来自皮肤表面脂质的rna的制备方法
技术领域
1.本发明涉及来自皮肤表面脂质的rna的制备方法。
背景技术：2.在生物体的各种组织中，皮肤由于与外界接触，因此作为能够侵入性低地采集生物体试样的组织而受到关注。在专利文献1中，记载了在皮肤表面脂质(skin surface lipids；ssl)中含有来源于被检测体的皮肤细胞的rna，ssl中所含的rna作为生物体的分析用的试样是有用的。但是，能够从被检测体回收的ssl的量不多，另外，其中所含的rna的量也不多，因此能够由一个被检测体的ssl制备的rna的量为微量。
3.对于来自生物体试样的rna等核酸的提取，一般可使用酚-氯仿法、agpc(酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)法、它们的改进方法等。市售有基于这些原理的核酸提取试剂(例如trizol(注册商标)等)。在专利文献2中记载了一种核酸提取法，其包括：将生物体材料溶解而使其中所含的核酸洗脱的工序；在含有洗脱的核酸的溶液中以最终浓度成为10～60体积％的方式加入水溶性有机溶剂来制备裂解物溶液的工序；以及使该裂解物溶液与固体材料接触，并使核酸吸附于固体材料而进行回收的工序。
4.现有技术文献：
5.专利文献1：国际公开公报第2018/008319号
6.专利文献2：日本特开2007-117084号公报
技术实现要素：7.本发明提供一种制备来自皮肤表面脂质的rna的方法，其中，包括：从被检测体的皮肤表面脂质制备含有rna的水性溶液的工序；将该水性溶液与水溶性有机溶剂混合以制备混合液的工序；以及，使该混合液与固相材料接触，并使该混合液中的rna吸附于该固相材料的工序，与该固相材料接触之前的该混合液中的该水溶性有机溶剂的最终浓度为39体积％以上且50体积％以下。
具体实施方式
8.关于本说明书中引用的所有的专利文献、非专利文献和其他出版物，其整体在本说明书中作为参考而被引用。
9.在本说明书中，“皮肤表面脂质(skin surface lipids；ssl)”是指存在于皮肤表面的脂溶性成分，有时也被称为皮脂。通常，ssl主要含有位于皮肤的皮脂腺等外分泌腺分泌的分泌物，以覆盖皮肤表面的薄层的形式存在于皮肤表面。
10.在本说明书中，“皮肤”只要没有特别限定，是包含体表的表皮、真皮、毛囊、以及汗腺、皮脂腺和其它腺体等组织的区域的总称。
11.期望来自皮肤表面脂质中(ssl)的rna的产量的提高。本发明涉及一种回收ssl中
所含的rna的方法。
12.本发明人以前发现，在ssl中含有来源于被检测体的皮肤细胞的rna，能够使用其进行生物体的分析，并提出了专利申请(专利文献1)。进一步，本发明人发现，相对于包含从ssl制备的rna的水性溶液添加规定量的水溶性有机溶剂，并与固相材料接触，使该混合液中的rna高效地吸附于该固相材料，由此来自ssl的rna的产量提高。此次，本发明人提供了一种制备来自ssl的rna的方法，该方法能够更高效地回收被检测体的ssl中所含的rna。
13.根据本发明的方法，能够以高产量回收ssl中所含的rna。本发明能增加使用了rna试样的分析(例如基因分析、诊断等)中的rna基因检测数，能提高分析的精度或效率。
14.本发明的方法中的被检测体只要是在皮肤上具有ssl的生物即可。作为被检测体的例子，可以举出包括人和非人哺乳动物的哺乳动物，优选为人。例如，该被检测体可以是需要或希望分析其自身的核酸的人类或非人哺乳动物。或者，该被检测体可以是需要或希望进行皮肤中的基因表达分析、或使用了核酸的分析皮肤或皮肤以外的部位的状态的分析的人或非人哺乳动物。
15.被检测体的ssl包含在该被检测体的皮肤细胞中表达的rna，优选包含在该被检测体的表皮、皮脂腺、毛囊、汗腺和真皮中的任一者中表达的rna，更优选包含在该被检测体的表皮、皮脂腺、毛囊和汗腺中的任一者中表达的rna(参照专利文献1)。因此，通过本发明的方法制备的来自ssl的rna优选为源自选自被检测体的表皮、皮脂腺、毛囊、汗腺及真皮中的至少1个部位的rna，更优选为源自选自表皮、皮脂腺、毛囊及汗腺中的至少1个部位的rna。
