用于生产3-羟基己二酸和/或
α-氢化己二烯二酸的基因修饰微生物以及该化学品的制造方法
技术领域
1.本发明涉及高产3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的基因修饰微生物、以及使用了该基因修饰微生物的3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的制造方法。
背景技术：2.3-羟基己二酸(iupac名：3-羟基己二酸(3-hydroxyhexanedioic acid))以及α-氢化己二烯二酸(iupac名：(e)-己-2-烯二酸((e)-hex-2-enedioic acid))是碳原子数为6的二羧酸。它们可以用作与多元醇聚合而形成聚酯，或与多元胺聚合而形成聚酰胺的原料。另外，也可以使用通过在它们的末端加成氨而内酰胺化的化合物作为聚酰胺的原料。
3.作为与利用了微生物的碳原子数为6的二羧酸的制造有关的文献，在专利文献1中记载了使用多肽的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和/或己二酸的制造方法，其中多肽对于从3-氧代己二酰-coa向3-羟基己二酰-coa的还原反应显示出优异的催化活性，作为这些物质的生物合成路径，记载了经由将3-氧代己二酰-coa还原为3-羟基己二酰-coa的酶反应。另外，专利文献1中修饰的基因均限于细胞内的上述生物合成路径上的反应，没有关于3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和/或己二酸向细胞外输送的记载。
4.另外，专利文献2中记载了二羧酸的制造方法，其中使用了使二羧酸排出载体基因yjjp、yjjb、yeea及ynfm的表达量增大的细菌，作为碳原子数为4的二羧酸，示例了琥珀酸，作为碳原子数为6的二羧酸，示例了己二酸。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：ep 3719121 a1
8.专利文献2：日本特开2017-216881号公报
技术实现要素：9.发明所要解决的课题
10.本发明的目的在于提供以导入3-氧代己二酰-coa还原酶基因、或增强该基因的表达而强化了该酶活性的基因修饰微生物为基础，通过进一步修饰二羧酸排出载体，从而用于以高产率制造3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的基因修饰微生物、以及使用了该修饰微生物的物质制造方法。
11.用于解决课题的手段
12.本发明人为了实现上述目的而进行了深入研究，结果发现，与常规技术的预想相反，使二羧酸排出载体的功能缺损或降低了的基因修饰微生物具有3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的优异的生产能力，从而完成了本发明。
13.即，本发明提供了以下内容。
14.(1)一种基因修饰微生物，具有制造3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的能
力，并且强化了对将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的反应进行催化的酶的活性，其中所述基因修饰微生物使二羧酸排出载体的功能缺损或降低。
15.(2)根据(1)所述的基因修饰微生物，其中所述二羧酸排出载体的功能的缺损或降低是由yjjp或其同源物和/或yjjb或其同源物的功能的缺损或降低引起的。
16.(3)根据(2)所述的基因修饰微生物，其中yjjp基因或其同源基因和/或yjjb基因或其同源基因发生破坏或缺损。
17.(4)根据(1)所述的基因修饰微生物，其中所述二羧酸排出载体的功能的缺损或降低是由yeea或其同源物和/或ynfm或其同源物的功能的缺损或降低引起的。
18.(5)根据(4)所述的基因修饰微生物，其中yeea基因或其同源基因和/或ynfm基因或其同源基因发生破坏或缺损。
19.(6)根据(1)～(5)中任1项所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是属于大肠杆菌(escherichia)属或沙雷氏菌(serratia)属的微生物。
20.(7)根据(1)～(6)中任1项所述的基因修饰微生物，其中导入有对将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的反应进行催化的酶进行编码的基因。
21.(8)一种3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的制造方法，包括对(1)～(7)中任1项所述的基因修饰微生物进行培养的工序。
22.发明的效果
23.与未修饰二羧酸排出载体基因的亲株微生物相比，所述基因修饰微生物能够以高产率生产3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸。
具体实施方式
24.以下，在本说明书中，有时将3-羟基己二酸缩写为3ha，将α-氢化己二烯二酸缩写为hma。另外，有时将3-氧代己二酰-coa缩写为3oa-coa，将3-羟基己二酰-coa缩写为3ha-coa，将2,3-脱氢己二酰-coa缩写为hma-coa。另外，有时将对将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的反应进行催化的酶记载为“3-氧代己二酰-coa还原酶”。另外，在单一启动子的存在下yjjp和yjjb基因形成操纵子的情况下有时记载为yjjpb。另外，有时将yjjp和yjjb基因所编码的蛋白质分别记载为yjjp和yjjb，将它们的复合体记载为yjjpb。另外，有时将yeea基因所编码的蛋白质记载为yeea，将ynfm基因所编码的蛋白质记载为ynfm。
25.本发明的微生物的基因被修饰使得二羧酸排出载体的功能缺损或降低。使二羧酸排出载体的功能缺损或降低是指使二羧酸排出活性缺损或降低。对于使功能缺损或降低的方法没有特别地限定，例如可以通过以下方法进行：向二羧酸排出载体基因或其同源基因(以下将它们统称为“二羧酸排出载体基因”)或者该基因的启动子或终止子区域的碱基序列导入基因变异剂、进行紫外线照射等基因变异处理；通过部位特异性变异法等对碱基序列的一部分或全部进行缺损处理；向碱基序列导入移码突变；通过向碱基序列插入终止密码子等使基因破坏或缺损。另外，也可以通过使用基因重组技术除去二羧酸排出基因的碱基序列或该基因的启动子或终止子区域的碱基序列的全部或一部分，或者与其他碱基序列置换，从而进行基因的破坏或缺损。其中优选使二羧酸排出载体基因的碱基序列的一部分或整体缺损的方法。
26.在本发明中，使功能缺损或降低的对象二羧酸排出载体基因可以通过以下方式容
易地取得：例如，将公知的二羧酸排出载体的氨基酸序列作为查询序列，在ncbi(national center for biotechnology information)和kegg(kyoto encyclopedia of genes and genomes)等公开数据库上进行blast(basic local alignment search tool)检索，并参照对合适序列进行编码的基因。另外，也可以将基于公知的二羧酸排出载体基因的碱基序列而制作的寡核苷酸作为引物，通过在模板中使用其他生物的基因组dna的pcr来获得。
27.公知的二羧酸排出载体与该载体的同源物的蛋白质之间的氨基酸序列同源性具体为50％以上、优选为70％以上、更优选为80％以上、进一步优选为90％以上、特别优选为95％以上。
28.需要说明的是，在本发明中，“序列同源性”是指在2个氨基酸序列或碱基序列中导入间隔(gap)或不导入间隔而排列的情况下的最佳比对(alignment)中，相同氨基酸或碱基相对于重叠(overlap)的所有氨基酸序列(包括作为翻译起始点的氨基酸)或碱基序列(包括起始密码子)的比例(百分比)，根据式(1)计算。在式(1)中，比较短的一者的序列长度为100个氨基酸或300个碱基以上，在小于100个氨基酸或300个碱基的情况下不定义为序列同源性。序列同源性例如可以使用blast中的默认参数来容易地查看。另外，序列同源性也可以使用genetyx等软件所携带的相同功能来查看。
29.序列同源性(％)＝一致数(间隔彼此不计数)/较短的序列长度(不包括两端间隔的长度)
×
100
···
式(1)。
30.在本发明中，使功能缺损或降低的对象二羧酸排出载体优选为yjjp或其同源物、yjjb或其同源物、yeea或其同源物、和/或ynfm或其同源物。
31.yjjp和yjjb是推测为putative succinate exporter的蛋白质，具体而言，可以列举出：来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的yjjp(ncbi proteinid:np_418784，序列号2)及yjjb(ncbi proteinid:np_418783，序列号4)、来自serratia grimesii nbrc13537株的yjjp同源物(序列号6)、yjjb同源物(序列号8)，作为编码这些蛋白质的基因，可以列举出：来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的yjjp(ncbi geneid:948812，序列号1)及yjjb(ncbi geneid:948811，序列号3)、来自serratia grimesii nbrc13537株的yjjp同源物(序列号5)、yjjb同源物(序列号7)。需要说明的是，根据上述式(1)，当使用genetyx的功能(％identity matrix)计算序列号2和6的氨基酸序列间的序列同源性时，为71.1％。另外，当计算序列号4和8的氨基酸序列间的序列同源性时，为75.8％。
32.已知yjjp和yjjb在二者共存下具有二羧酸排出活性(biosci biotechnol biochem 2017sep；81(9)：1837-1844)。特别是在日本特开2017-216881号公报中，记载了：通过以使得作为二羧酸排出载体基因的yjjp和yjjb的表达增大的方式修饰细菌，可以提高该细菌的二羧酸生产能力。另外，作为所生产的二羧酸，记载了碳原子数为4的琥珀酸、碳原子数为6的己二酸等。此外，记载了来自作为肠道细菌科(enterobacteriaceae)的大肠杆菌(escherichia coli)和产气肠杆菌(enterobactr aerogenes)的yjjp和yjjb实际上具有二羧酸排出活性。因此，本领域技术人员认为，在具有制造碳原子数为6的二羧酸的能力的微生物中使二羧酸排出活性缺损或降低的情况下，该微生物的碳原子数为6的二羧酸的生产能力预计会降低。但是，如本技术说明书的实施例所示的那样，通过使yjjp和yjjb的功能缺损，作为碳原子数为6的二羧酸的3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的生产能力提高，在具有制造3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的能力的微生物中使二羧酸排出活性缺
损或降低的情况下，与本领域技术人员的预想相反，可以提高3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的生产能力。
33.yeea是推测为putative transporter的蛋白质，具体而言，可以列举出来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的yeea(ncbi proteinid:np_416512，序列号91)，作为编码这些蛋白质的基因，可以列举出来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的yeea(ncbi geneid:946545，序列号90)。
34.ynfm是推测为putative membrane transport protein的蛋白质，具体而言，可以列举出来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的ynfm(ncbi proteinid:np_416113，序列号93)，作为编码这些蛋白质的基因，可以列举出来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的ynfm(ncbi geneid:946138，序列号92)。
