳米粒分别用无酶水稀释到0.05mg/ml，超声分散后测定纳米粒的水合粒径和zeta电位。将si@ad@d/d稀释到0.1mg/ml后在透射电镜下观察粒径形态和大小。
89.各纳米粒的水合粒径、zeta电位的测试结果(a)和si@ad@d/d的透射电镜图(b)如图4所示，图4中a显示，si@ad的水合粒径约为260nm，zeta电位约为-20mv，fe3o4@sio
2-cooh被亲和素修饰后(si@ad)，水合粒径由110nm增加到260nm，zeta电位绝对值降低，这导致纳米粒之间斥力减小、分散性降低，说明亲和素修饰成功。si@ad@d/d的水合粒径约为120nm，zeta电位约为-20mv，连接带强负电荷的ap-dna和带正电荷的dox后(si@ad@d/d)，纳米粒的负电位绝对值又增大，说明si@ad@d/d成功合成。图4中b显示，si@ad@d/d的纳米粒为粒径均一的球形，粒径在110nm左右，与水合粒径结果基本吻合；说明si@ad@d/d的成功合成。
90.4.ap-dna/与si@ad的连接
91.按照实施例1的方法以表1中荧光修饰的dna(fam)-18和dna(bhq)-46制备荧光修饰的ap-dna双链，并制备未载dox的荧光修饰的si@ad@d(fam)纳米粒，该荧光修饰的ap-dna的两条单链上分别修饰了荧光基团fam与荧光淬灭基团bhq，当无嘌呤无嘧啶核酸内切酶1(ape1)在ap位点剪切dna时，fam基团脱落，摆脱bhq基团后荧光恢复。利用浓度分别为0u/ml(control)、1u/ml、2u/ml的ape1与si@ad@d(fam)纳米粒反应。
92.si@ad@d(fam)纳米粒与不同浓度ape1反应的荧光值如图5所示。图5显示，当加入ape1后，si@ad@d(fam)释放的fam荧光值随时间延长有明显的上升趋势，且反应速率随ape1浓度的增加而增大，而不加酶的control组没有荧光，说明反应体系没有明显荧光背景值。说明ap-dna确实能与si@ad连接，所以ap-dna/dox复合物也能与si@ad连接。
93.实施例3si@ad@d/d纳米粒的释药特性试验
94.1.ap-dna/dox复合物对ape1的响应
95.按照实施例1的方法，将表1中dna-18和dna(u)-18(不含ap位点，核酸序列为5
’‑
tgagctcaagucgtaacc-3’)分别与dna-46结合，制备得到ap-dna和dna(u)，将终浓度均为0.2μm的ap-dna和dna(u)分别与终浓度为1.0μm的dox孵育，制得ap-dna/dox复合物与dna(u)/dox复合物，再将复合物再分别与终浓度为2u/ml的ape1，37℃下孵育。在波长594nm处检测不同时间点dox的荧光强度值，参照实施例2得到的dox的标准曲线，根据溶液中dox的荧光强度来计算dox的释放率，并绘制dox释放率与时间的曲线图(ape1响应)，如图6所示。
96.图6显示，在ape1水解作用下，ap-dna/dox复合物中的dox快速释放，在40min达到平台期，释放率约50％；而dna(u)/dox复合物中dox释放率与空白对照组结果接近；说明，ape1只对ap-dna/dox产生了水解作用，释放了dox；表明ape1对含有ap位点的ap-dna/dox有良好选择性，并在相互作用后有效释放dox。
97.2.si@ad@d/d纳米粒的体外药物释放试验
98.配制反应体系：将终浓度分别为2mm、200mm、0.1mg/ml的氯化镁、氯化钾、牛血清白蛋白(bsa)与50μl(1mg/ml)的si@ad@d/d纳米粒混合，加无酶水使最终反应体积为100μl，将混合液分组，然后分别与终浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4u/ml的ape1反应，利用酶标仪在波长594nm处测定各组dox不同时间点的荧光强度。2u/ml的ape1，37℃下孵育。在波长594nm处检测不同时间点dox的荧光强度值，参照实施例2得到的dox的标准曲线，根据溶液
中dox的荧光强度来计算dox的释放率，并绘制dox释放率与时间的曲线图(体外释放)，如图7所示。
