表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的工程化微生物及提高pha产量的方法
技术领域
1.本发明是申请日为2022年4月6日、申请号为2022103534397、发明名称为“表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的工程化微生物及提高pha产量的方法”的专利申请的分案申请。本发明涉及微生物技术领域，具体涉及提高聚羟基脂肪酸酯产量的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体及其编码基因，以及表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的工程化微生物及提高pha产量的方法。
背景技术：2.聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，pha)是一类由微生物合成的可再生、可降解且具有多元材料学性能的高分子聚合物，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。聚羟基脂肪酸酯广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。pha根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。聚羟基丁酸酯(phb)是pha中的一种，是由细菌产生的商业上有用的复合生物聚合物，具有多种潜在应用，包括用作可生物降解/热塑性材料、某些抗生素有机合成的手性中心来源以及用作药物递送和骨替代的基质等。3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯(phbhhx，简称phbh)，也是pha中的一种，以不溶性微球状颗粒形式存在于细胞质中。
3.罗氏真养菌(ralstonia eutropha，也称cupriavidus necator)是研究pha合成的重要模式细菌，是目前研究较多的用于phb生成的菌株。当碳过剩、氮缺乏时，菌株可以大量积累phb；而当胞内其他碳源代谢旺盛时，phb的合成则会受到影响。目前，phb在罗氏真养菌体内的合成途径已被阐述清楚：酯酰辅酶a(acyl-coa)在phaa(β-酮基硫解酶)的作用下合成乙酰乙酰辅酶a(acetoacetyl coa)，再通过phab(乙酰乙酰辅酶a还原酶)合成3-羟基丁酸。菌株的发酵生产性能是影响pha生产的关键因素，因此，开发有利于pha合成和积累的基因和菌株具有重要意义。
技术实现要素：4.本发明的目的是提供能够提高聚羟基脂肪酸酯产量的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体及其编码基因，以及用于生产聚羟基脂肪酸酯的工程化微生物。
5.具体地，本发明提供以下技术方案：
6.第一方面，本发明提供乙酰乙酰辅酶a还原酶(phab)变体，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体与seq id no.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶a还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种：
7.(1)第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
8.(2)第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
9.(3)第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
10.(4)第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天
冬酰胺或组氨酸；
11.(5)第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
12.本发明提供的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体与seq id no.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶a还原酶相比存在的突变，可包含上述(1)～(5)中任选的一种突变，也可包含上述(1)～(5)中涉及突变的任意两个、三个、四个或五个的组合。
13.本发明通过实验证明，含有上述单一突变位点的变体以及含有任意两个、三个、四个或五个突变位点的组合的变体均能够显著提高菌株的生物量和pha的含量，进而显著提高pha的产量。
14.第二方面，本发明提供编码以上所述的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的核酸分子。
15.基于上述提供的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的氨基酸序列以及密码子规则，本领域技术人员能够获得编码以上所述的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的核酸分子的核苷酸序列，编码同一氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，但所有能够编码以上所述的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的核酸分子均在本发明的保护范围内。
16.在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.3-28任一所示。
17.第三方面，本发明提供含有以上所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