35.已知yeea和ynfm具有二羧酸排出活性(biosci biotechnol biochem 2017sep；81(9)：1837-1844)。特别是在日本特开2017-216881号公报中，记载了：通过以使得作为二羧酸排出载体基因的yeea或ynfm的表达增大的方式修饰细菌，可以提高该细菌的二羧酸生产能力。另外，作为所生产的二羧酸，记载了碳原子数为4的琥珀酸、碳原子数为6的己二酸等。此外，记载了来自作为肠道细菌科(enterobacteriaceae)的菠萝泛菌(pantoea ananatis)和产气肠杆菌(enterobactr aerogenes)的yeea和ynfm实际上具有二羧酸排出活性。因此，本领域技术人员认为，在具有制造碳原子数为6的二羧酸的能力的微生物中使二羧酸排出活性缺损或降低的情况下，该微生物的碳原子数为6的二羧酸的生产能力预计会降低。但是，如本技术说明书的实施例所示的那样，通过使yeea和ynfm的功能缺损，作为碳原子数为6的二羧酸的3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的生产能力提高，在具有制造3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的能力的微生物中使二羧酸排出活性缺损或降低的情况下，与本领域技术人员的预想相反，可以提高3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的生产能力。
36.在本发明中，优选的是，使功能缺损或降低的对象yjjp的同源物、yjjb的同源物、yeea的同源物或ynfm的同源物具有琥珀酸的排出活性。例如，可以通过将上述同源基因导入到具有琥珀酸生产能力的escherichia coli afp184株(wo2005/116227号)中并验证琥珀酸生产性提高的情况来查明上述蛋白质具有琥珀酸排出活性。
37.在本发明中，作为强化对将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的反应进行催化的酶(3-氧代己二酰-coa还原酶)的活性的方法，可以将编码这些酶的基因导入到宿主微生物中，或者增加该基因的拷贝数、或者对该基因的编码区域上游的启动子区域或核糖体结合序列进行修饰的方法等。这些方法可以单独进行，也可以组合进行。对导入基因的方法没有特别地限定，可以使用将该基因组装到在微生物内可自体复制的表达载体中并导入至宿主微生物中的方法、或者将该基因组装在微生物的基因组中的方法等。
38.导入的基因可以是1种也可以是多种。另外，也可以使基因的导入和表达的增强组合起来。
39.在本发明中，将编码所表达的酶的基因组装在表达载体或宿主微生物基因组中时，该表达载体或基因组组装用核酸优选由启动子、核糖体结合序列、基因的编码区域、转录终止序列构成。另外，也可以包含控制启动子活性的基因。
40.本发明中所使用的启动子只要是可以在宿主微生物中表达酶即可，没有特别地限
定，例如可以列举出gap启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、t7启动子等。
41.在本发明中，进行基因的导入和表达的增强时所使用的表达载体只要在该微生物中可自体复制即可，没有特别地限定，例如可以列举出pbbr1mcs载体、pbr322载体、pmw载体、pet载体、prsf载体、pcdf载体、pacyc载体、以及上述载体的衍生型等。
42.在本发明中，在使用基因组组装用核酸进行基因的导入或表达的增强的情况下，使用位点特异性同源重组来导入。对位点同源重组的方法没有特别地限定，例如可以列举出：使用λred重组酶和flp重组酶的方法(proc nati acad sci usa.2000jun 6；97(12):6640-6645.)；使用λred重组酶和sacb基因的方法(biosci biotechnol biochem.2007dec；71(12):2905-11.)。
43.表达载体或基因组组装用核酸的导入方法只要是将核酸导入到微生物中的方法即可，没有特别地限定，例如可以列举出：钙离子法(journal of molecular biology,53,159(1970))；电穿孔法(nm calvin，pc hanawalt.j.bacteriol,170(1988),pp.2796-2801)等。
44.下述反应路线1示出了用于生产3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸所需的反应路径的一个例子。这里，反应a表示从乙酰-coa和琥珀酰-coa生成3-氧代己二酰-coa和辅酶a的反应。反应b表示还原3-氧代己二酰-coa生成3-羟基己二酰-coa的反应。反应c表示从3-羟基己二酰-coa生成2,3-脱氢己二酰-coa的反应。反应d表示从3-羟基己二酰-coa生成3-羟基己二酸的反应。反应e表示从2,3-脱氢己二酰-coa生成α-氢化己二烯二酸的反应。
45.[化学式1]
[0046][0047]
在微生物具有制造3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的能力的情况下，在上述反应路线1所示的生物合成路径中，至少已知具有催化反应a的酶(wo2019/107516号、日本特表2013-535203号公报、美国专利申请公开第2011/0124911a1号说明书)。
[0048]
关于从3-氧代己二酰coa生成3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸的反应，优选具有反应路线1所示的生物合成路径。即，在本发明的基因修饰微生物具有制造3-羟基己二酸的能力的情况下，作为基因修饰微生物的宿主微生物，优选具有从乙酰-coa和琥珀酰-coa生成3-氧代己二酰-coa和辅酶a(反应a)的能力、还原3-氧代己二酰-coa生成3-羟基己二酰-coa(反应b)的能力、从3-羟基己二酰-coa生成3-羟基己二酸(反应d)的能力。另外，在本发明的基因修饰微生物具有制造α-氢化己二烯二酸的能力的情况下，作为基因修饰微生物的宿主微生物，优选具有从乙酰-coa和琥珀酰-coa生成3-氧代己二酰-coa和辅酶a(反应a)的能力、还原3-氧代己二酰-coa生成3-羟基己二酰-coa(反应b)的能力、从3-羟基己二酰-coa生成2,3-脱氢己二酰-coa(反应c)的能力、从2,3-脱氢己二酰-coa生成α-氢化己二烯二酸
(反应e)的能力。
[0049]
只要具有这些生物合成路径的微生物相对于宿主微生物使yjjp或其同源物、yjjb或其同源物、yeea或其同源物和/或ynfm或其同源物的功能缺损或降低、并且强化对将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的反应进行催化的酶的活性，则可以得到高产3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的基因修饰微生物。
[0050]
作为本身具有制造3-羟基己二酸的能力的微生物，可以列举出以下的微生物。
[0051]
弗格森埃希氏菌(escherichia fergusonii)、大肠杆菌(escherichia coli)等大肠杆菌属。
[0052]
格氏沙雷氏菌(serratia grimesii)、无花果沙雷氏菌(serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(serratia fonticola)、气味沙雷氏菌(serratia odorifera)、普利茅斯沙雷氏菌(serratia plymuthica)、嗜虫沙雷氏菌(serratia entomophila)或嗜线虫沙雷氏菌(serratia nematodiphila)等沙雷氏菌属。
[0053]
绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、产氮假单胞菌(pseudomonas azotoformans)、绿针假单胞菌产金色亚种(pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens)等假单胞菌属。
[0054]
蜂房哈夫尼菌(hafnia alvei)等哈夫尼菌属。
[0055]
嗜乙酰乙酸棒杆菌(corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium acetoglutamicum)、产氨棒杆菌(corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)等棒状杆菌属。
[0056]
栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)、巨大芽孢杆菌(bacillus magaterium)、玫瑰芽孢杆菌(bacillus roseus)等芽孢杆菌属。
[0057]
酒红链霉菌(streptomyces vinaceus)、卡纳塔链霉菌(streptomyces karnatakensis)、橄榄色链霉菌(streptomyces olivaceus)等链霉菌属。
[0058]
耐金属贪铜菌(cupriavidus metallidurans)、钩虫贪铜菌(cupriavidus necator)、草酸盐贪铜菌(cupriavidus oxalaticus)等贪铜菌属。
[0059]
贝氏不动杆菌(acinetobacter baylyi)、抗辐射不动杆菌(acinetobacter radioresistens)等不动杆菌属。
[0060]
粪产碱菌(alcaligenes faecalis)等产碱菌属。
[0061]
白色类诺卡氏菌(nocardioides albus)等类诺卡氏菌(nocardioides)属。
[0062]
碘短杆菌(brevibacterium iodinum)等短杆菌属。
[0063]
食酸戴尔福特菌(delftia acidovorans)等戴尔福特菌属。
[0064]
shimwellia blattae等shimwellia属。
[0065]
阴沟气杆菌(aerobacter cloacae)等气杆菌属。
[0066]
放射型根瘤菌(rhizobium radiobacter)等根瘤菌属。
[0067]
格氏沙雷氏菌(serratia grimesii)、无花果沙雷氏菌(serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(serratia fonticola)、气味沙雷氏菌(serratia odorifera)、普利茅斯沙雷氏菌(serratia plymuthica)、嗜虫沙雷氏菌(serratia entomophila)或嗜线虫沙雷氏菌(serratia nematodiphila)等沙雷氏菌属。
[0068]
在上述本身具有制造3-羟基己二酸的能力的微生物中，本发明优选利用属于大肠
杆菌属或沙雷氏菌属的微生物。
[0069]
作为据推测为本身具有制造α-氢化己二烯二酸的能力的微生物，可以列举出以下的微生物。
[0070]
弗格森埃希氏菌(escherichia fergusonii)、大肠杆菌(escherichia coli)等大肠杆菌属。
[0071]
格氏沙雷氏菌(serratia grimesii)、无花果沙雷氏菌(serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(serratia fonticola)、气味沙雷氏菌(serratia odorifera)、普利茅斯沙雷氏菌(serratia plymuthica)、嗜虫沙雷氏菌(serratia entomophila)或嗜线虫沙雷氏菌(serratia nematodiphila)等沙雷氏菌属。
[0072]
荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、产氮假单胞菌(pseudomonas azotoformans)、绿针假单胞菌产金色亚种(pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens)等假单胞菌属。
[0073]
蜂房哈夫尼菌(hafnia alvei)等哈夫尼菌属。
[0074]
栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)等芽孢杆菌属。
[0075]
耐金属贪铜菌(cupriavidus metallidurans)、cupriavidus numazuensis、草酸盐贪铜菌(cupriavidus oxalaticus)等贪铜菌属。
[0076]
贝氏不动杆菌(acinetobacter baylyi)、抗辐射不动杆菌(acinetobacter radioresistens)等不动杆菌属。
[0077]
粪产碱菌(alcaligenes faecalis)等产碱菌属。
[0078]
食酸戴尔福特菌(delftia acidovorans)等戴尔福特菌属。
[0079]
shimwellia blattae等shimwellia属。
[0080]
在上述本身具有制造α-氢化己二烯二酸的能力的微生物中，本发明优选利用属于大肠杆菌属或沙雷氏菌属的微生物。
[0081]
在本发明的基因修饰微生物本身不具有制造3-羟基己二酸的能力的情况下，通过适当组合对催化反应a、b、d的酶进行编码的核酸并导入微生物中，能够赋予这些制造能力，另外，在本身不具有制造α-氢化己二烯二酸的能力的情况下，通过适当组合对催化反应a、b、c、e的酶进行编码的核酸并导入微生物中，可以赋予这些生成能力。
[0082]