99.图7显示，dox的释放速率随着ape1浓度的提高而加快，到达平台期的时间也不断提前，当ape1浓度为2u/ml，反应速率有较大提升；而未添加ape1的dox释放率(非特异性释放率)始终低于10％。说明，si@ad@d/d对ape1有良好的响应，且在没有ape1作用时能保持良好的稳定性。
100.3.si@ad@d/d纳米粒对ape1响应的选择
101.选择细胞内常见的几种核酸内切酶做对照组，分别加入最适酶缓冲液，酶缓冲液如表2所示。
102.表2酶缓冲液
103.酶体系缓冲液ape12mm氯化镁，200mm氯化钾，0.1mg/ml牛血清白蛋白exonuclease i67mm甘氨酸-氯化钾，6.7mm氯化镁，10mm 2-巯基乙醇exonucleaseⅲ10mm二三丙烷-hcl，10mm氯化镁，1mmlambda exonuclease67mm甘氨酸-氯化钾，2.5mm氯化钾，50μg/ml牛血清白蛋白dnasei0mm tris-hcl，2.5mm氯化镁，0.5mm氯化钙t5 exonuclease50mm醋酸钾,20mm三乙酸,10mm醋酸镁1mm二硫苏糖醇t7 exonuclease50mm醋酸钾,20mm三乙酸,10mm醋酸镁1mm二硫苏糖醇
104.ape1，exonucleasei(exoi)，exonucleaseⅲ(exoⅲ)，lambda exonuclease(λexo),dnasei，t5 exonuclease(t5 exo)和t7 exonuclease(t7 exo)酶体系对应的酶终浓度分别为2u/ml，12.5u/ml，4u/ml，33u/ml，5u/ml，5u/ml，25u/ml，与终浓度50μl(1mg/ml)的si@ad@d/d纳米粒混合，加酶后测定不同时间点dox的荧光强度。参照实施例2得到的dox的标准曲线，根据溶液中dox的荧光强度来计算dox的释放率，并绘制dox释放率与时间的曲线图(ape1选择)，如图8所示。
105.图8显示，si@ad@d/d与ape1能产生最强的响应，在50min达到平台期时dox的释放率为70％，而与其他核酸内切酶反应中，dox都有不同程度的非特异性释放(未添加ape1的dox释放)，但释放率都低于30％。减去空白组释放率(10％)，si@ad@d/d对ape1反应的dox释放率是其他酶的3倍以上，说明si@ad@d/d对ape1具有良好的选择性。
106.4.ape1对底物的选择
107.本实施中1制备的dna(u)/dox复合物按照实施例1的方法与si@ad制备si@ad@d(u)/d。将si@ad@d(u)/d与实施例1制备的si@ad@d/d分别作为ape1的底物，测试ape1(ape1浓度为4u/ml)对底物的选择性。按照本实施例中1的方法测试si@ad@d(u)/d和si@ad@d/d分别在有无ape1情况下dox释放率与时间的曲线图。
108.dox释放率与时间的曲线图(底物)如图9所示，当添加ape1时，si@ad@d(u)/d的dox释放率只有23％；而si@ad@d/d能快速释放dox，释放率达到60％，约是si@ad@d(u)/d的3倍；说明ape1对含有ap位点的底物si@ad@d/d具有特异的选择性；而对于不含ap位点的底物si@ad@d(u)/d，即使与高浓度ape1反应也只使少量dox释放，在不加ape1时底物纳米粒在反应体系中比较稳定，只有约10％的非特异性释放率。
109.5.si@ad@d/d纳米粒的体外稳定性试验
110.将si@ad@d/d分别加入到1
×
pbs溶液、荷瘤裸鼠血清(serum，gibco)中，使si@ad@d/d终浓度均为0.5mg/ml，37℃下孵育2h、4h后，计算并绘制dox释放率与时间的曲线图(稳定性)，如图10所示。(由于血清中未知因素干扰，需先绘制不同浓度dox与血清混合后的荧光值对dox浓度的标准曲线，再根据标曲公式，计算si@ad@d/d在血清中释放的dox。)