18.在本发明的一些实施方式中，含有以上所述的核酸分子的表达盒由启动子、编码以上所述的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的核酸分子以及终止子可操作性地连接得到。根据表达需要以及表达盒上下游序列的不同，表达盒中也可不包含终止子，或者含有增强子等其他转录、翻译调控元件。
19.在本发明的一些实施方式中，含有以上所述的核酸分子的载体为质粒载体，这些质粒载体包括复制性载体和非复制型载体。携带上述核酸分子的载体不局限于质粒载体，还可为噬菌体、病毒等载体。
20.在本发明的一些实施方式中提供了含有上述核酸分子、表达盒或载体的大肠杆菌细胞和罗氏真养菌细胞，但宿主细胞的种类并不局限于此，可以为任意的微生物细胞或可用于蛋白表达的动物细胞。
21.第四方面，本发明提供乙酰乙酰辅酶a还原酶变体或其编码基因在提高工程化微生物pha产量中的应用，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体与seq id no.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶a还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种：
22.(1)第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
23.(2)第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
24.(3)第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
25.(4)第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或组氨酸；
26.(5)第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
27.在本发明的一些实施方式中，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.3-28任一所示。
28.上述应用中，所述微生物优选为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
29.第五方面，本发明提供乙酰乙酰辅酶a还原酶变体或其编码基因或含有所述编码基因的生物材料在构建生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的微生物中的应用。
30.基于本发明提供的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体能够提高微生物的pha产量的功能，编码这些变体的核酸分子以及含有这些核酸分子的生物材料可以用于构建生产pha或其衍生物的菌株。
31.本发明中，pha的衍生物是指以pha为前体物质合成的代谢产物。在pha合成能力提高的情况下，以pha为前体合成的代谢产物的产量通常也可相应地提高。
32.上述应用中，所述微生物优选为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。
33.在本发明的一些实施方式中，将seq id no.3-28任一所示的核酸分子导入罗氏真养菌中构建生产pha的菌株。
34.第六方面，本发明提供一种工程化罗氏真养菌，所述工程化罗氏真养菌表达所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体。
35.所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体与seq id no.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶a还原酶相比，具有以下突变中的一种或多种：
36.(1)第141位缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸；
37.(2)第12位蛋氨酸突变为苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸或异亮氨酸；
38.(3)第194位异亮氨酸突变为缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；
39.(4)第42位谷氨酸突变为赖氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或组氨酸；
40.(5)第55位苯丙氨酸突变为缬氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。
41.在本发明的一些实施方式中，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体为以下任一种：wp 018973707.1、mbi1365550.1、wp 019621003.1、pzo88445.1、wp 188557499.1、wp 018954578.1、wp 109722486.1、hbr97190.1、rkz34011.1、pci29794.1、wp 152128546.1、wp 043577352.1、wp 028534370.1、wp 163146383.1、wp 020559877.1、eev22383.1、wp 054674877.1、wp 116473412.1、wp 062152427.1、wp 070469244.1、mbe0623823.1、wp 166570087.1、wp 187671963.1、wp 124635583.1、wp 175829488.1、wp 041099832.1。
42.本发明中，表达目标酶或其变体可通过以下任一种或多种方法实现：
43.(1)导入包含乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的质粒；
44.(2)在基因组中插入一个或多个拷贝的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因。