本发明中可以用作用于得到基因修饰微生物的宿主的微生物只要是能够进行基因修饰的微生物即可，没有特别地限定，优选属于大肠杆菌属(escherichia)、沙雷氏菌属(serratia)、哈夫尼菌属(hafnia)、假单胞菌属(psuedomonas)、棒状杆菌属(corynebacterium)、芽孢杆菌属(bacillus)、链霉菌属(streptomyces)、贪铜菌属(cupriavidus)、不动杆菌属(acinetobacter)、产碱菌属(alcaligenes)、短杆菌属(brevibacterium)、戴尔福特菌属(delftia)、shimwellia属、气杆菌属(aerobacter)、根瘤菌属(rhizobium)、嗜热菌属(thermobifida)、梭菌属(clostridium)、裂殖酵母菌属(schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、毕赤酵母菌属(pichia)以及假丝酵母菌属(candida)的微生物，更优选属于大肠杆菌属、沙雷氏菌属、哈夫尼菌属、假单胞菌属的微生物，特别优选属于大肠杆菌属或沙雷氏菌属的微生物。
[0083]
作为对将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的反应b进行催化的酶的具体例子，可以列举出以下(a)～(c)所记载的多肽。
[0084]
(a)由序列号10、12、14、16、18、20、22中的任一个所记载的氨基酸序列构成的多肽；
[0085]
(b)由序列号10、12、14、16、18、20、22中的任一个所记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或添加后的氨基酸序列构成的、并且具有对将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的反应进行催化的酶活性的多肽；以及
[0086]
(c)相对于序列号10、12、14、16、18、20、22中的任一个所记载的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，并且具有将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的活性的多肽。
[0087]
此外，作为3-羟酰基-coa脱氢酶的归类于ec1.1.1.35的酶、作为3-羟基丁酰基-coa脱氢酶的归类于ec1.1.1.157的酶也可以用作具有3-氧代己二酰-coa还原酶活性的酶。具体而言，可以列举出：来自pseudomonas putida kt2440株的paah(ncbi proteinid:np_745425.1)、来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的paah(ncbi proteinid:np_415913.1)、来自acinetobacter baylyi adp1株的dcah(ncbi proteinid:cag68533.1)、来自serratia plymuthica nbrc102599株的paah(ncbi proteinid:wp_063197120)、来自serratia nematodiphila dsm21420株的多肽(ncbi proteinid:wp_033633399.1)作为对将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的反应进行催化的酶。其中，优选上述(a)～(c)中记载的多肽。
[0088]
对于本发明中所使用的由序列号10、12、14、16、18、20、22中的任一个所记载的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生置换、缺失、插入和/或添加后的氨基酸序列构成的、并且具有3-氧代己二酰-coa还原酶的酶活性的多肽，“1个或多个”的范围优选为10个以内、更优选为5个以内、特别优选为4个以内、最优选为1个或2个以内。这里，在氨基酸发生置换的情况下，在置换成性质类似的氨基酸的情况下(即，保守性置换)，多肽的活性得以保持的可能性高。即，在氨基酸发生置换的情况下，即使置换成性质类似的氨基酸，也大多可以保持生理活性，因此置换时优选置换成性质类似的氨基酸。即，可以将构成天然蛋白质的20种氨基酸分成以下具有类似性质的组：具有低极性侧链的中性氨基酸(gly、ile、val、leu、ala、met、pro)；具有亲水性侧链的中性氨基酸(asn、gln、thr、ser、tyr、cys)；酸性氨基酸(asp、glu)；碱性氨基酸(arg、lys、his)；芳香族氨基酸(phe、tyr、trp)，如果在这些之间进行置换，则多肽的性质大多不会发生变化。
[0089]
关于本发明中所使用的、相对于序列号10、12、14、16、18、20、22中的任一个的氨基酸序列具有70％以上的序列同源性，并且具有3-氧代己二酰-coa还原酶的酶活性的多肽，序列同源性的优选范围优选为80％以上、更优选为85％以上、进一步优选为90％以上、进一步优选为95％以上、进一步优选为97％以上、进一步优选为99％以上。
[0090]
对于上述(a)的序列号10、12、14、16、18、20、22中所记载的多肽，均在从n末端侧起第15～38个氨基酸残基(以下，为了方便，将从n末端侧起第某个氨基酸残基表示为“a.a.”。因此，例如，有时将从n末端侧起第15～38个氨基酸残基简单表示为“15～38a.a.”)中具有由序列号23所示的24个氨基酸残基构成的共通序列1。在共通序列1中，xaa为任意的氨基酸残基，但是，13a.a.优选为苯丙氨酸或亮氨酸，15a.a.优选为亮氨酸或谷氨酰胺，16a.a.优选为赖氨酸或天冬酰胺，17a.a.为甘氨酸或丝氨酸、更优选为甘氨酸，19a.a.优选为脯氨酸或精氨酸，21a.a.优选为亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸。共通序列1对应于nad+结合残基及其
周边的氨基酸残基。如biochimie 2012feb；94(2):471-8.所示，nad+结合残基的特征在于：共通序列1的第24个氨基酸残基为天冬氨酸，但是在共通序列1中为天冬酰胺。据认为：通过具有共通序列1，序列号10、12、14、16、18、20、22中所记载的多肽表现出作为3-氧代己二酰-coa还原酶的优异的酶活性。
[0091]
对于上述(b)和(c)中所记载的多肽，也优选在1～200a.a.以内具有由序列号23所示的24个氨基酸残基构成的共通序列1。共通序列的位置更优选在1～150a.a.以内、进一步优选在1～100a.a.以内。
[0092]
对本发明的(a)～(c)中所记载的多肽进行编码的核酸可以包括在该多肽的n末端和/或c末端进一步添加肽或蛋白质而得的序列。作为这种肽或蛋白质，例如可以示例出包括分泌信号序列、传输蛋白质、结合蛋白质、精制用标记肽、荧光蛋白质等。对于这种肽或蛋白质，本领域技术人员可以根据目的来选择具有所添加的功能的肽或蛋白质，并将其添加到本发明的多肽中。需要说明的是，在氨基酸序列的序列同源性中不包括这种肽或蛋白质。
[0093]
对序列号10、12、14、16、18、20、22中所记载的多肽进行编码的核酸只要是可以翻译成序列号10、12、14、16、18、20、22中所记载的氨基酸序列的碱基序列即可，没有特别地限定，可以参考对应于各氨基酸的密码子(标准遗传密码)来决定。此时，也可以使用本发明所使用的宿主微生物中常用的密码子对碱基序列再设计。
[0094]
作为对具有序列号10、12、14、16、18、20、22中所记载的氨基酸序列的多肽进行编码的核酸的碱基序列的具体例子，可以分别列举出序列号9、11、13、15、17、19、21中所记载的碱基序列。
[0095]
在本发明中，某个核酸所编码的多肽是否具有3-氧代己二酰-coa还原酶活性是通过以下方法判断的：制作以下转化株a和转化株b，作为培养试验的结果，如果在培养液中确认到3-羟基己二酸或α-氢化己二烯二酸，则该核酸对具有3-氧代己二酰-coa还原酶活性的多肽进行编码。使用上述反应路线1所示的生物合成路径来说明判断方法。
[0096]
转化株a具有对反应a、反应d以及反应e进行催化的酶。转化株b具有对反应a、反应c、反应d以及反应e进行催化的酶。
[0097]
首先，制作转化株a。制作可以分别表达对反应a、反应d以及反应e进行催化的酶的质粒。需要说明的是，反应d和e可以使用相同的酶来对反应进行催化。将该质粒导入到不具有生产3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸中的任意一者的能力的微生物株即escherichia coli bl21(de3)株中。对所得的转化株导入表达质粒，从而得到转化株a，其中，所述表达质粒是将对作为研究是否具有酶活性的对象的多肽进行编码的核酸组装在适宜的启动子的下游而得的。培养转化株a，确认培养后的培养液中是否含有3-羟基己二酸。在培养液中可以确认到3-羟基己二酸的情况下，接着制作转化株b。转化株b是通过对转化株a制作并导入表达对反应c进行催化的酶的质粒而得到的。培养转化株b，确认培养后的培养液中是否含有α-氢化己二烯二酸。如果在培养后的培养液中可以确认到含有α-氢化己二烯二酸，则可以知道转化株a所生产的3-羟基己二酸和转化株b所生产的α-氢化己二烯二酸是经由3-羟基己二酰-coa而生成的，因此判断作为对象的多肽具有3-氧代己二酰-coa还原酶活性。
[0098]
作为上述的具体方法，例如可以使用wo2019/107516号中所记载的方法。
[0099]
以从3-氧代己二酸通过酶反应而制备的3-氧代己二酰-coa作为基质，测定使用精制3-氧代己二酰-coa还原酶生成的3-羟基己二酰-coa，由此可以计算3-氧代己二酰-coa还
原酶的活性值。具体方法如下所述。
[0100]
3-氧代己二酸可以通过公知的方法(例如，wo2017/099209号的参考例1中所记载的方法)来制备。
[0101]
3-氧代己二酰-coa溶液的制备：按照常规方法，以pseudomonas putida kt2440株的基因组dna为模板进行pcr，对对coa转移酶进行编码的核酸(pcai和pcaj，ncbi geneid：1046613和1046612)的全长进行扩增。需要说明的是，该pcr中所使用的引物的碱基序列例如为序列号24和25。将该扩增片段插入到作为大肠菌用表达载体的prsf-1b(merck millipore公司制造)的kpni位点上，使其成为与组氨酸标签序列相同的框架(frame)。将该质粒导入大肠菌bl21(de3)中，按照常规方法，使用异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导该酶的表达，接着利用来自培养液的组氨酸标签进行精制，得到coa转移酶溶液。使用该溶液制备以下组成的3-氧代己二酰-coa制备用酶反应溶液，在25℃反应3分钟后，利用uf膜(amicon ultra-0.5ml 10k、merck millipore公司制造)进行处理以除去酶，并将所得的透过液作为3-氧代己二酰-coa溶液。
[0102]
(酶反应溶液)
[0103]
100mm tris-hcl(ph8.2)
[0104]
10mm mgcl2[0105]
0.5mm琥珀酰-coa
[0106]
5mm 3-氧代己二酸钠盐
[0107]
2μm coa转移酶。
[0108]
3-氧代己二酰-coa还原酶活性的确认：按照常规方法，以作为对象的微生物株的基因组dna为模板进行pcr，对对3-氧代己二酰-coa还原酶进行编码的核酸的全长进行扩增。将该扩增片段插入到大肠菌用表达载体pacycduet-1(merck millipore公司制造)的bamhi位点上，使其成为与组氨酸标签序列相同的框架。将该质粒导入大肠菌bl21(de3)中，按照常规方法，使用异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导该酶的表达，接着利用来自培养液的组氨酸标签进行精制，得到3-氧代己二酰-coa还原酶溶液。3-氧代己二酰-coa还原酶活性可以通过使用本酶溶液制备以下组成的酶反应溶液，测定25℃的3-羟基己二酰-coa的生成量来确认。
[0109]
(酶反应溶液)
[0110]
100mm tris-hcl(ph8.2)
[0111]
10mm mgcl2[0112]
150μl/ml 3-氧代己二酰-coa溶液
[0113]
0.5mm nadh
[0114]
1mm二硫苏糖醇
[0115]
10μm 3-氧代己二酰-coa还原酶。
[0116]
接着，示出对反应a、c～e进行催化的酶的具体例子。对生成3-氧代己二酰-coa的反应a进行催化的酶例如可以使用酰基转移酶(β-酮硫解酶)等。作为酰基转移酶，对于基于ec编号的分类上没有特别地限定，但是优选归类于ec2.3.1.-的酰基转移酶，具体而言，可以列举出：作为3-氧代己二酰-coa硫解酶的归类于ec2.3.1.174的酶、作为乙酰-coa c-乙酰基转移酶的归类于ec2.3.1.9的酶、作为乙酰-coa c-酰基转移酶的归类于ec2.3.1.16的