111.图10显示，si@ad@d/d在pbs中孵育4h后，dox的释放率始终保持在低于10％的水平，在荷瘤裸鼠血清中孵育4h后dox释放的释放率约为20％。说明，si@ad@d/d与荷瘤裸鼠血清孵育4h后，仍能保持80％的载药率，具有良好的稳定性，进一步说明si@ad@d/d在到达靶部位之前的血液循环中能保持较好的稳定性。
112.6.细胞裂解液对si@ad@d/d的影响
113.将mcf-7细胞培养于100mm培养皿中，贴壁生长至覆盖底面积90％时，计数得细胞数目约为1
×
107个/皿。准备冰盒，将培养皿置于冰上，弃去培养基，用预冷的pbs清洗细胞3次，加入1ml ripa裂解液(thermo fisher)，用移液枪反复吹打细胞，裂解30min，全程在冰上操作。将细胞裂解液于4℃12000g离心4min，取上清得到mcf-7细胞裂解液，置于-80℃贮存。
114.取1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl上述细胞裂解液(对应的细胞数为1
×
104、2
×
104、5
×
104、10
×
104、15
×
104、20
×
104个)，与50μl的本实施例中4制备的si@ad@d(u)/d和实施例1制备的si@ad@d/d溶液反应，无酶水补至100μl。并设置只加ripa裂解液的对照组，6h后用酶标仪测定dox荧光值。mcf-7裂解细胞数目与dox释放率的曲线图如图11所示。
115.图11显示，si@ad@d/d与si@ad@d(u)/d的dox释放率都有裂解细胞数依赖性，随着裂解细胞数的增加，si@ad@d/d的dox释放速率明显大于si@ad@d(u)/d。
116.实施例4si@ad@d/d纳米粒的体外抗肿瘤作用
117.1.细胞毒性试验
118.用mtt法检测si@ad@d/d对人乳腺癌细胞(mcf-7)和人正常肝细胞(lo2)的细胞毒性：
119.(1)组别：fe3o4@sio
2-cooh(si-cooh)组、si@ad@d组、si@ad@d(u)/d组、si@ad@d/d组、dox组和pbs空白对照组，每个组设置6组平行对照；
120.(2)dox的浓度梯度：(以含有的dox浓度计)0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1μm(1mg/ml的载dox的纳米粒(np/dox)对应的dox浓度为1μm；；np/dox即si@ad@d(u)/d或si@ad@d/d)；
121.(3)细胞培养：分别利用dmem培养基(含10％胎牛血清和1％的青霉素/链霉素溶液)在100mm培养皿中培养mcf-7和lo2，每皿加8～10ml培养基，按1:4的比例三天传代一次，每次加2ml胰酶消化细胞，消化2min，当100mm培养皿中细胞覆盖底面积约90％的细胞对数生长期时，用细胞计数板计算细胞数量约为1
×
108个/皿；
122.(4)种板、给药：96孔板每孔种板数为1
×
104个，每孔加入培养基体积为100μl，贴壁培养24h后，去除培养基，每孔分别加入100μl含有各浓度si-cooh、si@ad@d、si@ad@d(u)/d、si@ad@d/d、dox的培养基，磁转染30min后继续放在培养箱培养24h；
123.(5)检测：每孔分别加入5mg/ml的mtt溶液20μl，孵育4h后吸除，再加入150μl的二甲基亚砜(dmso)溶解紫色结晶，振荡15min后在490nm的紫外波长下测定吸光度，并按照以下公式计算细胞活性：
124.细胞活性(％)＝[(实验组
od-空白组
od
)/(对照组
od-空白组
od
)]
×
100％。
[0125]
mcf-7细胞活性/对照组细胞活性为50％时的纳米颗粒的浓度为ic
50
。
[0126]
(6)结果：不同浓度纳米粒对mcf-7细胞活性影响结果如图12所示，图12显示，各纳米粒和游离dox的细胞毒性都表现出浓度依赖性，且没有显著性差异(p》0.05)。相比于si@ad@d(u)/d纳米粒，si@ad@d/d纳米粒(ic
50
＝0.5421μm)表现出更显著的细胞毒性(p《0.01)，而不含ap-dna的si@ad@d(u)/d纳米粒(ic
50
＝5.178μm)，不能对ape1响应，无法释放dox。对于不载药的si@ad@d和磁性纳米粒(si-cooh)都没有细胞毒性，与si@ad@d/d相比具有显著性差异(p《0.001)。