45.在本发明的一些实施方式中，通过在基因组中插入一个拷贝的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因来表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体。
46.在本发明的一些实施方式中，基因组中插入乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的位置为phac基因的编码区或其编码区的下游。
47.在本发明的一些实施方式中，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因如seq id no.3-28任一所示。这些编码基因的序列为根据罗氏真养菌的密码子偏好性并结合人工优化和筛选得到的能够在罗氏真养菌中高效、正确表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的序列，使用这些序列有利于促进乙酰乙酰辅酶a还原酶变体更好地在罗氏真养菌中发挥提高pha合成的作用。
48.在本发明的一些实施方式中，提供用于合成phbh的工程化罗氏真养菌，为促进
phbh的合成，所述工程化罗氏真养菌还包含以下修饰中的一种或多种：
49.(1)表达能够合成phbh的pha聚合酶变体；
50.(2)(r)-烯酰辅酶a水合酶的表达和/或酶活性增强。
51.其中，能够合成phbh的pha聚合酶变体可通过对细菌的pha聚合酶的氨基酸序列进行突变以使得其能够聚合c6脂肪酸(3-羟基己酸)，可采用现有技术中的能够聚合c6脂肪酸(3-羟基己酸)的pha聚合酶变体，也可通过将现有技术中能够合成phbh的pha聚合酶变体的突变位点进行组合，获得新的更高效的pha聚合酶变体。
52.在本发明的一些实施方式中，所述能够合成phbh的pha聚合酶变体相比原始pha聚合酶，含有第149位天冬酰胺突变为丝氨酸的突变和第171位天冬氨酸突变为甘氨酸的突变。
53.在本发明的一些实施方式中，所述pha聚合酶变体的氨基酸序列如seq id no.29所示。
54.上述表达能够合成phbh的pha聚合酶变体通过以下任一种或多种方式实现：
55.(1)导入包含所述能够合成phbh的pha聚合酶变体的编码基因的质粒；
56.(2)在基因组中插入一个或多个拷贝的所述能够合成phbh的pha聚合酶变体的编码基因。
57.在本发明的一些实施方式中，表达能够合成phbh的pha聚合酶变体，同时失活基因组原始的pha聚合酶编码基因。
58.在本发明的一些实施方式中，将能够合成phbh的pha聚合酶变体的编码基因插入基因组中。
59.在本发明的一些实施方式中，导入含有能够合成phbh的pha聚合酶变体的编码基因的表达质粒。
60.在本发明的一些实施方式中，所述表达质粒为稳定表达质粒，质粒的稳定表达通过在质粒中携带菌株生长必需的代谢物的合成基因，同时将基因组中的该合成基因失活实现。
61.在本发明的一些实施方式中，所述含有seq id no.29所示的pha聚合酶变体的编码基因的质粒还含有proc基因，且所述工程化罗氏真养菌的基因组proc基因失活。
62.上述增强酶的表达可通过以下(1)-(4)中的任意一种或多种方式实现：
63.(1)导入含有所述酶的编码基因的载体；
64.(2)增加基因组中所述酶的编码基因的拷贝数；
65.(3)改变基因组中所述酶的编码基因的转录和/或翻译调控元件(包括启动子等)的序列；
66.(4)改变所述酶的编码基因的核苷酸序列。
67.上述酶活性的增强可通过将所述酶的一个或多个氨基酸进行替换、缺失或插入实现。
68.在本发明的一些实施方式中，(r)-烯酰辅酶a水合酶的表达和/或酶活性增强通过以seq id no.30所示的启动子起始基因组(r)-烯酰辅酶a水合酶编码基因的转录实现。
69.在本发明的一些实施方式中，以seq id no.30所示的启动子起始基因组(r)-烯酰辅酶a水合酶编码基因的转录通过在基因组(r)-烯酰辅酶a水合酶编码基因与其上游基因
的基因间区域插入seq id no.30所示的启动子实现。
70.在本发明的一些实施方式中，所述工程化罗氏真养菌是以野生型罗氏真养菌、罗氏真养菌h16菌株或罗氏真养菌bps-050为出发菌株经修饰得到。
71.其中，罗氏真养菌(ralstonia eutropha)bps-050已于2021年10月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为富养罗尔斯通氏菌ralstonia eutropha，保藏编号为cgmcc no.23600。
72.本发明经实验证实，在上述出发菌株中表达本发明提供的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体能够显著提升pha的产量。
73.第七方面，本发明提供工程化罗氏真养菌转化体库，所述转化体库包含以上所述的工程化罗氏真养菌中的至少2株。
74.在本发明的一些实施方式中，所述转化体库中的工程化罗氏真养菌表达选自以下乙酰乙酰辅酶a还原酶变体中的任一种：wp 018973707.1、mbi1365550.1、wp 019621003.1、pzo88445.1、wp 188557499.1、wp 018954578.1、wp 109722486.1、hbr97190.1、rkz34011.1、pci29794.1、wp 152128546.1、wp 043577352.1、wp 028534370.1、wp 163146383.1、wp 020559877.1、eev22383.1、wp 054674877.1、wp 116473412.1、wp 062152427.1、wp 070469244.1、mbe0623823.1、wp 166570087.1、wp 187671963.1、wp 124635583.1、wp 175829488.1、wp 041099832.1，所述转化体库中各株工程化罗氏真养菌表达的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的氨基酸序列不同。