16.本发明的方法中制备的来自ssl的rna可以包含mrna、trna、rrna、以及小分子rna(small rna)(例如微rna(microrna(mi rna))、小干扰rna(small interfering rna(sirna))、piwi相互作用rna(piwi-interacting rna(pi rna))等)、长链基因间非编码rna(long intergenic non-coding(linc)rna)等。上述列举的rna的1种或2种以上可包含在ssl中。
17.作为被检测体的被采集ssl的皮肤的部位，可以列举头、脸、颈、躯干、手脚等身体的任意部位的皮肤、患有特异反应性、痤疮、干燥、炎症(发红)、肿瘤等疾病的皮肤、具有创伤的皮肤等，但没有特别限定。
18.在从被检测体的皮肤采集ssl时，可以采用用于从皮肤回收或除去ssl的所有手段。优选使用后述的ssl吸收性原材料、ssl粘接性原材料、或从皮肤擦落ssl的器具。作为ssl吸收性原材料或ssl粘接性原材料，只要是与ssl具有亲和性的原材料就没有特别限定，例如可以举出聚丙烯、纸浆等。作为来自皮肤的ssl的采集顺序的更详细的例子，可以举出：使ssl吸收到吸油纸、吸油膜等片状原材料的方法；使ssl粘接到玻璃板、胶带等上的方法；利用抹刀、刮刀等将ssl擦落而回收的方法等。为了提高ssl的吸附性，也可以使用预先含有脂溶性高的溶剂的ssl吸收性原材料。另一方面，如果ssl吸收性原材料含有水溶性高的溶剂、水分，则ssl的吸附会受到阻碍，因此不优选。ssl吸收性原材料优选在干燥的状态下使用。
19.从被检测体采集的含rna的ssl可以保存到后述的rna制备中使用。该含rna的ssl可以在被ssl吸收性原材料或ssl粘接性原材料吸收或粘接的状态下保存。该含rna的ssl可以在以往一般的rna的保存条件(例如-80℃)下保存，也可以在更温和的条件下保存(国际申请号pct/jp2019/043040)。例如，该含rna的ssl的保存的温度条件只要为0℃以下即可，
优选为-10℃以下，更优选为-20℃以下即可。该保存的期间没有特别限定，优选为12个月以下，更优选为6个月以下，进一步优选为3个月以下。
20.本发明的来自ssl的rna的制备方法包括：从被检测体的ssl制备含有rna的水性溶液的步骤；将含有该rna的水性溶液与水溶性有机溶剂混合以制备混合液的步骤；以及使该混合液与固相材料接触的步骤。可由该固相材料回收目标的来自ssl的rna。本发明中，作为用于制备含有来自ssl的rna的水性溶液的方法，可以列举：使用酸性酚(例如，水饱和酚)和氯仿的混合液的经典的rna提取的酚-氯仿法及其改进方法，例如pci(酚-氯仿-异戊醇(phenol/chloroform/isoamyl alcohol))法、agpc(酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取(acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction))法、预先混合硫氰酸胍和酚的agpc改进方法等，优选为agpc改进方法。
21.在本发明的方法中，含有来自ssl的rna的水性溶液的制备工序基本上按照酚-氯仿法中的来自生物体试样的rna提取工序为准。以下说明具体的工序的例子：向从被检测体采集的ssl(或包含其的ssl吸收性原材料或ssl粘接性原材料)中加入酸性酚进行混合，接着加入氯仿进行混合，由此从该ssl中提取rna。接下来，将所得到的混合液离心分离，分离为含有rna的水层(上层)和酚-氯仿层(下层)(进一步有可能分离出中间层)。通过回收该水层，从该ssl制备含有rna的水性溶液。
22.作为该rna提取中使用的酸性酚，可以单独使用水饱和酚，也可以使用含有酚的试剂混合液。例如，可以将包含硫氰酸胍的市售的rna提取用试剂(例如trizol(注册商标)试剂(reagent)、qiazol裂解试剂(lysis reagent)、isogen等)的、来自生物体试样的rna提取用的试剂液用作含有该酚的试剂混合液。从ssl的rna提取效率的观点出发，优选使用上述那样的市售的rna提取用的试剂液。即，优选通过agpc改进方法进行rna提取。作为该rna提取中使用的氯仿，优选单独使用氯仿，但只要必要量的rna能被分配到水层中，也可以使用含有氯仿的试剂混合液。