[0127]
不同浓度纳米粒对lo2细胞活性影响结果如图13所示，图13显示，游离dox对lo2细胞的毒性同样表现出浓度依赖性，而si@ad@d/d对lo2细胞作用后依然有87％的细胞活力，其细胞毒性与游离dox相比具有显著性差异(p《0.001)，与mcf-7细胞相比，lo2细胞ape1表达量较低，不能对纳米粒上的ap位点产生足够的响应。
[0128]
结果表明si@ad@d/d能选择性抑制mcf-7细胞活性，对lo2细胞没有明显毒性；没有负载dox的si@ad@d和si-cooh对lo2细胞同样没有明显毒性，与si@ad@d/d相比没有显著性差异(p》0.05)。
[0129]
2.细胞凋亡试验
[0130]
采用annexinv-fitc/pi凋亡检测法测试si@ad@d/d纳米粒对mcf-7细胞的凋亡的影响。
[0131]
(1)分组：培养细胞(步骤同本实施例中的1)，以2
×
105个/孔的细胞数接种到12孔板中，贴壁培养24h后随机分为control组、si@ad@d/d组、si@ad@d(u)/d组、si@ad@d组，双阴组，pi组，fitc组；
[0132]
(2)给药：每组细胞用pbs洗涤两次后，si@ad@d/d组、si@ad@d(u)/d组与si@ad@d组加入对应纳米粒的培养基，给药浓度本实施例1中计算得到的si@ad@d/d的ic
50
值0.54μm，给药后磁转染30min后继续孵育4h；
[0133]
(3)洗涤：孵育结束后吸除培养基，用pbs洗涤细胞2次；
[0134]
(4)染色：最后一次洗涤完毕后弃去pbs上清液，每管分别加入100μl的binding buffer重悬细胞，control组、si@ad@d/d组、si@ad@d(u)/d组与si@ad@d组分别加入1μlannexin v-fitc和1μlpropidium iodide，混匀，双阴组不加染料，pi组只加1μlpropidium iodide、fitc组只加1μlannexin v-fitc；轻微涡旋混匀，室温避光反应15min后放置于冰盒中避光待测；
[0135]
(5)检测：使用流式细胞仪检测，设定进样细胞数上限为1
×
104个，根据双阴组确定门的位置，pi组和fitc组用于调节荧光补偿。
[0136]
(6)结果：mcf-7细胞的流式凋亡图如图14中a所示，根据凋亡图计算总凋亡率。不同纳米粒的总凋亡率如图14中b；图14显示，dox对mcf-7细胞的总凋亡率为48.2％(早期凋亡27.8％，晚期凋亡20.4％)，si@ad@d/d对mcf-7细胞的总凋亡率为43％(早期凋亡18.4％，晚期凋亡24.6％)，两者之间没有显著性差异(p》0.05)。si@ad@d(u)/d组总凋亡率为8.45％，与si@ad@d/d组相比具有显著性差异(p《0.01)。
[0137]
纳米材料si@ad@d/d具有良好的安全性，si@ad@d/d能在ape1高表达的肿瘤细胞中释放dox，发挥细胞凋亡作用，而对正常细胞几乎没有毒性。
[0138]
3.活死细胞染色试验
[0139]
用钙黄绿素(绿色)和碘化丙啶(红色)对给药后的mcf-7细胞进行染色。绿色代表活细胞，红色代表死细胞，测试si@ad@d/d等纳米粒的体外抗肿瘤作用，具体步骤如下：
[0140]
(1)分组：培养细胞(步骤同本实施例中的1)，按4
×
105个/皿的细胞数量接种于激光共聚焦培养皿，随机分为control组、si-cooh组、si@ad@d(u)/d组、si@ad@d/d和dox组，接种时，为避免拍照时细胞密度过大，培养皿中间凹槽部位应尽可能种匀。贴壁培养24h后吸除培养基，用pbs洗涤细胞2次。
[0141]
(2)给药：分别加入含终浓度为0.54μm(以所含dox终浓度计)的si@ad@d(u)/d、si@ad@d/d、dox的培养基以及含终浓度为0.5mg/ml的si-cooh的培养基，磁转染30min后，继续孵育24h。
[0142]
(3)染色：孵育结束后吸除培养基，用pbs洗涤细胞2次，每孔加入500μl配制好的calcein am/pi检测工作液，避光孵育30min，孵育结束后直接在激光共聚焦下观察拍照。