75.在本发明的一些实施方式中，所述转化体库包含以上所述的工程化罗氏真养菌中的任意2-26株。
76.第八方面，本发明提供所述工程化罗氏真养菌的构建方法，所述方法包括修饰罗氏真养菌以表达所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的步骤。
77.在本发明的一些实施方式中，为促进工程化罗氏真养菌对phbh的合成能力，所述方法还包括对罗氏真养菌进行以下修饰中的一种或多种：
78.(1)表达能够合成phbh的pha聚合酶变体；
79.(2)增强(r)-烯酰辅酶a水合酶的表达和/或酶活性。
80.在本发明的一些实施方式中，所述能够合成phbh的pha聚合酶变体的氨基酸序列如seq id no.29所示。
81.在本发明的一些实施方式中，所述方法包括以seq id no.30所示的启动子起始基因组(r)-烯酰辅酶a水合酶编码基因的转录。
82.在本发明的一些实施方式中，所述方法包括将能够合成phbh的pha聚合酶变体的编码基因插入基因组中。
83.在本发明的一些实施方式中，所述方法包括导入含有能够合成phbh的pha聚合酶变体的编码基因的质粒。
84.在本发明的一些实施方式中，所述方法包括导入含有能够合成phbh的pha聚合酶变体的编码基因和proc基因的质粒，以及将基因组中的proc基因失活。
85.其中，基因失活可通过基因敲除、沉默表达、rna干扰等方式实现。
86.第九方面，本发明提供所述工程化罗氏真养菌的以下任一种应用：
87.(1)在发酵生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物中的应用；
88.(2)在选育用于发酵生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的菌株中的应用。
89.本发明中，聚羟基脂肪酸酯(pha)包括但不限于聚羟基丁酸酯(phb)、3-羟基丁酸与3-羟基己酸共聚酯(phbhhx，简称phbh)、3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物(phbv)等。
90.上述应用中，选育用于发酵生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的菌株具体可为：以本发明提供的工程化罗氏真养菌为出发菌株，采用基因工程改造、诱变或驯化方法选育用于发酵生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的菌株。
91.第十方面，本发明提供一种发酵生产聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的方法，所述方法包括培养所述工程化罗氏真养菌并获得培养物的步骤。
92.在本发明的一些实施方式中，所述方法包括对所述工程化罗氏真养菌进行活化培养，将活化菌体接种至种子培养基中进行种子培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中，得到所述培养物。
93.上述培养可以选择罗氏真养菌培养常用的培养基。培养基中可含有碳源、氮源及无机盐。其中，碳源包括但不限于植物油(例如棕榈油)、蔗糖、葡萄糖、糖蜜、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖中的一种或多种的组合；氮源包括但不限于玉米浆、酵母膏、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾中的一种或多种的组合；无机盐包括但不限于磷酸盐、钾盐、钠盐、镁盐、锌盐、铁盐、锰盐、钙盐、硼酸盐、钴盐、铜盐、镍盐、钼盐中的一种或多种的组合。
94.在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括对培养得到的培养物进行分离提取，收集聚羟基脂肪酸酯或其衍生物的步骤。
95.本发明的有益效果在于：本发明提供的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体及其编码基因能够明显促进菌株的pha的合成和积累，同时促进菌株的生物量提高，进而显著提高了pha的产量；利用本发明提供的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体及其编码基因构建的工程化罗氏真养菌的细胞干重和pha产量显著提高，为pha的工程化菌株的开发提供了新的基因和菌株资源，对提高pha的发酵生产效率和降低生产成本具有重要的应用价值。
具体实施方式
96.本发明的应用不限于其在下文说明书所述或所举例说明的方案。本发明能够用于其它实施方案并且可以多种方式实施或进行。此外，本文所用的短语和术语是用于描述的目的，而不应被视为限定。本文所用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式旨在包括下文列举的项目及其等同物以及其它项目。
97.本发明提供的具体实施方案部分或全部基于以下发现：本发明发现了能够显著提高菌株pha产量的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体及其编码基因。这些乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因可以导入具有pha合成所需的其他基因的菌株中，用于提高这些菌株的pha产量，由此得到工程化微生物。这些工程化微生物可用于生产pha，进而提高现有pha发酵生产菌株的发酵生产性能。在表达本发明提供的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的基础上，工程化微生物还可进行其他修饰，本发明发现了乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的表达至少可以与pha聚合酶(phac)变体的表达、phaj的强化表达进行联合修饰，以使得pha的产量进一步提升。