酶。这些当中，优选使用来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的paaj(ncbi proteinid：np_415915)、来自pseudomonas putida kt2440株的pcaf(ncbi proteinid：np_743536)等。
[0117]
上述酰基转移酶是否可以以琥珀酰-coa和乙酰-coa作为基质来生成3-氧代己二酰-coa可以通过以下方法确认：组合通过精制酰基转移酶生成3-氧代己二酰-coa的反应、以及以3-氧代己二酰-coa作为基质的通过精制3-氧代己二酰-coa还原酶的还原反应，测定伴随着3-氧代己二酰-coa的还原的nadh的减少量。具体的测定方法例如如下所述。
[0118]
酰基转移酶活性的确认：按照常规方法，以作为对象的微生物株的基因组dna为模板进行pcr，对对酰基转移酶进行编码的核酸的全长进行扩增。将该扩增片段插入到大肠菌用表达载体pacycduet-1(merck millipore公司制造)的saci位点上，使其成为与组氨酸标签序列相同的框架。将该质粒导入大肠菌bl21(de3)中，按照常规方法，使用异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导该酶的表达，接着利用来自培养液的组氨酸标签进行精制，得到酰基转移酶溶液。酰基转移酶活性可以这样来确认：使用该酶溶液制备以下组成的酶反应溶液，并测定伴随着30℃的nadh的氧化的340nm吸收的减少。
[0119]
100mm tris-hcl(ph8.0)
[0120]
10mm mgcl2[0121]
0.1mm琥珀酰-coa
[0122]
0.2mm乙酰-coa
[0123]
0.2mm nadh
[0124]
1mm二硫苏糖醇
[0125]
10μg/ml 3-氧代己二酰-coa还原酶
[0126]
5μg/ml酰基转移酶
[0127]
微生物所具有的酶是否具有酰基转移酶活性可以通过使用cfe替代精制酰基转移酶来进行上述的测定而确认。以大肠菌作为对象的具体测定方法例如如下所述。
[0128]
cfe的制备：将一白金环的作为活性测定对象的大肠菌mg1655株接种在5ml的调整为ph7的培养基(培养基组成：10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母提取物、5g/l的氯化钠)中，在30℃振动培养18小时。将所得的培养液添加到5ml的调整为ph7的培养基(培养基组成：10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母提取物、5g/l的氯化钠、2.5mm的阿魏酸、2.5mm的p-香豆酸、2.5mm的苯甲酸、2.5mm的cis,cis-己二烯二酸、2.5mm的原儿茶酸、2.5mm的儿茶酚、2.5mm的3oa、2.5mm的3-羟基己二酸、2.5mm的α-氢化己二烯二酸、2.5mm的己二酸、2.5mm的苯基乙胺)中，在30℃振动培养3小时。
[0129]
在所得的培养液中加入10ml的0.9％氯化钠，对菌体进行离心分离并除去上清液，重复操作3次以清洗菌体。将洗净后的菌体在由100mm的tris-hcl(ph8.0)、1mm的二硫苏糖醇构成的1ml的tris-hcl缓冲液中悬浊，并在所得的悬浊液中加入玻璃微珠(φ0.1mm)，使用超声波破碎机在4℃破碎菌体。对菌体破碎液进行离心，并将所得的上清液当中的0.5ml经过uf膜(amicon ultra-0.5ml10k、merck millipore公司制造)，除去了透过液后添加0.4ml的tris-hcl缓冲液，重复进行3次以除去低分子量的杂质，然后再次在tris-hcl缓冲液中悬浊成为液量为0.1ml的溶液，将其作为cfe。将替代精制酶的该cfe以相对于总量0.1ml的酶反应溶液添加0.05ml，进行酶活性的确认。
[0130]
对生成2,3-脱氢己二酰-coa的反应c进行催化的酶例如可以使用烯酰-coa水合酶等。作为烯酰-coa水合酶，对于基于ec编号的分类上没有特别地限定，但是优选归类于ec编号4.2.1.-的烯酰-coa水合酶，具体而言，可以列举出作为烯酰-coa水合酶或2,3-脱氢己二酰-coa水合酶的归类于ec4.2.1.17的酶。这些当中，优选使用来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的paaf(ncbi proteinid：np_415911)、来自pseudomonas putida kt2440株的paaf(ncbi proteinid：np_745427)等。
[0131]
由于烯酰-coa水合酶所催化的反应一般为可逆反应，因此烯酰-coa水合酶具有对以3-羟基己二酰-coa作为基质生成2,3-脱氢己二酰-coa的反应进行催化的活性可以通过以下方法来确认：以由α-氢化己二烯二酸通过酶反应所制备的2,3-脱氢己二酰-coa作为基质，检测使用精制烯酰-coa水合酶所生成的3-羟基己二酰-coa。具体的测定方法例如如下所述。
[0132]
α-氢化己二烯二酸的制备：α-氢化己二烯二酸可以通过wo2016/199858号的参考例1中所记载的方法来制备。
[0133]
2,3-脱氢己二酰-coa溶液的制备：按照常规方法，以pseudomonas putida kt2440株的基因组dna为模板进行pcr，对对coa转移酶进行编码的核酸(pcai和pcaj、ncbi geneid：1046613和1046612)的全长进行扩增。需要说明的是，该pcr中所使用的引物的碱基序列例如为序列号24和25。将该扩增片段插入到作为大肠菌用表达载体的prsf-1b(merck millipore公司制造)的kpni位点上，使其成为与组氨酸标签序列相同的框架。将该质粒导入大肠菌bl21(de3)中，按照常规方法，使用异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导该酶的表达，接着利用来自培养液的组氨酸标签进行精制，得到coa转移酶溶液。使用该溶液制备以下组成的2,3-脱氢己二酰-coa制备用酶反应溶液，在30℃反应10分钟后，利用uf膜(amicon ultra-0.5ml 10k、merck millipore公司制造)进行处理以除去酶，将所得的透过液作为2,3-脱氢己二酰-coa溶液。
[0134]
2,3-脱氢己二酰-coa制备用酶反应溶液
[0135]
100mm tris-hcl(ph8.0)
[0136]
10mm mgcl2[0137]
0.4mm琥珀酰-coa
[0138]
2mmα-氢化己二烯二酸钠盐
[0139]
20μg/ml coa转移酶
[0140]
烯酰-coa水合酶活性的确认：按照常规方法，以作为对象的微生物株的基因组dna为模板进行pcr，对对烯酰-coa水合酶进行编码的核酸的全长进行扩增。将该扩增片段插入到大肠菌用表达载体pet-16b(merck millipore公司制造)的ndei位点上，使其成为与组氨酸标签序列相同的框架。将该质粒导入大肠菌bl21(de3)中，按照常规方法，使用异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导该酶的表达，接着利用来自培养液的组氨酸标签进行精制，得到烯酰-coa水合酶溶液。烯酰-coa水合酶活性是通过以下方法来确认的：使用该溶液制备以下组成的酶反应溶液，在30℃反应10分钟后，利用uf膜(amicon ultra-0.5ml 10k、merck millipore公司制造)进行处理以除去酶，并且通过高效液相色谱-二级质谱联用仪(lc-ms/ms)(agilent公司)检测所得的透过液中的3-羟基己二酰-coa。
[0141]
100mm tris-hcl(ph8.0)
[0142]
10mm mgcl2[0143]
300μl/ml 2,3-脱氢己二酰-coa溶液
[0144]
1mm二硫苏糖醇
[0145]
20μg/ml烯酰-coa水合酶
[0146]
本发明所使用的宿主微生物中本身表达的酶是否具有烯酰-coa水合酶活性是通过将替代精制烯酰-coa水合酶的cfe以相对于总量为0.1ml的酶反应溶液添加0.05ml，并且进行上述测定来确认的。以大肠菌作为对象的cfe的制备方法的具体例子如酰基转移酶活性的确认方法中所述。
[0147]
对生成3-羟基己二酸的反应d、生成α-氢化己二烯二酸的反应e进行催化的酶例如可以使用coa转移酶或者酰基-coa水合酶等，但是优选coa转移酶。
[0148]
作为coa转移酶，对于基于ec编号的分类没有特别地限定，但是优选归类于ec编号2.8.3.-的coa转移酶，具体而言，可以列举出作为coa转移酶或酰基-coa转移酶的归类于ec2.8.3.6的酶等。
[0149]
在本发明中，“coa转移酶”是指具有以酰基-coa和琥珀酸为基质生成羧酸和琥珀酰-coa的反应的催化活性(coa转移酶活性)的酶。
[0150]
在对生成3-羟基己二酸的反应d、生成α-氢化己二烯二酸的反应e进行催化的酶中，其中优选使用来自pseudomonas putida kt2440株的pcai和pcaj(ncbi proteinid：np_746081和np_746082)等。
[0151]
由于该酶反应为可逆反应，因此以3-羟基己二酰-coa或2,3-脱氢己二酰-coa作为基质的coa转移酶活性可以通过以下方法来确认：以3-羟基己二酸和琥珀酰-coa、或α-氢化己二烯二酸和琥珀酰-coa作为基质，检测使用精制coa转移酶所生成的3-羟基己二酰-coa或2,3-脱氢己二酰-coa。具体的测定方法例如如下所述。
[0152]
3-羟基己二酸的制备：3-羟基己二酸可以通过wo2016/199856号的参考例1中所记载的方法来制备。
[0153]
以3-羟基己二酸作为基质的coa转移酶活性的确认：按照常规方法，以作为对象的微生物株的基因组dna为模板进行pcr，对对coa转移酶进行编码的核酸的全长进行扩增。将该扩增片段插入到大肠菌用表达载体prsf-1b(merck millipore公司制造)的kpni位点上，使其成为与组氨酸标签序列相同的框架。将该质粒导入大肠菌bl21(de3)中，按照常规方法，使用异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导该酶的表达，接着利用来自培养液的组氨酸标签进行精制，得到coa转移酶溶液。使用该溶液制备以下组成的酶反应溶液，在30℃反应10分钟后，利用uf膜(amicon ultra-0.5ml 10k、merck millipore公司制造)进行处理以除去酶，并且通过高效液相色谱-二级质谱联用仪(lc-ms/ms)(agilent公司)检测透过液中的3-羟基己二酰-coa来确认。
[0154]
100mm tris-hcl(ph8.0)
[0155]
10mm mgcl2[0156]
0.4mm琥珀酰-coa
[0157]
2mm 3-羟基己二酸钠盐
[0158]
20μg/ml coa转移酶
[0159]
α-氢化己二烯二酸的制备：α-氢化己二烯二酸可以通过wo2016/199858号的参考
例1中所记载的方法来制备。
[0160]
以α-氢化己二烯二酸作为基质的coa转移酶活性的确认：按照常规方法，以作为对象的微生物株的基因组dna为模板进行pcr，对对coa转移酶进行编码的核酸的全长进行扩增。将该扩增片段插入到大肠菌用表达载体prsf-1b(merck millipore公司制造)的kpni位点上，使其成为与组氨酸标签序列相同的框架。将该质粒导入大肠菌bl21(de3)中，按照常规方法，使用异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导该酶的表达，接着利用来自培养液的组氨酸标签进行精制，得到coa转移酶溶液。使用该溶液制备以下组成的酶反应溶液，在30℃反应10分钟后，利用uf膜(amicon ultra-0.5ml 10k、merck millipore公司制造)进行处理以除去酶，并且通过高效液相色谱-二级质谱联用仪(lc-ms/ms)(agilent公司)检测透过液中的2,3-脱氢己二酰-coa来确认。
[0161]
100mm tris-hcl(ph8.0)
[0162]
10mm mgcl2[0163]
0.4mm琥珀酰-coa
[0164]
2mmα-氢化己二烯二酸钠盐
[0165]
20μg/ml coa转移酶
[0166]
本发明所使用的宿主微生物中本身表达的酶是否具有coa转移酶活性是通过将替代精制coa转移酶的cfe以相对于总量为0.1ml的酶反应溶液添加0.05ml，并且进行上述测定来确认的。以大肠菌作为对象的cfe的制备方法的具体例子如酰基转移酶活性的确认方法中所述。
[0167]
在本发明中，在将对酰基转移酶、3-氧代己二酰-coa还原酶、烯酰-coa水合酶、coa转移酶中的任意一者进行编码的核酸导入宿主微生物中的情况下，该核酸可以基于存在于数据库上的该酶的氨基酸序列进行人工合成，也可以从天然中分离。在人工合成的情况下，可以根据导入的宿主微生物来改变对应于各氨基酸的密码子的使用频率。
[0168]