23.也可以根据需要将所制备的含有该rna的水性溶液再次与酚和氯仿混合，并进行离心分离而回收水层。也可以将该工序反复进行2次以上。进而，也可以将制备的含有该rna的水性溶液再次与氯仿混合，并进行离心分离而回收水层。也可以将该工序反复进行2次以上。
24.接下来，将得到的含有该rna的水性溶液与水溶性有机溶剂混合。作为该水溶性有机溶剂，可以举出伯醇、仲醇、叔醇等醇类，其中可优选使用甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇及丁醇。丁醇可以是直链状和支链状中的任一种。这些醇类可以单独使用或组合使用2种以上。从降低环境负荷及对操作者的毒性的观点出发，更优选乙醇。此时，含有该rna的水性溶液与该水溶性有机溶剂的混合液(以下，也称为rna-溶剂混合液)中的该水溶性有机溶剂的最终浓度(装载于后述的固相材料，即将接触之前的浓度)为39体积％以上且50体积％以下即可，优选为40体积％以上且46体积％以下，更优选为41体积％以上且45.5体积％以下，进一步优选为42体积％以上且45体积％以下。通过将该混合液中的该水溶性有机溶剂的浓度调整为上述范围，来自ssl的rna的产量提高。另外，在本发明中，体积％是指25℃、1个大气压下的体积％。
25.接下来，从该rna-溶剂混合液中回收rna。rna的回收可以按照使用了固相材料的核酸分离法进行。例如，使水溶性有机溶剂的最终浓度如上所述地调整后得到的该rna-溶
剂混合液与该固相材料接触，从而使该混合液中的rna吸附于该固相材料。接下来，根据需要从该固相材料清洗夹杂物之后，从该固相材料中使rna脱离并回收。
26.作为该固相材料，只要是核酸吸附性的固相材料即可，例如可以举出基于二氧化硅的固相材料。从rna的吸附性的观点出发，该固相材料优选为具有多孔性的二氧化硅膜的固相材料。从容易进行夹杂物的清洗或rna的洗脱的操作的观点出发，该固相材料优选为离心柱(spin column)、带柱的移液管(pipette tube)、或能安装于离心管或移液管的柱筒的形态，进一步从防止污染和操作效率的观点出发，更优选为能够安装于离心柱或离心管的柱筒的形态。进而，若考虑从各个被检测体通过ssl提取的rna的量比较少，则该固相材料优选为小量柱等(miniprep column)能够精制少量rna的形态。作为该固相材料，可以使用市售的rna精制用柱，作为其例子，可以列举rneasy(注册商标)离心柱(giagen)、nucleospin(注册商标)rna柱(takara bio)等。
27.作为用于清洗来自该固相材料的夹杂物的清洗液，可以使用含有水溶性有机溶剂和水溶性盐中的至少一种的溶液(例如水溶液)等。作为该清洗液所含的水溶性有机溶剂，可以使用醇类。作为醇类，可以列举甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和丁醇等。丁醇可以是直链状和支链状中的任意种。这些醇可以并用多种。其中，优选使用乙醇。该清洗液中所含的该水溶性有机溶剂的量只要是能够保持该固相材料上的rna并清洗夹杂物的量即可，本领域技术人员可以适当决定，优选为30～100体积％，更优选为35～50体积％。另一方面，该清洗液所含的水溶性盐优选为卤化物的盐，其中优选为氯化物盐。另外，该水溶性盐优选为一价或二价的阳离子盐，更优选为碱金属盐或碱土金属盐，进一步优选为钠盐和钾盐，另外，优选为钠盐。在清洗液中含有该水溶性盐的情况下，其浓度优选为10mmol/l以上，更优选为20mmol/l以上。另一方面，浓度的上限只要在不损害杂质的溶解性的范围内就没有特别限制，优选为1mol/l以下，更优选为0.1mol/l以下。进一步优选该水溶性盐为氯化钠，该清洗液中的浓度优选为20mmol/l以上。
28.从该固相材料中的rna的脱离优选通过在该固相材料中流通洗脱液，使rna洗脱来进行。作为用于该rna的洗脱的洗脱液，可以使用水、tris-edta(te)缓冲液等。该清洗液以及洗脱液可以使用市售的rna精制用柱所附带的清洗液以及洗脱液。该固相材料的清洗、洗脱可以按照通常的工序进行。例如，在该固相材料安装于离心柱的情况下，在柱中通液rna-溶剂混合液，在吸附有rna的柱中添加清洗液，进行离心而与清洗液一起冲洗夹杂物。接下来，向柱中添加洗脱液，进行离心而使rna从柱中洗脱。