98.在一些实施方案中，本发明提供与seq id no.31所示的野生型乙酰乙酰辅酶a还
id no.30所示的启动子起始转录，并在其基因组中插入上述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的工程化罗氏真养菌。这些工程化罗氏真养菌具有明显提高的phbh产量。
114.在相同的发酵培养条件下，上述实施方案中的工程化罗氏真养菌的聚羟基脂肪酸酯的产率较出发菌株显著提高。
115.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
116.实施例1表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的转化体库的构建以及乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的筛选
117.本实施例以罗氏真养菌bps-050作为出发菌，构建含有不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的转化体库，具体包括如下步骤：
118.步骤1：构建基础质粒
119.以罗氏真养菌基因组为模板进行pcr扩增，得到phac上下游同源片段phac-h1和phac-h2，在phac-h1、phac-h2的后端、前端加入bsai位点以方便后续操作；以修饰后的质粒pk18mob(orita,i.,iwazawa,et al.j.biosci.bioeng.113,63-69)为模板pcr扩增得到载体片段，使用的引物序列如表1所示。将phac-h1、phac-h2通过gibson assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pko-c(序列如seq id no.1所示)。
120.表1
121.引物名称引物序列(5
’‑3’
)pk-rgcagacttggccgggtaccapk-fcaccgctcgtcacatcctgphach1-ftggtacccggccaagtctgcgggcgtgcccatgatgtagaphach1-rtgagacccaaggtctccatgatttgattgtctctctgccgtcphach2-fggagaccttgggtctcagtgacgcttgcatgagtgccgphach2-rcaggatgtgacgagcggtgcatggtgtcgaccagcttgg
122.步骤2：基因合成
123.将待筛选的不同的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因分别进行序列优化以使得其能够在罗氏真养菌中较好地表达。分别合成经优化后的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因，在合成的dna序列的上游添加ggtctcatc，下游添加gtgaagagacc，以便于后续操作。
124.步骤3：构建含有目的基因的目标菌株
125.将步骤1构建的pko-c质粒与基因合成得到的含有乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因的质粒利用goldengate方法进行组装，分别得到携带不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因的重组质粒pko-c-n(n代表装载的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体编码基因)。将各质粒分别转化至大肠杆菌s17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌bps-050中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有500μg/ml壮观霉素与100μg/ml安普霉素的lb平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中携带同源片段的重组质粒整合到基因组的phac-h1和phac-h2所在的特定位置，由此得到第一次同源重组菌。将第一次同源重组菌在含有100mg/ml蔗糖的lb平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有壮观霉素抗性的克隆，并用引物fphach1-f：tggtctggctggcggactgag和phach2-r：ggcgaactcatcctgcgcctc进行pcr，测序鉴定插入目的基因(不同的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因)的重组菌，得到的重组菌为稳定质粒版本的罗氏真养菌reδprocδphac::n，共得到221个转化子。
126.步骤4：构建过表达罗氏真养菌原始phab基因的重组菌
127.参考步骤3中构建重组质粒的方法，利用gibson组装方法构建含有罗氏真养菌原始phab基因的重组质粒，具体方法如下：
128.以步骤1得到的pko-c质粒为模板进行pcr扩增，得到质粒骨架片段，以罗氏真养菌基因组为模板扩增得到phab基因片段，将上述两个片段通过gibson assembly方法连接，得到重组质粒pko-c-phab。构建过程中使用的引物如表2所示。
129.表2
130.引物名称引物序列pkch-c rcatgatttgattgtctctctgccgpkch-c fgtgacgcttgcatgagtgccphab fagagagacaatcaaatcatgactcagcgcattgcgtatgphab rggcactcatgcaagcgtcactcagcccatatgcaggccgc
131.将pko-c-phab质粒转化至大肠杆菌s17-1中，按照上述步骤3的方法构建重组菌，最终得到phab基因整合在罗氏真养菌的phac基因处的过表达菌株reδphac::phab。