在从天然中分离对该酶进行编码的核酸的情况下，对作为基因源的生物没有特别地限定，例如可以列举出：贝氏不动杆菌(acinetobacter baylyi)、抗辐射不动杆菌(acinetobacter radioresistens)等不动杆菌属；阴沟气杆菌(aerobacter cloacae)等气杆菌属；粪产碱菌(alcaligenes faecalis)等产碱菌属；栗褐芽孢杆菌(bacillus badius)、巨大芽孢杆菌(bacillus magaterium)、玫瑰芽孢杆菌(bacillus roseus)等芽孢杆菌属；碘短杆菌(brevibacterium iodinum)等短杆菌属；嗜乙酰乙酸棒杆菌(corynebacterium acetoacidophilum)、醋谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium acetoglutamicum)、产氨棒杆菌(corynebacterium ammoniagenes)、谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)等棒状杆菌属；耐重金属贪铜菌(cupriavidus metallidurans)、钩虫贪铜菌(cupriavidus necator)、cupriavidus numazuensis、草酸盐贪铜菌(cupriavidus oxalaticus)等贪铜菌属；食酸戴尔福特菌(delftia acidovorans)等戴尔福特菌属；大肠杆菌(escherichia coli)、弗格森埃希氏菌(escherichia fergusonii)等大肠杆菌属；蜂房哈夫尼菌(hafnia alvei)等哈夫尼菌属；嗜氨微杆菌(microbacterium ammoniaphilum)等微杆菌属；白色类诺卡氏菌(nocardioides albus)等类诺卡氏菌属；海床游动微菌(planomicrobium okeanokoites)等游动微菌属；产氮假单胞菌(pseudomonas azotoformans)、绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)、荧光假单
胞菌(pseudomonas fluorescens)、莓实假单胞菌(pseudomonas fragi)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、食爬虫假单胞菌(pseudomonas reptilivora)等假单胞菌属；放射型根瘤菌(rhizobium radiobacter)等根瘤菌属；圆红冬孢酵母菌(rhodosporidium toruloides)等红冬孢酵母菌属；酿酒酵母菌(saccharomyces cerevisiae)等酵母菌属；嗜虫沙雷氏菌(serratia entomophila)、无花果沙雷氏菌(serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(serratia fonticola)、格氏沙雷氏菌(serratia grimesii)、嗜线虫沙雷氏菌(serratia nematodiphila)、气味沙雷氏菌(serratia odorifera)、普利茅斯沙雷氏菌(serratia plymuthica)等沙雷氏菌属；shimwellia blattae等shimwellia属；酒红链霉菌(sterptomyces vinaceus)、卡纳塔链霉菌(streptomyces karnatakensis)、橄榄色链霉菌(streptomyces olivaceus)、酒红链霉菌(streptomyces vinaceus)等链霉菌属；解脂耶氏酵母菌(yarrowia lipolytica)等耶氏酵母菌属；鲁氏耶尔森氏菌(yersinia ruckeri)等耶尔森氏菌属；小眼虫(euglena gracilis)等眼虫属；嗜热裂孢菌(thermobifida fusca)等嗜热菌属，优选不动杆菌属、棒状杆菌属、大肠杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、眼虫属、嗜热菌属。
[0169]
本发明的微生物中，优选的是，丙酮酸激酶的功能缺损，以用于增强3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的生产能力。
[0170]
丙酮酸激酶归类于ec2.7.1.40，是一种可以对将磷酸烯醇丙酮酸脱磷酸化、并转化成丙酮酸和atp的反应进行催化的酶。具体而言，可以列举出来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的pykf(ncbi proteinid：np_416191、序列号27)、pyka(ncbi proteinid：np_416368、序列号28)、以及来自serratia grimesii nbrc13537株的pykf(序列号30)、pyka(序列号31)等。在本发明所使用的微生物具有2个以上的对丙酮酸激酶进行编码的基因的情况下，优选使全部的丙酮酸激酶的功能缺损。本发明使用的微生物具有的基因所编码的多肽是否为丙酮酸激酶可以通过在ncbi和kegg等公共数据库上进行blast检索即可。
[0171]
本发明的微生物中，优选的是，强化磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶的活性，以用于增强3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的生产能力。
[0172]
磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶归类于ec4.1.1.49，是一种对从磷酸烯醇丙酮酸、二氧化碳以及adp生成草酰乙酸和atp的反应进行催化的酶。具体而言，可以列举出来自escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的pck(ncbi proteinid：np_417862、序列号32)、以及来自serratia grimesii nbrc13537株的pcka_1(序列号33)、pcka_2(序列号34)等。
[0173]
磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶在生理上承担着糖原异生过程中由脂肪酸生产葡萄糖时的主要反应。磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶所催化的反应是可逆反应，但是在3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的生产中，该反应向将磷酸烯醇丙酮酸和二氧化碳转化为草酰乙酸的方向进行。
[0174]
本发明使用的酶基因所编码的多肽是否为磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶可以通过在ncbi和kegg等网站上进行blast检索即可。本发明的基因修饰微生物可以在含有以通常微生物可利用的碳源作为发酵原料的培养基中进行培养，优选在液体培养基中进行培养。也可以使用除了该基因修饰微生物可利用的碳源以外，还进一步含有氮源、无机盐、以及根据
需要的氨基酸或维生素等有机微量营养素的培养基。只要含有上述营养源，则无论是天然培养基还是合成培养基均可以利用。
[0175]
发酵原料是指该基因修饰微生物可以代谢的原料。“代谢”是指微生物从细胞外吸收的、或者细胞内由其他化学化合物生成的某种化学化合物通过酶反应而转化为其他化学化合物。作为碳源，优选可以使用糖类。作为糖类的具体例子，可以列举出：葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖等单糖类；这些单糖类结合而成的二糖类；多糖类；以及含有它们的淀粉糖化液、糖蜜、含纤维素生物质糖化液等。
[0176]
上述列举的碳源可以只使用一种，也可以组合使用，但是特别优选在含有葡萄糖的培养基中进行培养。在碳源的添加中，对培养基中的碳源的浓度没有特别地限定，可以根据碳源的种类等进行适当设定。葡萄糖的优选的浓度为5～300g/l。
[0177]
作为用于培养该基因修饰微生物的氮源，例如可以使用氨气、氨水、铵盐类、尿素、硝酸盐类、其他辅助使用的有机氮源，例如油渣类、大豆水解液、酪蛋白分解物、其他氨基酸、维生素类、玉米浆、酵母或酵母提取物、肉精、胰蛋白胨等肽类，各种发酵菌体及其水解物等。对培养基中的氮源的浓度没有特别地限定，优选为0.1～50g/l。
[0178]
作为用于培养该基因修饰微生物的无机盐类，例如可以适当添加使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐以及锰盐等。
[0179]
用于生产3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的基因修饰微生物的培养条件可以根据该基因修饰微生物的种类和外部条件等，对上述成分组成的培养基、培养温度、搅拌速度、ph、通气量、接种量等进行适当地调节或选择设定。
[0180]
培养中的ph的范围只要能够使该基因修饰微生物生长即可，没有特别地限定，优选为ph5～8、更优选为ph5.5～6.8。
[0181]
培养中的通气条件的范围只要能够生产3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸即可，没有特别地限定，但是为了良好地生长该微生物变异体，优选至少在培养开始时在培养容器内的液相或气相中残留有氧气。
[0182]
在液体培养中有发泡的情况下，可以将矿物油、硅油以及表面活性剂等消泡剂适当地混合到培养基中。
[0183]
在所述微生物的培养物中生成3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸直到可回收的量后，可以将所生产的该产物回收。对于所生产的该产物的回收(例如分离)，可以在累积量适度提高的时候停止培养，并按照从该培养物中提取发酵产物的一般方法来进行。具体而言，通过离心分离、过滤等将菌体分离后，通过柱层析色谱、离子交换层析色谱、活性炭处理、结晶、膜分离、蒸馏等，将该产物从培养物中分离出来。更具体而言，可以列举出：通过在该产物的盐中添加酸成分来回收析出物的方法；利用反渗透膜或旋蒸仪等对培养物进行浓缩操作以除去水，提高该产物的浓度后，通过冷却结晶或绝热结晶使该产物和/或该产物的盐的结晶析出，再通过离心分离或过滤等获得该产物和/或该产物的盐的结晶的方法；在培养物中添加醇类以使将该产物成为酯后，通过蒸馏操作回收该产物的酯，然后再通过水解获得该产物的方法等，但不限于这些。另外，这些回收方法可以根据产物的物性等适当地选择并优化。
[0184]
实施例
[0185]
以下，列举实施例并对本发明进行具体的说明。
[0186]
参考例1
[0187]
用于表达对从乙酰-coa和琥珀酰-coa生成3oa-coa和辅酶a的反应(反应a)进行催化的酶、对从3oa-coa生成3ha-coa的反应(反应b)以及从3ha-coa生成3-羟基己二酸的反应(反应d)且从hma-coa生成α-氢化己二烯二酸的反应(反应e)进行催化的酶的质粒的制作
[0188]
使用xhoi切断在大肠菌内可自体复制的载体pbbr1mcs-2(me kovach,(1995),gene 166:175-176)，得到pbbr1mcs-2/xhoi。为了将构成性表达启动子组装在该载体中，以escherichia coli str.k-12substr.mg1655的基因组dna为模板，设计了用于对gapa(ncbi geneid：nc_000913.3)的上游区域200b(序列号35)进行pcr扩增的引物(序列号36、37)，按照常规方法进行pcr反应。使用“in-fusion hd cloning kit”(takara bio株式会社制造)将所得的片段和pbbr1mcs-2/xhoi连接起来，并导入大肠菌株dh5α中。从所得的重组大肠菌株中提取该质粒，将按照常规方法确认了碱基序列的质粒设为pbbr1mcs-2::pgap。接着，使用scai切断pbbr1mcs-2::pgap，得到pbbr1mcs-2::pgap/scai。为了对对催化反应a的酶进行编码的基因进行扩增，以pseudomonas putida kt2440株的基因组dna为模板，设计了用于对酰基转移酶基因pcaf(ncbi geneid：1041755、序列号38)的全长进行pcr扩增的引物(序列号39、40)，按照常规方法进行pcr反应。使用“in-fusion hd cloning kit”(takara bio株式会社制造)将所得的片段和pbbr1mcs-2::pgap/scai连接起来，并导入大肠菌株dh5α中。从所得的重组株中提取该质粒，将按照常规方法确认了碱基序列的质粒设为pbbr1mcs-2::at。接着，使用hpai切断pbbr1mcs-2::at，得到pbbr1mcs-2::at/hpai。为了对对催化反应d和反应e的酶进行编码的基因进行扩增，以pseudomonas putida kt2440株的基因组dna为模板，设计了用于对包含coa转移酶基因pcai和pcaj(ncbi geneid：1046613、1046612，序列号41、42)的全长的连续序列进行pcr扩增的引物(序列号43、44)，按照常规方法进行pcr反应。使用in-fusion hd cloning kit将所得的片段和pbbr1mcs-2::at/hpai连接起来，并导入大肠菌株dh5α中。从所得的重组株中提取该质粒，将按照常规方法确认了碱基序列的质粒设为pbbr1mcs-2::atct。