[0143]
(4)结果：mcf-7活死细胞染色图如图15所示，与其他组相比，游离dox组与si@ad@d/d组的红色区域面积最大，说明死细胞数量最多，而control组与si-cooh组几乎没有红点，si@ad@d(u)/d组只有少量红点，说明si@ad@d/d具有同dox相近的体外抗肿瘤作用。
[0144]
4.细胞摄取试验
[0145]
通过使用激光共聚焦扫描显微镜(clsm)观察mcf-7和lo2细胞对si@ad@d/d对的摄取，以及细胞内dox的释放。
[0146]
(1)分组：si@ad@d/d组(mcf-7/lo2)，si@ad@d(u)/d组，si@ad@d/d+nca抑制剂组(7-硝基吲哚-2-羧酸)、dox组，si@ad@d(fam)组。
[0147]
(2)种板、给药：培养细胞，激光共聚焦培养皿每皿接种1
×
105细胞，贴壁培养24h后，除去培养基并用pbs清洗两次后，分别加入含终浓度0.54μm(以所含dox终浓度计)的si@ad@d/d、si@ad@d(u)/d、dox、si@ad@d(fam)和si@ad@d/d+nca的培养基，磁转染30min后：
[0148]
①
si@ad@d/d组继续孵育：60min、90min、120min、12h、24h。
[0149]
②
si@ad@d(u)/d组继续孵育：60min、90min、120min。
[0150]
③
dox组继续孵育：60min、90min、120min。
[0151]
④
si@ad@d/d+nca抑制剂组：每孔加入含终浓度5μm nca的培养基中孵育；2h，除去培养基再加入含si@ad@d/d的培养基，磁转染30min后继续孵育60min、90min、120min。
[0152]
⑤
si@ad@d(fam)组继续孵育：60min、90min、120min。
[0153]
(3)染色：给药结束后，除去含药培养基，用pbs洗涤3次。每皿加入200μl多聚甲醛固定细胞15min后，再用1
×
pbs洗涤3次，5min/次，每孔加入100μl的1
×
pbs稀释至5μg/ml细胞核染料hoechst33342，室温避光孵育10min，再用1
×
pbs洗涤3次，5min/次，去除pbs后，每孔滴常温的抗荧光淬灭封片剂或者甘油与pbs体积比1:1的混合液，覆盖底部。
[0154]
(4)拍照：激光共聚焦扫描显微镜先找到细胞，再切换至40倍镜观察，选取染料相应的通道，将细胞核染料通道颜色改为深蓝色、fam通道改为绿色、dox通道改为红色，并在细胞核通道添加明场通道。
[0155]
(5)结果：
[0156]
①
mcf-7细胞对si@ad@d(fam)的摄取结果如图16中a所示，将si@ad@d(fam)与mcf-7细胞共孵育，发现fam绿色荧光随时间逐渐增强；将荧光扫描峰图的峰面积通过积分换算为荧光强度值。fam的荧光强度如图16中b所示，fam的荧光强度随时间逐渐增强，说明si@
ad@d(fam)确实能在mcf-7细胞内被ape1水解，使fam基团摆脱bhq淬灭基团而释放绿色荧光，说明ap-dna在磁性纳米粒si@ad上成功连接，mcf-7细胞内的fam荧光释放，是ape1对si@ad@d(fam)作用的结果。
[0157]
②
mcf-7与lo2细胞对纳米粒的摄取结果如图17所示，在mcf-7细胞中孵育2h后，相比于ape1酶抑制剂7-硝基吲哚-2-羧酸(nca)组，si@ad@d/d在细胞内能释放出显著的红色荧光(p《0.05)，而与si@ad@d(u)/d组无显著性差异(p》0.05)。在相同条件下，lo2细胞摄取si@ad@d/d后，细胞内只观察到微弱的红色荧光，与nca组无显著差异(p》0.05)。说明，si@ad@d/d在ape1水平较低的正常细胞内，无法或者极少量释放dox，可以避免对正常细胞的“误伤”。
[0158]
③