132.步骤5：筛选能够显著提高罗氏真养菌pha产量的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体
133.(1)表达不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的重组菌的发酵培养
134.将步骤3得到的表达不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的重组菌进行平板划线，得到单克隆，将单克隆接在种子培养基(4ml)中，培养12小时。将过夜培养的菌液转接到装有10ml lb活化培养基的100ml玻璃锥形瓶，接种终od量约0.1，30℃，220rpm，培养8h，即可进行转接培养。pha发酵生产的培养是将od值在6-7之间的前培养种子，按0.1od接种于装有30ml发酵培养基的250ml摇瓶里，之后再加入300μl的棕榈油和一定量的乳化剂。48h后停止发酵，取发酵液进行离心得到菌体。将菌体烘干至恒重。
135.上述发酵培养基的配方如下：1％棕榈油，1g/l nh4cl，10ml/l微量元素溶液i和1ml/l微量元素溶液ii；其中微量元素溶液i的组成为：20g/l mgso4，2g/l cacl2。微量元素溶液ii的组成为：100mg/l znso4〃7h2o，30mg/lmncl2〃4h2o，300mg/l h3bo3，200mg/l cocl2〃6h2o，10mg/l cuso4〃5h2o，20mg/l nicl2〃6h2o，30mg/l namoo4〃2h2o。上述试剂购自国药集团化学试剂公司。
136.(2)pha的含量检测
137.酯化液的配制：取485ml无水甲醇，加入1g/l苯甲酸，缓慢加入15ml浓硫酸，即制成约500ml的酯化液。
138.样品制备：向精确称重样品后的酯化管中加入2ml酯化液和2ml氯仿。称取10mg左右的pha样品，同样方式处理作为标准样品。酯化管加盖密封后100℃反应4小时。反应结束后待酯化管冷却至室温，加入1ml去离子水，漩涡震荡至充分混合，静置分层。水相和有机相完全分离后，取下层有机相用于气相色谱法(gc)分析。
139.gc分析pha组成及含量：使用岛津公司的gc-2014型气相色谱仪。色谱仪的配置为：hp-5型毛细管色谱柱，氢火焰离子化检测器fid，spl分流进样口；高纯氮气作为载气，氢气为燃气，空气为助燃气；使用aoc-20s型自动进样器，丙酮为洗涤液。gc分析程序的设置为：进样口温度240℃，检测器温度250℃，柱温起始温度为80℃，维持1.5分钟；以30℃/分钟的速率升至140℃并维持0分钟；以40℃/分钟的速率升至240℃并维持2分钟；总计时间为8分
钟。gc结果采用内标归一法根据峰面积进行定量计算pha组成及含量。
140.对表达不同乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的重组菌的pha产量进行检测，经筛选发现，大部分乙酰乙酰辅酶a还原酶变体并不能显著提高罗氏真养菌的pha产量，甚至很多乙酰乙酰辅酶a还原酶变体使得罗氏真养菌的pha产量明显下降(甚至降低至40％以下)，仅有26个乙酰乙酰辅酶a还原酶变体能够显著提高罗氏真养菌的pha产量(pha含量达到83％以上)。表达这26个乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的重组菌的pha产量和菌体干重的检测结果如表3所示，以出发菌罗氏真养菌bps-050作为对照菌株，对照菌株的cdw为10.34g/l，pha比例为82.21％，h比例为8.15mol％。
141.表3
142.[0143][0144]
注：表3中“√”代表分别含有v141i、m12t、i194v、e42k、f55v突变位点；
“‑”
代表该位点氨基酸未发生突变；l、s等代表在相应的突变位点突变为亮氨酸、丝氨酸等其他氨基酸类型；pha含量(％)为菌体中pha的含量；h摩尔比(％)为phbh(phbhhx)中h(3hhx)的摩尔占比。
[0145]
(3)过表达原始phab的重组菌的发酵培养和pha含量检测
[0146]
将上述步骤4得到的过表达原始phab基因的重组菌按照上述(1)中的方法进行发酵培养，并按照上述(2)中的方法进行pha含量检测，以出发菌罗氏真养菌bps-050作为对照菌株。
[0147]
发酵结果如表4所示。结果表明，过表达罗氏真养菌自身的phab基因无法提高pha产量。
[0148]
表4
[0149] 对照菌株phab过表达细胞干重(g/l)10.3411.21h摩尔比(％)8.15％8.43％pha含量(％)82.21％81.96％
[0150]
实施例2乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的保守位点分析
[0151]
对实施例1中筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶a还原酶变体(表3所示)的保守位点进行分析，同时随机选取16个pha产量低于40％的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体，将这些乙酰乙酰辅酶a还原酶变体进行多序列比对，并通过一定的计算机算法对结果进行分析，最终确定能够有效提高pha产量的乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的保守位点：以罗氏真养菌的phab基因作为序列基准，保守位点分别为v141i,m12t,i194v,e42k,f55v。
[0152]
实施例3以h16为出发菌构建表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的转化体库及其性能验证
[0153]
本实施例以罗氏真养菌h16作为出发菌(罗氏真养菌h16菌株的phac基因未发生突变，phaj基因上游未引入启动子)，在罗氏真养菌h16中分别表达实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶a还原酶变体。
[0154]