[0189]
使用scai切断pbbr1mcs-2::atct，得到pbbr1mcs-2::atct/scai。为了对对序列号10的多肽进行编码的核酸进行扩增，以serratia marcescens atcc13880株的基因组dna为模板，设计了用于对序列号9所记载的核酸进行扩增的引物(序列号45、46)，按照常规方法进行pcr反应。使用“in-fusion hd cloning kit”(takara bio株式会社制造)将所得的片段和pbbr1mcs-2::atct/scai连接起来，并导入大肠菌株dh5α中。从所得的重组株中提取该质粒，将按照常规方法确认了碱基序列的质粒设为pbbr1mcs-2::atctor。
[0190]
参考例2
[0191]
用于表达对从3ha-coa生成hma-coa的反应(反应c)进行催化的酶的质粒的制作
[0192]
使用saci切断在大肠菌内可自体复制的表达载体pmw119(nippon gene公司制造)，得到pmw119/saci。为了将构成性表达启动子组装在该载体中，以escherichia coli str.k-12substr.mg1655的基因组dna为模板，设计了用于对gapa(ncbi geneid：nc_000913.3)的上游区域200b(序列号35)进行pcr扩增的引物(序列号47、48)，按照常规方法进行pcr反应。使用in-fusion hd cloning kit(takara bio株式会社制造)将所得的片段和pmw119/saci连接起来，并导入大肠菌株dh5α中。从所得的重组大肠菌株中提取该质粒，将按照常规方法确认了碱基序列的质粒设为pmw119::pgap。接着，使用sphi切断pmw119::
pgap，得到pmw119::pgap/sphi。为了对对催化反应c的酶进行编码的基因进行扩增，以pseudomonas putida kt2440株的基因组dna为模板，设计了用于对烯酰-coa水合酶基因paaf(ncbi geneid：1046932、序列号49)的全长进行pcr扩增的引物(序列号50、51)，按照常规方法进行pcr反应。使用“in-fusion hd cloning kit”(takara bio株式会社制造)将所得的片段和pmw119::pgap/sphi连接起来，并导入大肠菌株dh5α中。从所得的重组株中提取该质粒，按照常规方法确认了碱基序列。将所得的质粒设为pmw119::eh。
[0193]
实施例1
[0194]
yjjpb同源物的功能缺损了的沙雷氏菌属微生物变异体的制作
[0195]
为了使沙雷氏菌属微生物的yjjpb同源物的功能缺损，制作了使yjjpb同源基因缺损了的沙雷氏菌属微生物变异体。
[0196]
yjjpb同源基因的缺损方法可以根据proc natl acad sci usa.2000jun 6；97(12):6640-6645.中所记载的方法。
[0197]
以pkd4为模板，使用序列号52和53的寡聚dna作为引物来进行pcr，得到用于使yjjpb同源基因缺损的序列长度1.6kb的pcr片段，其中pkd4包含在基因缺损时用作标记的卡那霉素耐性基因和用于卡那霉素耐性基因脱落的frt(flp recognition target，flp识别目标)序列。将作为λ-red重组酶表达质粒的pkd46导入serratia grimesii nbrc13537株中，获得了氨苄西林耐性株。将所得的菌株接种在含有500μg/ml氨苄西林的5ml的lb培养基中，在30℃振动培养1天。将0.5ml的培养液接种在含有500μg/ml氨苄西林和50mm阿拉伯糖的50ml的lb培养基中，在30℃旋转培养2小时。将培养液冰冷20分钟后，使用10％(w/w)的丙三醇将菌体清洗3次。使用100μl的10％(w/w)的丙三醇将清洗后的团粒悬浊，与5μl的pcr片段混合后，在电穿孔液槽(cuvette)内冰冷10分钟。使用“gene pulser”(bio-rad公司制造)实施电穿孔(3kv、200ω、25μf)后，立即添加1ml的soc培养基，在30℃振动培养2小时。全部涂布在包含25μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上，在30℃进行孵育1天。使用所得的卡那霉素耐性株进行菌落直接pcr，根据条带长度确认了目的基因的缺损和卡那霉素耐性基因的插入。引物使用了序列号54和56的寡聚dna。
[0198]
接着，将该卡那霉素耐性株接种在5ml的lb培养基中，通过在37℃进行2次继代培养使pkd46脱落，得到氨苄西林敏感性株。在氨苄西林敏感性株中导入作为flp重组酶表达质粒的pcp20，再次获得氨苄西林耐性株。将所得的菌株在40℃进行2次继代培养后进行菌落直接pcr，根据条带长度确认了卡那霉素耐性基因的脱落。引物使用了序列号55和56的寡聚dna。由于得到的菌株具有氨苄西林敏感性，因此确认了pcp20脱落。将所得的菌株设为sgδyjjpb。
[0199]
实施例2
[0200]
导入有yjjpb同源物的功能缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体的制作
[0201]
对于实施例1所制作的sgδyjjpb，分别导入参考例1所制作的质粒，制作了沙雷氏菌属微生物变异体。
[0202]
将sgδyjjpb接种在5ml的lb培养基中，在30℃振动培养1天。将0.5ml的培养液接种在5ml的lb培养基中，在30℃振动培养2小时。将培养液冰冷20分钟后，使用10％(w/w)的丙三醇将菌体清洗3次。使用100μl的10％(w/w)的丙三醇将清洗后的团粒悬浊，与1μl的
pbbr1mcs-2::atctor混合后，在电穿孔液槽内冰冷10分钟。使用“gene pulser”(bio-rad公司制造)实施电穿孔(3kv、200ω、25μf)后，立即添加1ml的soc培养基，在30℃振动培养1小时。将50μl涂布在包含25μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上，在30℃进行孵育1天。将所得的菌株分别设为sgδyjjpb/3ha。
[0203]
参考例3
[0204]
导入有yjjpb同源物的功能未缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体的制作
[0205]
通过与实施例2同样的方法，在serratia grimesii nbrc13537中导入pbbr1mcs-2::atctor。将所得的菌株设为sg/3ha。
[0206]
实施例3
[0207]
使用导入有yjjpb同源物的功能缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸的生产试验
[0208]
使用实施例2中制作的沙雷氏菌属微生物变异体，进行3-羟基己二酸的生产试验。
[0209]
将一白金环的实施例2中所制作的变异体接种在5ml的调整为ph7的培养基i(10g/l的bacto胰蛋白胨(difco laboratories公司制造)、5g/l的bacto酵母提取物(difco laboratories公司制造)、5g/l的氯化钠、25μg/ml的卡那霉素)(φ18mm的玻璃试管、铝栓)中，在30℃、120min-1振动培养24小时。将0.25ml的该培养液添加到5ml的调整为ph6.5的培养基ii(50g/l的葡萄糖、1g/l的硫酸铵、50mm的磷酸钾、0.025g/l的硫酸镁、0.0625mg/l的硫酸铁、2.7mg/l的硫酸锰、0.33mg/l的氯化钙、1.25g/l的氯化钠、2.5g/l的bacto胰蛋白胨、1.25g/l的bacto酵母提取物、25μg/ml的卡那霉素)(φ18mm的玻璃试管、铝栓)中，在30℃静置培养。
[0210]
基质和产物的定量分析
[0211]
使用millex-gv(0.22μm、pvdf、merck公司制造)对来自该培养液的菌体离心分离后的上清液进行膜处理，通过以下方法对透过液进行分析，从而对培养上清液中积累的3-羟基己二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。进一步，根据该结果并使用下式(2)算出的3-羟基己二酸和琥珀酸的产率如表1所示。
[0212]
产率(％)＝产物的生成量(mol)/糖的消耗量(mol)
×
100
···
式(2)
[0213]
利用lc-ms/ms进行的3-羟基己二酸的定量分析
[0214]
·
hplc：1290infinity(agilent technologies公司制造)
[0215]
柱子：synergi hydro-rp(phenomenex公司制造)、长度100mm、内径3mm、粒径2.5μm
[0216]
流动相：0.1％甲酸水溶液/甲醇＝70/30
[0217]
流速：0.3ml/分钟
[0218]
柱温：40℃
[0219]
lc检测器：1260dad vl+(210nm)
[0220]
·
ms/ms：triple-quad lc/ms(agilent technologies公司制造)
[0221]
电离法：esi负模式。
[0222]
利用hplc进行的有机酸的定量分析
[0223]
·
hplc：lc-10a(岛津制作所制造)
[0224]
柱子：shim-pack spr-h(岛津glc公司制造)、长度250mm、内径7.8mm、粒径8μm
[0225]
shim-pack scr-101h(岛津glc公司制造)、长度250mm、内径7.8mm、粒径10μm
[0226]
流动相：5mm对-甲苯磺酸
[0227]
反应液：5mm对-甲苯磺酸、0.1mm edta、20mm bis-tris
[0228]
流速：0.8ml/分钟
[0229]
柱温：45℃
[0230]
检测器：cdd-10avp(岛津制作所制造)。
[0231]
利用hplc进行的糖类和醇类的定量分析
[0232]
·
hplc：shimazu prominence(岛津制作所制造)
[0233]
柱子：shodex sugar sh1011(昭和电工株式会社制造)、长度300mm、内径8mm、粒径6μm
[0234]
流动相：0.05m硫酸水溶液
[0235]
流速：0.6ml/分钟
[0236]
柱温：65℃
[0237]
检测器：rid-10a(岛津制作所制造)。
[0238]
比较例1
[0239]
使用导入有yjjpb的功能未缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸的生产试验
[0240]
通过与实施例3同样的方法，对参考例3所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。进一步，根据该结果并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸和琥珀酸的产率如表1所示。
[0241]
当将比较例1的结果与实施例3的结果进行比较时，可知：通过使沙雷氏菌属微生物的yjjpb同源物的功能缺损，可以提高3-羟基己二酸的产率。
[0242]
[表1]
[0243][0244]
实施例4
[0245]
yjjpb的功能缺损了的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0246]
为了使大肠杆菌属微生物的yjjpb的功能缺损，制作了使yjjpb基因缺损了的大肠杆菌属微生物变异体。
[0247]
yjjpb基因的缺损方法可以根据proc natl acad sci usa.2000jun 6；97(12):6640-6645中所记载的方法。
[0248]
以pkd4为模板，使用序列号57和58的寡聚dna作为引物来进行pcr，得到用于使yjjpb缺损的序列长度1.6kb的pcr片段。将作为frt重组酶表达质粒的pkd46导入escherichia coli str.k-12substr.mg1655株中，获得了氨苄西林耐性株。将所得的菌株接种在含有100μg/ml氨苄西林的5ml的lb培养基中，在37℃振动培养1天。将0.5ml的培养液接种在含有100μg/ml氨苄西林和50mm阿拉伯糖的50ml的lb培养基中，在37℃旋转培养2小时。将培养液冰冷20分钟后，使用10％(w/w)的丙三醇将菌体清洗3次。使用100μl的10％(w/
w)的丙三醇将清洗后的团粒悬浊，与5μl的pcr片段混合后，在电穿孔液槽内冰冷10分钟。使用“gene pulser”(bio-rad公司制造)实施电穿孔(3kv、200ω、25μf)后，立即添加1ml的soc培养基，在37℃振动培养2小时。全部涂布在包含25μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上，在37℃进行孵育1天。使用所得的卡那霉素耐性株进行菌落直接pcr，根据条带长度确认了目的基因的缺损和卡那霉素耐性基因的插入。引物使用了序列号54和60的寡聚dna。