29.根据需要，也可以用dnase对吸附有该rna的固相材料进行处理。通过dnase处理，能够除去混入的dna而提高回收的rna的纯度。该dnase处理优选在该固相材料的清洗与rna洗脱之间进行。
30.从该固相材料洗脱的rna是被检测体的来自ssl的rna，能够用于各种分析。例如，使用oligo(dt)引物将该来自ssl的rna中含有的mrna转换为cdna后，可以用于基因表达分析、转录组(transcriptome)分析等。或者，通过调查被检测体的来自ssl的rna中的靶rna的有无，能够进行该被检测体的功能分析、疾病的诊断、对该被检测体给药的药物的效能评价等。
31.作为本发明的例示性的实施方式，在本说明书中进一步公开以下物质、制造方法、用途、方法等。但是，本发明并不限定于这些实施方式。
32.[1]一种方法，其中，所述方法是来自皮肤表面脂质的rna的制备方法，包括：从被检测体的皮肤表面脂质制备含有rna的水性溶液的工序；将该水性溶液与水溶性有机溶剂混合以制备混合液的工序；以及，使该混合液与固相材料接触、使该混合液中的rna吸附于该固相材料上的工序；与该固相材料接触之前的该混合液中的该水溶性有机溶剂的最终浓度为39体积％以上且50体积％以下。
[0033]
[2]根据[1]所述的方法，其中，上述水溶性有机溶剂优选为醇类，更优选为选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和丁醇中的至少一种。
[0034]
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，上述含有rna的水性溶液的制备优选为基于酚-氯仿法或其改进方法的制备。
[0035]
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，优选上述混合液中的上述水溶性有机溶剂的最终浓度为40体积％以上且46体积％以下，更优选为41体积％以上且45.5体积％以下，更优选为42体积％以上且45体积％以下。
[0036]
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，上述固相材料优选为基于二氧化硅的固相材料，更优选为具有多孔性的二氧化硅膜的固相材料。
[0037]
[6]根据[5]所述的方法，其中，上述固相材料优选为离心柱、带柱的移液管、或能安装于离心管或移液管的柱筒的形态。
[0038]
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，优选还包括从上述固相材料中回收rna的工序。
[0039]
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，优选还包括清洗吸附有上述rna的上述固相材料，接下来使该rna从该固相材料洗脱的工序。
[0040]
[9]根据[8]记载的方法，其中，优选用于上述固相材料的清洗的清洗液是含有选自水溶性有机溶剂及水溶性盐中的至少一种的溶液，该水溶性有机溶剂优选为醇类，更优选为选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和丁醇中的至少一种，该水溶性盐优选为一价或二价的阳离子盐，更优选为碱金属盐或碱土金属盐，进一步优选为钠盐和钾盐，并且优选为氯化物盐，另外优选为氯化钠。
[0041]
[10]根据[9]所述的方法，其中，上述清洗液中的上述水溶性有机溶剂的浓度优选为30～100体积％，更优选为35～50体积％。
[0042]
[11]根据[9]或[10]所述的方法，其中，上述清洗液中的上述水溶性盐的浓度优选为10mmol/l以上且1mol/l以下，更优选为10mmol/l以上且0.1mol/l以下，进一步优选为20mmol/l以上且1mol/l以下，更进一步优选为20mmol/l以上且0.1mol/l以下。
[0043]