重组质粒和重组菌的构建方法参考实施例1，区别在于将乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因插入基因组的phac基因之后，相应地将实施例1中的上下游同源片段的引物phach1-f、phach1-r更改为iphach1 f：tggtacccggccaagtctgtgtggaactacgtggtcgac；iphach1 r：tgagacccaaggtctccattcatgccttggctttgacgtatc，其他操作同实施例1，构建得到分别表达实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的重组菌。
[0155]
将构建得到的重组菌按照实施例1的方法进行发酵培养和pha产量检测，菌体干重和pha的产量检测结果如表5所示。结果表明，实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶a还原酶变体同样能够提高罗氏真养菌h16菌株的细胞干重和pha含量，进而有效提高pha的产量。
[0156]
表5
[0157][0158][0159]
实施例4以h16的基因改造菌为出发菌构建表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的转化体库及其性能验证
[0160]
本实施例以罗氏真养菌h16作为出发菌，将其基因组phac基因突变为phac基因变体(编码蛋白序列如seq id no.29所示)，并将在基因组phaj基因的上游插入seq id no.30所示的启动子，在此基础上，再分别表达实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶a还原酶变体，具体方法如下：
[0161]
步骤1：替换罗氏真养菌基因组phac基因
[0162]
phac基因变体的基因合成序列如seq id no.2所示，该序列含有phac基因上下游约600bp片段及phac突变体，同时在合成序列的上游添加ggtctcatc，下游添加gtgaagagacc，以便于后续与载体连接。将合成基因通过goldengate方法与pko-c载体片段连接，得到重组质粒pk18mob-δphac::phacac。
[0163]
将重组质粒pk18mob-δphac::phacac转入大肠杆菌s17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌h16中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素的lb平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组的h1和h2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。将第一次同源重组菌在含有100mg/ml蔗糖的lb平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物phac-h1 fp和phac-h2 rp进行pcr，测序鉴别出phac基因替换的重组菌，得到的重组菌为罗氏真养菌reδphac::phacac。
[0164]
步骤2：构建phaj4b基因上游插入特定启动子的重组菌
[0165]
(1)以步骤1得到的罗氏真养菌reδphac::phacac的基因组为模板进行pcr扩增，使用phaj-h1 fp、phaj-h1 rp得到phaj基因启动子的上游同源片段h1；使用phaj-h2 fp、phaj-h2 rp得到phaj基因启动子的下游同源片段h2。
[0166]
(2)基因合成phaj基因的启动子phaj43(seq id no.30)
[0167]
(3)将pcr得到的h1和h2以及phaj43启动子通过gibson assembly方法与载体片段连接，得到重组质粒pk18mob-phaj43。上述使用的引物如表6所示。
[0168]
表6
[0169]
引物名称引物序列(5
’‑3’
)phaj-h1 fpgctgggccgccgaagtgagcttcgacggcgtcttcgttccphaj-h1 rpcgagcggtgtggaggcatctattcagtcagggatgcctphaj-h2 fpctacaaataattttgtttaactgactgaataggaagagcaagcphaj-h2 rpccctgatttccataaggcgccgcacgccgcgcggtgacgacphaj fpttcgtggtctcggccgatphaj rpcaaagtcactgggttcccg
[0170]
(4)将重组质粒pk18mob-phaj43转入大肠杆菌s17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌reδphac::phacac中，利用自杀质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有200μg/ml卡那霉素与100μg/ml安普霉素lb平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中带有同源片段的重组质粒整合到基因组的h1和h2所在的特定位置，为第一次同源重组菌。将第一次同源重组菌在含有100mg/ml蔗糖的lb平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出没有卡那霉素抗性的克隆，并用引物phaj fp和phaj rp进行pcr鉴别出相应大小的重组菌，得到的重组菌为罗氏真养菌reδphac::phacac_phaj43。
[0171]
(5)在罗氏真养菌reδphac::phacac_phaj43中分别表达实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶a还原酶变体
[0172]
重组质粒和重组菌的构建方法参考实施例1，构建得到分别表达实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的reδphac::phacac_phaj43重组菌。