[0249]
接着，将该卡那霉素耐性株接种在5ml的lb培养基中，通过在40℃进行2次继代培养使pkd46脱落，得到氨苄西林敏感性株。在氨苄西林敏感性株中导入pcp20，再次获得氨苄西林耐性株。将所得的菌株在43℃进行2次继代培养后进行菌落直接pcr，根据条带长度确认了卡那霉素耐性基因的脱落。引物使用了序列号59和60的寡聚dna。从所得的菌株为氨苄西林敏感性可以确认pcp20发生脱落。将所得的菌株设为ecδyjjpb。
[0250]
实施例5
[0251]
导入有yjjpb的功能缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0252]
对于实施例4所制作的ecδyjjpb，分别导入参考例1所制作的质粒，制作了大肠杆菌属微生物变异体。
[0253]
将ecδyjjpb接种在5ml的lb培养基中，在37℃振动培养1天。将0.5ml的培养液接种在5ml的lb培养基中，在37℃振动培养2小时。将培养液冰冷20分钟后，使用10％(w/w)的丙三醇将菌体清洗3次。使用100μl的10％(w/w)的丙三醇将清洗后的团粒悬浊，与1μl的pbbr1mcs-2::atctor混合后，在电穿孔液槽内冰冷10分钟。使用“gene pulser”(bio-rad公司制造)实施电穿孔(3kv、200ω、25μf)后，立即添加1ml的soc培养基，在37℃振动培养1小时。将50μl涂布在包含25μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上，在37℃进行孵育1天。将所得的菌株设为ecδyjjpb/3ha。
[0254]
参考例4
[0255]
导入有yjjpb的功能未缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0256]
通过与实施例5同样的方法，在escherichia coli str.k-12substr.mg1655中导入pbbr1mcs-2::atctor。将所得的菌株设为ec/3ha。
[0257]
实施例6
[0258]
使用导入有yjjpb的功能缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸的生产试验
[0259]
通过与实施例3同样的方法，对实施例5所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸和琥珀酸的产率如表2所示。
[0260]
比较例2
[0261]
使用导入有yjjpb的功能未缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸的生产试验
[0262]
通过与实施例3同样的方法，对参考例4所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸和琥珀酸的产率如表2所示。
[0263]
当将比较例2的结果与实施例6的结果进行比较时，可知：通过使大肠杆菌属微生物的yjjpb的功能缺损，可以提高3-羟基己二酸的产率。
[0264]
[表2]
[0265][0266]
实施例7
[0267]
导入有yjjpb同源物的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体的制作
[0268]
对于实施例2所制作的沙雷氏菌属微生物变异体，导入参考例2所制作的质粒pmw119::eh，制作了沙雷氏菌属微生物变异体。
[0269]
将sgδyjjpb/3ha接种在含有25μg/ml卡那霉素的5ml的lb培养基中，在30℃振动培养1天。将0.5ml的培养液接种在含有25μg/ml卡那霉素的5ml的lb培养基中，在30℃振动培养2小时。将培养液冰冷20分钟后，使用10％(w/w)的丙三醇将菌体清洗3次。使用100μl的10％(w/w)的丙三醇将清洗后的团粒悬浊，与1μl的pmw119::eh混合后，在电穿孔液槽内冰冷10分钟。使用“gene pulser”(bio-rad公司制造)实施电穿孔(3kv、200ω、25μf)后，立即添加1ml的soc培养基，在30℃振动培养1小时。将50μl涂布在包含500μg/ml氨苄西林和25μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上，在30℃进行孵育1天。将所得的菌株设为sgδyjjpb/hma。
[0270]
参考例5
[0271]
导入有yjjpb同源物的功能未缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体的制作
[0272]
通过与实施例7同样的方法，在sg/3ha中导入pmw119::eh。将所得的菌株设为sg/hma。
[0273]
实施例8
[0274]
使用导入有yjjpb同源物的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的生产试验
[0275]
除了使用包含25μg/ml卡那霉素和500μg/ml氨苄西林的培养基以外，通过与实施例3同样的方法，对实施例7所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。需要说明的是，α-氢化己二烯二酸的定量使用lc-ms/ms、在与3-羟基己二酸相同的条件下进行。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和琥珀酸的产率如表3所示。
[0276]
比较例3
[0277]
使用导入有yjjpb同源物的功能未缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的生产试验
[0278]
通过与实施例8同样的方法，对参考例5所制作的变异体进行培养。对培养上清液
中积累的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和琥珀酸的产率如表3所示。
[0279]
当将比较例3的结果与实施例8的结果进行比较时，可知：通过使沙雷氏菌属微生物的yjjpb同源物的功能缺损，可以提高3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的产率。
[0280]
[表3]
[0281][0282]
实施例9
[0283]
导入有yjjpb的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0284]
对于实施例5所制作的大肠杆菌属微生物变异体，导入参考例2所制作的质粒pmw119::eh，制作了大肠杆菌属微生物变异体。
[0285]
将ecδyjjpb/3ha接种在含有25μg/ml卡那霉素的5ml的lb培养基中，在37℃振动培养1天。将0.5ml的培养液接种在含有25μg/ml卡那霉素的5ml的lb培养基中，在30℃振动培养2小时。将培养液冰冷20分钟后，使用10％(w/w)的丙三醇将菌体清洗3次。使用100μl的10％(w/w)的丙三醇将清洗后的团粒悬浊，与1μl的pmw119::eh混合后，在电穿孔液槽内冰冷10分钟。使用“gene pulser”(bio-rad公司制造)实施电穿孔(3kv、200ω、25μf)后，立即添加1ml的soc培养基，在37℃振动培养1小时。将50μl涂布在包含100μg/ml氨苄西林和25μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上，在37℃进行孵育1天。将所得的菌株设为ecδyjjpb/hma。
[0286]
参考例6
[0287]
导入有yjjpb的功能未缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0288]
通过与实施例9同样的方法，在ec/3ha中导入pmw119::eh。将所得的菌株设为ec/hma。
[0289]
实施例10
[0290]
使用导入有yjjpb的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的生产试验
[0291]
除了使用包含25μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄西林的培养基以外，通过与实施例6同样的方法，对实施例9所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。需要说明的是，α-氢化己二烯二酸的定量使用lc-ms/ms、在与3-羟基己二酸相同的条件下进行。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和琥珀酸的产率如表4所示。
[0292]
比较例4
[0293]
使用导入有yjjpb的功能未缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的生产试验
[0294]
通过与实施例10同样的方法，对参考例6所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和琥珀酸的产率如表4所示。
[0295]
当将比较例4的结果与实施例10的结果进行比较时，可知：通过使大肠杆菌属微生物的yjjpb的功能缺损，可以提高3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的产率。
[0296]
[表4]
[0297][0298]
实施例11
[0299]
导入有yjjpb同源物和丙酮酸激酶的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体的制作
[0300]
使对沙雷氏菌属微生物的丙酮酸激酶进行编码的基因即pykf和pyka缺损，制作了丙酮酸激酶的功能缺损了的沙雷氏菌属微生物变异体。
[0301]
pykf缺损了的沙雷氏菌属微生物变异体的制作
[0302]
使用sgδyjjpb作为使pykf缺损的对象、使用序列号61和62的寡聚dna作为用于获得用于使pykf(序列号29)缺损的pcr片段的引物、在用于确认pykf缺损及卡那霉素耐性基因的插入的菌落直接pcr中使用序列号54和64的寡聚dna、以及在用于确认卡那霉素耐性基因的脱落的菌落直接pcr中使用序列号63和64的寡聚dna，除此以外，通过与实施例1同样的方法进行基因重组。将所得的菌株设为sgδyjjpb,pykf。
[0303]
pyka缺损了的沙雷氏菌属微生物变异体的制作
[0304]
使用sgδyjjpb,pykf作为使pyka缺损的对象、使用序列号66和67的寡聚dna作为用于获得用于使pyka(序列号65)缺损的pcr片段的引物、在用于确认pyka缺损及卡那霉素耐性基因的插入的菌落直接pcr中使用序列号54和68的寡聚dna、以及在用于确认卡那霉素耐性基因的脱落的菌落直接pcr中使用序列号68和69的寡聚dna，除此以外，通过与实施例1同样的方法进行基因重组。将所得的菌株设为sgδyjjpb,pykfa。
[0305]
导入有表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体的制作
[0306]
通过与实施例2同样的方法，对sgδyjjpb,pykfa导入参考例1所制作的pbbr1mcs-2::atctor。接着，对于所得的菌株，通过与实施例7同样的方法导入pmw119::eh。将所得的菌株设为sgδyjjpb,pykfa/hma。
[0307]
参考例7
[0308]
导入有yjjpb同源物的功能未缺损、而丙酮酸激酶的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体的制作
[0309]
除了使用serratia grimesii nbrc13537作为使pykf和pyka缺损的对象以外，通过与实施例11同样的方法进行基因重组。将所得的菌株设为sgδpykfa/hma。
[0310]
实施例12
[0311]
使用导入有yjjpb同源物和丙酮酸激酶的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的生产试验
[0312]
通过与实施例8同样的方法，对实施例11所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和琥珀酸的产率如表5所示。
[0313]
比较例5
[0314]
使用导入有yjjpb同源物的功能未缺损、而丙酮酸激酶的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的沙雷氏菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的生产试验
[0315]
通过与实施例12同样的方法，对参考例7所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和琥珀酸的产率如表5所示。