[12]根据[8]～[11]中任一项所述的方法，其中，用于从上述固相材料洗脱rna的洗脱液是水或缓冲液。
[0044]
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的方法，其中，上述皮肤表面脂质(ssl)优选包含于ssl吸收性原材料或ssl粘接性原材料中，更优选包含于吸油纸或吸油膜中。
[0045]
[实施例]
[0046]
以下，基于实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明并不限定于此。
[0047]
实施例1从ssl的rna分离-1
[0048]
1)将4名健康男性作为被检测体。使用吸油膜(5
×
8cm，聚丙烯制，3m japan)，从被检测体的全脸上回收皮脂(ssl)。将含有ssl的吸油薄膜切断成适当的大小，将其全部放入
5ml管中，添加qiazol(注册商标)裂解试剂(lysis reagent)(qiagen)1.425ml，充分混合，使rna从薄膜上的皮脂洗脱。向得到的溶液1.3ml中添加氯仿260μl，充分混合后，进行离心(15,000rpm，4℃，15分钟)，将水层(上层)0.7ml作为含有rna的水性溶液进行回收。
[0049]
2)将上述1)中得到的含有4名被检测体的rna的水性溶液混合后，等分为7份，分别与等量的各种浓度的乙醇溶液混合，制备最终乙醇浓度在35～50体积％的范围内的各种混合液。将该混合液的总量通过二氧化硅基柱(rneasy(注册商标)离心柱；qiagen)。之后，按照rneasy(注册商标)附带的操作规程，用试剂盒附带的清洗液清洗色谱柱，接下来用rnase-free水(rnase-free water)洗脱rna，回收洗脱液。另外，在rneasy(注册商标)附带的操作规程中，通过柱的样品溶液的最终乙醇浓度为35体积％。
[0050]
3)所得到的洗脱液中的rna定量使用agilent 4200tapestation系统(agilent technologies)、high sensitivity rna screen tape(agilent technologies)和high sensitivity rna screentape sample buffer(agilent technologies)实施。
[0051]
4)将从上述2)中制备的各种乙醇浓度的混合液中回收的rna的量示于表1。在最终乙醇浓度为40体积％以上的混合液中，与现有操作规程所指示的最终乙醇浓度(35体积％)的混合液相比，rna产量提高。最终乙醇浓度为40～45体积％的混合液中，rna产量更加显著地提高。
[0052]
[表1]
[0053]
混合液的最终乙醇浓度rna产量(ng)35.0体积％1.4137.5体积％1.2540.0体积％2.1442.5体积％2.4145.0体积％2.3547.5体积％1.7850.0体积％1.68
[0054]
实施例2来自ssl的rna分离-2
[0055]
1)将1名健康男性作为被检测体。按照与实施例1的1)同样的工序回收被检测体的来自ssl含有rna的水性溶液。将该水性溶液等分为3份，分别与等量的各种浓度的乙醇溶液混合，制备了最终乙醇浓度为35体积％、42.5体积％、及50体积％的混合液。将该混合液的总量通过二氧化硅基柱(例如nucleospin(注册商标)rna柱；takara bio)。之后，按照nucleospin(注册商标)附带的操作规程，用试剂盒附带的清洗液清洗色谱柱，用rnase-free水洗脱rna，回收洗脱液。另外，在nucleospin(注册商标)附带的操作规程中，通过柱的样品溶液的最终乙醇浓度为35体积％。以与实施例1的3)同样的工序对洗脱液中的rna进行定量。
[0056]
2)将从上述1)中制备的各种乙醇浓度的混合液中回收的rna的量示于表2。在最终乙醇浓度为42.5体积％和50体积％的混合液中，与最终乙醇浓度为35体积％的混合液相比，rna产量显著提高。
[0057]
[表2]
[0058]
混合液的最终乙醇浓度rna产量(ng)
35.0体积％17.142.5体积％95.550.0体积％60.5
[0059]
实施例3由新一代测序仪(sequencer)进行的详尽的基因表达分析