mcf-7对si@ad@d/d的摄取结果如图18中a所示，12h后能观察到si@ad@d/d在细胞内释放的dox进入了细胞核，继而发挥抗肿瘤作用。各组细胞内dox荧光强度如图18中b所示，12h(p《0.05)与24h(p《0.001)的荧光强度相比于2h有显著增加。si@ad@d/d的药物dox释放取决于细胞内的ape1，由于细胞内ape1的表达差异，si@ad@d/d能在ape1表达更高的肿瘤细胞中选择性释放更多dox，从而能抑制肿瘤的生长。
[0159]
实施例5si@ad@d/d纳米粒的体内抗肿瘤作用
[0160]
1.si@ad@d/d纳米粒的抗肿瘤作用
[0161]
(1)细胞培养：根据裸鼠数量计算需要接种的细胞数，每只裸鼠接种mcf-7细胞1
×
107个。培养细胞(步骤同实施例4中的1)，覆盖皿底面积90％时进行传代扩增，并计算细胞数约1
×
107个/皿。培养细胞时加20ml dmem培养基(同实施例4)，消化细胞时，加4ml胰酶孵育3min。
[0162]
(2)细胞接种：用dmfm培养基或pbs将收集的细胞稀释至浓度1
×
108个/ml，选用4-6周龄的裸鼠，在裸鼠腋窝皮下注射100μl。由于细胞浓度高，每次注射或从离心管中吸取细胞前，应弹匀细胞悬液，避免因注射浓度差异导致肿瘤生长大小不同。
[0163]
(3)肿瘤模型评估：隔天记录裸鼠体重并观察肿瘤生长情况，一周后待注射部位有肉红色凸起，且体积生长迅速时，可判定为建模成功，如果一直是白色小点或白色硬块，考虑继续培养细胞。
[0164]
(4)肿瘤模型分组：当肿瘤生长至100mm3时，随机将裸鼠分为6组：生理盐水组、si@ad@d(u)/d组、si@ad@d(u)/d+磁铁(m)组、dox组、si@ad@d/d组、si@ad@d/d+磁铁(m)组，接种后隔天记录肿瘤大小和裸鼠体重。
[0165]
(5)肿瘤靶向治疗：根据裸鼠体重，按阿霉素(dox)1mg/kg作为每次的给药剂量，每次尾静脉注射100μl，三天给药一次，给药2周，每次注射后在肿瘤部位固定磁铁4h。通过对肿瘤组织tunel染色，可以进一步评估纳米粒的抗肿瘤效果。
[0166]
(6)结果
[0167]
①
治疗14天后，代表性离体肿瘤图如图19所示，dox组与si@ad@d/d+磁铁(m)组，对肿瘤的抑制作用最强，si@ad@d/d+磁铁(m)组比只依赖epr效应的si@ad@d/d组有明显更强的肿瘤抑制作用；而si@ad@d(u)/d+磁铁(m)组与si@ad@d(u)/d组的肿瘤抑制作用较弱，而且没有表现出明显的差异；生理盐水组也未表现明显的肿瘤成生长抑制，该组第14天时肿瘤体积增加至约1000mm3，约是si@ad@d/d+磁组的5倍。而si@ad@d/d组与si@ad@d/d+磁铁(m)组的肿瘤抑制作用分别要比si@ad@d(u)/d组与si@ad@d(u)/d+磁(m)组强得多，说明ap
位点和磁靶向作用是si@ad@d/d纳米粒发挥抗肿瘤作用的关键因素。
[0168]
虽然dox组表现出较强的肿瘤抑制作用，但治疗结束后肿瘤体积仍然是si@ad@d/d+磁(m)组的2倍左右，与si@ad@d/d组有显著差异(p《0.01)。
[0169]
②
肿瘤生长曲线如图20中a所示，加磁铁组要比不加磁组有更强的肿瘤生长抑制作用，说明纳米粒能在体外磁力作用下靶向至肿瘤部位，发挥更好的精准抗肿瘤作用。裸鼠体重相对变化率如图20中b所示，相比于生理盐水组，游离dox组在治疗结束后体重明显下降，在治疗第10天时体重下降了约8％(p《0.001)，而其他组均没有表现出明显的体重下降，说明虽然dox在一定程度上能有效抑制肿瘤生长，但其存在严重的毒副作用。
[0170]
③
tunel法检测细胞凋亡的荧光图如图21所示，蓝色为细胞核，绿色为凋亡细胞。si@ad@d/d+m组可观察到最大面积的绿色荧光，其次是游离dox组。由于epr效应，其他组在肿瘤部位也会有一定的积累，表现出轻微的细胞毒性而出现小面积的绿色荧光。
[0171]
④
肿瘤组织h&e染色图如图22，红色箭头指示的是细胞凋亡或细胞坏死区域，si@ad@d/d+m组的肿瘤组织中可观察到最大的组织坏死区域，生理盐水组的肿瘤细胞没有观察到明显的损坏，都有完整的细胞形态和细胞核，实验结果与tunel染色结果基本一致。再次说明si@ad@d/d纳米粒作为靶向递药系统对肿瘤具有优越的抑制作用。