[0173]
将构建得到的重组菌按照实施例1的方法进行发酵培养和pha产量检测。结果表明，表达有乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的重组菌相对于对照菌(本实施例中未表达乙酰乙酰
辅酶a还原酶变体的重组菌reδphac::phacac_phaj43)在细胞干重和pha含量方面的提升比例与实施例1相当。由此证明，实施例1筛选得到的26个乙酰乙酰辅酶a还原酶变体同样能够显著提高罗氏真养菌reδphac::phacac_phaj43菌株的细胞干重和pha含量，进而显著提高pha产量。
[0174]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
技术特征：1.乙酰乙酰辅酶a还原酶变体或其编码基因在提高工程化微生物pha产量中的应用，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体为以下任一种：mbi1365550.1、wp 019621003.1、pzo88445.1、wp 188557499.1、wp 018954578.1、wp 109722486.1、hbr97190.1、rkz34011.1、pci29794.1、wp 152128546.1、wp 043577352.1、wp 028534370.1、wp 163146383.1、wp 020559877.1、eev22383.1、wp 054674877.1、wp 116473412.1、wp 062152427.1、wp 070469244.1、mbe0623823.1、wp 166570087.1、wp 187671963.1、wp 124635583.1、wp 175829488.1、wp 041099832.1。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.4-28任一所示。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述微生物为罗氏真养菌、大肠杆菌或盐单胞菌。4.一种工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌表达乙酰乙酰辅酶a还原酶变体，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体为以下任一种：mbi1365550.1、wp 019621003.1、pzo88445.1、wp 188557499.1、wp 018954578.1、wp 109722486.1、hbr97190.1、rkz34011.1、pci29794.1、wp 152128546.1、wp 043577352.1、wp 028534370.1、wp 163146383.1、wp 020559877.1、eev22383.1、wp 054674877.1、wp 116473412.1、wp 062152427.1、wp 070469244.1、mbe0623823.1、wp 166570087.1、wp 187671963.1、wp 124635583.1、wp 175829488.1、wp 041099832.1。5.根据权利要求4所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述表达通过以下任一种或多种方式实现：(1)导入包含所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因的质粒；(2)在基因组中插入一个或多个拷贝的所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因。6.根据权利要求5所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的编码基因如seq id no.4-28任一所示。7.根据权利要求4～6任一项所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌还包含以下修饰中的一种或多种：(1)表达能够合成phbh的pha聚合酶变体；(2)(r)-烯酰辅酶a水合酶的表达和/或酶活性增强。8.根据权利要求7所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述能够合成phbh的pha聚合酶变体的氨基酸序列如seq id no.29所示；和/或，(r)-烯酰辅酶a水合酶的表达和/或酶活性增强通过以seq id no.30所示的启动子起始基因组(r)-烯酰辅酶a水合酶编码基因的转录实现。9.权利要求4～8任一项所述的工程化罗氏真养菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括修饰罗氏真养菌以表达所述乙酰乙酰辅酶a还原酶变体的步骤。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对罗氏真养菌进行以下修饰中的一种或多种：(1)表达能够合成phbh的pha聚合酶变体；(2)增强(r)-烯酰辅酶a水合酶的表达和/或酶活性。
技术总结本发明涉及微生物技术领域，具体涉及表达乙酰乙酰辅酶A还原酶变体的工程化微生物及提高PHA产量的方法。本发明提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因能够明显促进菌株对PHA的合成和积累，显著提高PHA的产量；利用本发明提供的乙酰乙酰辅酶A还原酶变体及其编码基因构建的工程化罗氏真养菌的细胞干重和PHA产量显著提高，为PHA的工程化菌株的开发提供了新的基因和菌株资源，对提高PHA的发酵生产效率和降低生产成本具有重要的应用价值。效率和降低生产成本具有重要的应用价值。
技术研发人员：尹进 王禺 谢小翠 张桦宇 吴雅琨 刘甜 唐平安
受保护的技术使用者：深圳蓝晶生物科技有限公司
技术研发日：2022.04.06
技术公布日：2022/11/1