[0060]
1)将含有在实施例1的2)中得到的rna的洗脱液中的、上柱(column apply)时的最终乙醇浓度为35体积％、42.5体积％和50体积％的洗脱液、以及各个洗脱液的4倍稀释溶液用作基因表达分析用的样品。
[0061]
2)分别从含有上述1)的rna的洗脱液及其稀释溶液的各自中，使用superscript vilo cdna synthesis kit(life technologies japan株式会社)在42℃下进行90分钟逆转录，由此合成cdna。逆转录反应的引物使用试剂盒附带的随机引物。从得到的cdna中，通过多重pcr(multiplex polymerase chain reaction)制备含有来源于20802基因的dna的文库(library)。多重pcr是使用ion ampliseq transcriptome human gene expression kit(life technologies japan株式会社)，在[99℃、2分钟
→
(99℃、15秒
→
62℃、16分钟)
×
20个循环
→
4℃、保持]的条件下进行的。将得到的pcr产物用ampure xp(beckman coulter株式会社)精制后，进行缓冲液的再构成、引物序列的消化、接头连接和精制、扩增，制作文库。将制作的文库输入到ion 540chip，使用ion s5/xl系统(life technologies japan株式会社)进行测序。
[0062]
将通过测序检测出的基因数示于表3。检测出的基因数在上柱时的最终乙醇浓度为35体积％的rna洗脱液中为11,463，与此相对，在上柱时的最终乙醇浓度为42.5体积％和50体积％的洗脱液中，分别增加至13,910和13,221。该倾向在rna洗脱液的4倍稀释溶液中更显著，即，来自于上柱时的最终乙醇浓度为35体积％的稀释溶液的检测基因数为8,898，与此相对，来自于上柱时的最终乙醇浓度为42.5体积％和50体积％的稀释溶液的检测基因数分别大幅增加至12,226和11,199，由此可知，显示了本发明的制备方法在可采集的rna量较少的样品的情况下更有利。
[0063]
[表3]
[0064]
技术特征：1.一种制备来自皮肤表面脂质的rna的方法，其中，所述方法包括：从被检测体的皮肤表面脂质制备含有rna的水性溶液的工序；将该水性溶液与水溶性有机溶剂混合以制备混合液的工序；以及，使该混合液与固相材料接触，并使该混合液中的rna吸附于该固相材料的工序，与该固相材料接触之前的该混合液中的该水溶性有机溶剂的最终浓度为39体积％以上且50体积％以下。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述水溶性有机溶剂为选自甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和丁醇中的至少一种。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述含有rna的水性溶液的制备是基于酚-氯仿法或其改进方法的制备。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述水溶性有机溶剂的最终浓度为40体积％以上且46体积％以下。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述固相材料为基于二氧化硅的固相材料。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，还包括从所述固相材料回收rna的工序。
技术总结本发明提供一种回收皮肤表面脂质(SSL)中所含的RNA的方法。该方法为制备来自SSL的RNA的方法。在该方法中，将含有从被检测体的SSL制备的RNA的水性溶液与水溶性有机溶剂混合，使得到的混合液与固相材料接触后，分离RNA。通过调整该混合液中的水溶性有机溶剂的浓度，从而提高RNA的产量。提高RNA的产量。
技术研发人员：桑野哲矢 井上高良
受保护的技术使用者：花王株式会社
技术研发日：2021.03.11
技术公布日：2022/11/1