[0172]
2.纳米粒的肿瘤靶向性测试
[0173]
用近红外染料ir800标记磁性纳米粒si@ad，具体步骤如下：
[0174]
(1)样品制备：将50μl终浓度为1mg/ml的ir800-nhs加入到500μl终浓度为1mg/ml的si@ad中，并加入10μg edc震荡反应12h，磁分离后即得修饰有荧光基团的磁性纳米粒si@ad@ir800。
[0175]
(2)分组：选取肿瘤生长到100mm3左右的裸鼠，随机分为游离ir800组、si@ad@ir800组、si@ad@ir800+磁铁组。给药同本实施例中1(5)。在上机拍照前，先腹腔注射4％水合氯醛麻醉裸鼠，以0.1ml/10g计算注射体积，待裸鼠不能自主翻身时，放置于活体成像仪内观察。
[0176]
(3)观察并采集荧光照片：设定好激发与发射波长，在尾静脉注射给药前先拍一次，然后分别在给药4h、8h、12h、24h和36h拍照。收集心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，分组按顺序摆好后，用同样的方法观察纳米粒在各器官中的荧光分布并拍照。采集各组裸鼠的主要器官与肿瘤进行体外荧光成像分析。
[0177]
(4)结果：
[0178]
①
纳米粒在裸鼠体内的荧光成像图如图23所示，在尾静脉注射前(0h)，裸鼠体内没有检测到任何荧光，说明在本实施例激发和发射波长下，裸鼠体内没有干扰ir900检测的物质。注射并磁力作用4h后，游离ir800组和si@ad@ir800组裸鼠的全身都有较强的荧光分布，肝脏部位比较集中；而si@ad@ir800+磁铁组的荧光全身的分布相对较弱，而在肿瘤部位有很强的荧光，说明4h的磁力作用能使纳米粒主要聚集在肿瘤部位。随着时间的推移，各组全身的荧光强度都明显降低。在注射12h后，游离ir800组和si@ad@ir800组在肝脏部位的荧光依旧较强，其次是肿瘤部位，但随着时间推移，各组肿瘤部位的荧光也逐渐降低。而si@ad@ir800+磁铁组在肿瘤部位的荧光强度依然非常强，直到30h后，也没有明显的减弱趋势，表明纳米粒受到磁响应后，会在肿瘤部位大量积累。
[0179]
②
纳米粒在主要脏器中的荧光成像图如图24中a所示，荧光强度图如图24中b所
示。si@ad@ir800+磁铁组在肿瘤部位的荧光大约是游离ir800组6倍(p《0.001)，约是si@ad@ir800组的2.5倍(p《0.001)，表明磁靶向的靶向效率要显著高于被动靶向，且能减少纳米粒在其他器官中的滞留。而si@ad@ir800组与游离ir800组的荧光主要集中在肝脏与肾脏中，在肿瘤部位的荧光明显显著低于si@ad@ir800+磁铁组，与体内成像的结果基本一致。
[0180]
3.纳米粒的体内分布测试
[0181]
利用si@ad@d/d纳米粒治疗结束后，取主要脏器与肿瘤，分别称取15mg置于圆底烧瓶，加入5ml hno3和1ml 30％的h2o2溶液。加热至200℃，使混合物挥发至1ml左右，如此反复直至完全消解。再将消解液转移到离心管中，用质量分数为2％的hno3溶液定容至10ml，进行电感耦合等离子体质谱(icp-ms)分析，上样前先用标准铁溶液绘制标准曲线，根据标曲公式计算铁含量。
[0182]
纳米粒在主要脏器的分布图如图25，铁元素在加磁组与不加磁组肝脏(p《0.01)和脾脏(p《0.05)的积累有显著差异，而铁元素在加磁组肿瘤部位的积累约是不加磁si@ad@d/d组的3倍多(p《0.01)。说明，虽然该si@ad@d/d纳米粒不能在体内被降解，但在磁力作用下，能大大减少在其他部位的滞留；磁导航能更好的将该纳米粒靶向至靶部位，提高药物递送效率，提高治疗效果。
[0183]
4.纳米粒的体内安全性测试
[0184]
(1)裸鼠主要器官病理切片分析
[0185]
对裸鼠主要器官石蜡切片进行h&e染色，通过观察裸鼠内脏有无病理损伤以评估纳米粒的安全性。主要脏器h&e染色图如图26所示，其中a为生理盐水组，b为si@ad@d(u)/d组；c为si@ad@d(u)/d+磁组；d为dox组；e为si@ad@d/d组；f为si@ad@d/d+磁组。各组内脏均没有表现出明显的病理损伤，对于dox组，虽然前述结果显示dox组小鼠体重有明显下降趋势，但心脏毒性表现不明显，没有观察到心肌细胞明显坏死的病理症状。对于其他对照组，细胞形态和结构都比较完整，没有观察到病变部位。说明表明，si@ad@d/d纳米粒具有良好的安全性，对各脏器不产生毒性，