[0316]
当将比较例5的结果与实施例12的结果进行比较时，可知：通过使沙雷氏菌属微生物的yjjpb同源物和丙酮酸激酶的功能缺损，可以提高3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的产率。
[0317]
[表5]
[0318][0319]
实施例13
[0320]
yjjpb和丙酮酸激酶的功能缺损了的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0321]
使对大肠杆菌属微生物的丙酮酸激酶进行编码的基因即pykf和pyka缺损，制作了丙酮酸激酶的功能缺损了的大肠杆菌属微生物变异体。
[0322]
pykf缺损了的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0323]
使用ecδyjjpb作为使pykf缺损的对象、使用序列号70和71的寡聚dna作为用于获得用于使pykf(ncbi geneid:946179、序列号26)缺损的pcr片段的引物、在用于确认pykf缺损及卡那霉素耐性基因的插入的菌落直接pcr中使用序列号54和73的寡聚dna、以及在用于确认卡那霉素耐性基因的脱落的菌落直接pcr中使用序列号72和73的寡聚dna，除此以外，通过与实施例4同样的方法进行基因重组。将所得的菌株设为ecδyjjpb,pykf。
[0324]
pyka缺损了的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0325]
使用ecδyjjpb,pykf作为使pyka缺损的对象、使用序列号75和76的寡聚dna作为用于获得用于使pyka(ncbi geneid:946527，序列号74)缺损的pcr片段的引物、在用于确认pyka缺损及卡那霉素耐性基因的插入的菌落直接pcr中使用序列号54和78的寡聚dna、以及在用于确认卡那霉素耐性基因的脱落的菌落直接pcr中使用序列号77和78的寡聚dna，除此以外，通过与实施例4同样的方法进行基因重组。将所得的菌株设为ecδyjjpb,pykfa。
[0326]
参考例8
[0327]
导入有yjjpb的功能未缺损、而丙酮酸激酶的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0328]
除了使用escherichia coli str.k-12substr.mg1655作为使pykf和pyka缺损的对象以外，通过与实施例13同样的方法进行基因重组。将所得的菌株设为ecδpykfa/hma。
[0329]
实施例14
[0330]
使用导入有yjjpb和丙酮酸激酶的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的生产试验
[0331]
通过与实施例10同样的方法，对实施例13所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和琥珀酸的产率如表6所示。
[0332]
比较例6
[0333]
使用导入有yjjpb的功能未缺损、而丙酮酸激酶的功能缺损、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的生产试验
[0334]
通过与实施例14同样的方法，对参考例8所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和琥珀酸的产率如表6所示。
[0335]
当将比较例6的结果与实施例14的结果进行比较时，可知：通过使大肠杆菌属微生物的yjjpb和丙酮酸激酶的功能缺损，可以提高3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的产率。
[0336]
[表6]
[0337][0338]
参考例9
[0339]
用于增强yjjpb的功能的质粒的制作
[0340]
使用hindiii和xbai切断在大肠菌内可自体复制的表达载体pcdf-1b(merck millipore公司制造)，得到pcdf-1b/hindiii,xbai。为了组装yjjp、yjjb以及它们的启动子区域，以escherichia coli str.k-12substr.mg1655株的基因组dna为模板，设计了用于对yjjp、yjjb以及它们的启动子区域(序列号79)进行pcr扩增的引物(序列号80、81)，按照常规方法进行pcr反应。使用in-fusion hd cloning kit(takara bio株式会社制造)将所得的片段和pcdf-1b/hindiii,xbai连接起来，并导入大肠菌株dh5α中。从所得的重组大肠菌株中提取该质粒，将按照常规方法确认了碱基序列的质粒设为pcdf::yjjpb。
[0341]
参考例10
[0342]
导入有增强yjjpb的功能、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的
大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0343]
对于参考例6所制作的大肠杆菌属微生物变异体，导入参考例9所制作的质粒pcdf::yjjpb、或者作为对照的pcdf-1b，制作了大肠杆菌属变异体。
[0344]
将ec/hma接种在含有25μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄西林的5ml的lb培养基中，在37℃振动培养1天。将0.5ml的培养液接种在含有25μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄西林的5ml的lb培养基中，在30℃振动培养2小时。将培养液冰冷20分钟后，使用10％(w/w)的丙三醇将菌体清洗3次。使用100μl的10％(w/w)的丙三醇将清洗后的团粒悬浊，与1μl的pcdf::yjjpb或pcdf-1b混合后，在电穿孔液槽内冰冷10分钟。使用“gene pulser”(bio-rad公司制造)实施电穿孔(3kv、200ω、25μf)后，立即添加1ml的soc培养基，在37℃振动培养1小时。将50μl涂布在包含25μg/ml卡那霉素、100μg/ml氨苄西林以及50μg/ml链霉素的lb琼脂培养基上，在37℃进行孵育1天。将所得的菌株分别设为ec/hma,yjjpb、ec/hma,pcdf。
[0345]
参考例11
[0346]
使用导入有增强yjjpb的功能、并且表达对反应a、b、c、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的生产试验
[0347]
除了使用包含25μg/ml卡那霉素、100μg/ml氨苄西林以及50μg/ml链霉素的培养基以外，通过与实施例10同样的方法，对参考例10所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸、α-氢化己二烯二酸和琥珀酸的产率如表7所示。
[0348]
当将参考例11的结果进行比较时，可知：通过增强大肠杆菌属微生物的yjjpb的功能，琥珀酸的产率提高，而3-羟基己二酸和α-氢化己二烯二酸的产率降低。
[0349]
[表7]
[0350][0351]
实施例15
[0352]
yeea的功能缺损了的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0353]
为了使大肠杆菌属微生物的yeea的功能缺损，制作了使yeea基因缺损了的大肠杆菌属微生物变异体。
[0354]
使用序列号82和83的寡聚dna作为将pkd4作为模板的卡那霉素耐性基因及frt序列的扩增中使用的引物、使用序列号54和85的寡聚dna作为用于卡那霉素耐性基因的导入确认的引物、使用序列号84和85的寡聚dna作为用于卡那霉素耐性基因的脱落确认的引物，除此以外，通过与实施例4同样的方法使yeea基因缺损。将所得的菌株设为ecδyeea。
[0355]
实施例16
[0356]
导入有yeea的功能缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0357]
通过与实施例5同样的方法，对于实施例15所制作的ecδyeea，导入参考例1所制作的质粒，制作了大肠杆菌属微生物变异体。将所得的菌株设为ecδyeea/3ha。
[0358]
实施例17
[0359]
使用导入有yeea的功能缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸的生产试验
[0360]
通过与实施例6同样的方法，对实施例16所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸和琥珀酸的产率如表8所示。
[0361]
当将比较例2的结果与实施例17的结果进行比较时，可知：通过使大肠杆菌属微生物的yeea的功能缺损，可以提高3-羟基己二酸的产率。
[0362]
[表8]
[0363][0364]
实施例18
[0365]
ynfm的功能缺损了的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0366]
为了使大肠杆菌属微生物的ynfm的功能缺损，制作了使ynfm基因缺损了的大肠杆菌属微生物变异体。
[0367]
使用序列号86和87的寡聚dna作为将pkd4作为模板的卡那霉素耐性基因及frt序列的扩增中使用的引物、使用序列号54和89的寡聚dna作为用于卡那霉素耐性基因的导入确认的引物、使用序列号88和89的寡聚dna作为用于卡那霉素耐性基因的脱落确认的引物，除此以外，通过与实施例4同样的方法使ynfm基因缺损。将所得的菌株设为ecδynfm。
[0368]
实施例19
[0369]
导入有ynfm的功能缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体的制作
[0370]
通过与实施例5同样的方法，对于实施例18所制作的ecδynfm，导入参考例1所制作的质粒，制作了大肠杆菌属微生物变异体。将所得的菌株设为ecδynfm/3ha。
[0371]
实施例20
[0372]
使用导入有ynfm的功能缺损、并且表达对反应a、b、d以及e进行催化的酶的质粒的大肠杆菌属微生物变异体进行的3-羟基己二酸的生产试验
[0373]
通过与实施例6同样的方法，对实施例19所制作的变异体进行培养。对培养上清液中积累的3-羟基己二酸以及其他产物、培养基中未被利用而残存的糖类的浓度进行定量。根据该值并使用上式(2)算出的3-羟基己二酸和琥珀酸的产率如表9所示。
[0374]
当将比较例2的结果与实施例20的结果进行比较时，可知：通过使大肠杆菌属微生物的ynfm的功能缺损，可以提高3-羟基己二酸的产率。
[0375]
[表9]
[0376]
技术特征：1.一种基因修饰微生物，具有制造3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的能力，并且强化了对将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的反应进行催化的酶的活性，其中，使二羧酸排出载体的功能缺损或降低。2.根据权利要求1所述的基因修饰微生物，其中所述二羧酸排出载体的功能的缺损或降低是由yjjp或其同源物和/或yjjb或其同源物的功能的缺损或降低引起的。3.根据权利要求2所述的基因修饰微生物，其中yjjp基因或其同源基因和/或yjjb基因或其同源基因发生破坏或缺损。4.根据权利要求1所述的基因修饰微生物，其中所述二羧酸排出载体的功能的缺损或降低是由yeea或其同源物和/或ynfm或其同源物的功能的缺损或降低引起的。5.根据权利要求4所述的基因修饰微生物，其中yeea基因或其同源基因和/或ynfm基因或其同源基因发生破坏或缺损。6.根据权利要求1至5中任1项所述的基因修饰微生物，其中所述微生物是属于大肠杆菌属或沙雷氏菌属的微生物。7.根据权利要求1至6中任1项所述的基因修饰微生物，其中导入有对将3-氧代己二酰-coa还原生成3-羟基己二酰-coa的反应进行催化的酶进行编码的基因。8.一种3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的制造方法，包括对权利要求1至7中任1项所述的基因修饰微生物进行培养的工序。
技术总结公开了能够以高产率制造3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的基因修饰微生物以及使用了该基因修饰微生物的3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的制造方法。基因修饰微生物具有制造3-羟基己二酸和/或α-氢化己二烯二酸的能力，并且强化了对将3-氧代己二酰-CoA还原生成3-羟基己二酰-CoA的反应进行催化的酶的活性，而且使二羧酸排出载体的功能缺损或降低。降低。
技术研发人员：矶部匡平 河村健司 山田胜成
受保护的技术使用者：东丽株式会社
技术研发日：2021.03.17
技术公布日：2022/11/1