[0186]
(2)si@ad@d/d纳米粒对裸鼠肝肾功能的影响
[0187]
收集各组裸鼠血清，利用相应试剂盒对血清中肝(alt、ast)肾(crea、bun)功能相关的生化指标进行分析，血清生化指标的测试结果如图27所示，其中a为生理盐水组，b为si@ad@d(u)/d组；c为si@ad@d(u)/d+磁组；d为dox组；e为si@ad@d/d组；f为si@ad@d/d+磁组。各组指标结果都在正常范围内，且无明显差异，表明该si@ad@d/d纳米粒不影响肝肾生理功能，对肝肾组织没有毒副作用，具有良好的生物安全性。
[0188]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种ape1响应型靶向药物递送载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.将药物溶液与双链结构的ap-dna溶液混合，室温避光孵育0.5～1.5h，制备得到载药ap-dna复合物；s2.将步骤s1制备得到的载药ap-dna复合物与亲和素修饰的磁性纳米材料的溶液混合，室温充分反应，洗涤，即得ape1响应型靶向药物递送载体。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤s1中所述药物溶液与双链结构的ap-dna溶液以摩尔比为25：1～6混合。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，步骤s1中所述药物溶液与双链结构的ap-dna溶液以摩尔比为25：1～5混合。4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤s1中所述药物溶液与双链结构的ap-dna溶液以摩尔比为25：5混合。5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤s1中所述双链结构的ap-dna包括第一单链和第二单链，所述第一单链或第二单链的序列长度为30～100bp。6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述步骤s1中药物溶液中的药物为阿霉素或铂类药物。7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述药物溶液中的药物为阿霉素。8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤s2中所述亲和素修饰的磁性纳米材料为亲和素修饰的羧基二氧化硅四氧化三铁。9.利用权利要求1～8任一所述制备方法制备得到的ape1响应型靶向药物递送载体。10.权利要求9所述ape1响应型靶向药物递送载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术总结本发明公开了一种APE1响应型靶向药物递送载体及其制备方法和应用，所述制备方法包括以下步骤：S1.将药物溶液与双链结构的AP-DNA溶液混合，室温避光孵育0.5～1.5h，制备得到载药AP-DNA复合物；S2.将步骤S1制备得到的载药AP-DNA复合物与亲和素修饰的磁性纳米材料的溶液混合，室温充分反应，洗涤，即得。利用本发明的制备方法制备的APE1响应型靶向药物递送载体，将APE1作为触发纳米载体的释药“开关”，纳米粒进入肿瘤细胞后迅速被APE1特异性识别并切割，实现协同靶向递送药物；同时能够通过磁靶向准确、主动靶向肿瘤组织，提高药物在肿瘤部位的富集效率，增强药物的治疗效果，降低毒副作用。毒副作用。毒副作用。
技术研发人员：翟筠秋 彭卓 梁光忠 宁科妮
受保护的技术使用者：广州中医药大学（广州中医药研究院）
技术研发日：2022.06.17
技术公布日：2022/11/1
