一种靶向PD-L1基因的脱氧核酶、靶向递送载体、肿瘤靶向型纳米复合物及其应用

一种靶向pd-l1基因的脱氧核酶、靶向递送载体、肿瘤靶向型纳米复合物及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向pd-l1基因的脱氧核酶、靶向递送载体、肿瘤靶向型纳米复合物其在制备治疗黑色素瘤药物的应用。


背景技术：

2.与直接作用于癌细胞的传统化疗不同，免疫疗法利用病人自身的免疫系统来消灭肿瘤，已成为当今流行的癌症治疗方式。目前主流的癌症免疫疗法包括t细胞疗法、免疫检查点阻断法、癌症疫苗法和免疫调节剂法等。这些癌症免疫疗法通过提高癌症患者的t细胞免疫力来有效对抗肿瘤，特别是针对程序性细胞死亡蛋白1 (programmed cell death 1，pd1)及其配体程序性细胞死亡配体1(programmed celldeath ligand 1，pd-l1)的免疫检查点阻断疗法，已经为黑色素瘤、非小细胞肺癌、晚期肾细胞癌、肝癌等多种癌症提供了临床效益。pd-l1是由cd274基因编码的i型跨膜蛋白，属于b7家族，又称为b7-h1。研究发现，在肺癌、卵巢癌、结肠癌及黑色素瘤等多种肿瘤细胞中，pd-l1的表达均较正常组织明显增高。pd-l1 与t细胞表面的pd-1结合后，促使pd-1的免疫受体酪氨酸转换基序结构域中的酪氨酸发生磷酸化，引起下游脾酪氨酸激酶(syk)和磷酸肌醇-3-激酶(pi3k)的去磷酸化，进而抑制下游蛋白激酶b(akt)、胞外信号调节激酶(erk)等通路的活化，最终抑制t细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译，发挥负向调控t细胞活性的作用。目前多种针对pd-l1/pd-1位点的靶向药物已被研发，阿特丽珠单抗 (atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)等已上市的针对pd-l1的靶向抗体在临床中展现了良好的应用前景。通过阻断pd-1/pd
‑ꢀ
l1信号通路，t细胞可以被重新激活，为抗肿瘤免疫治疗提供了新的策略。
3.脱氧核酶是一种具有高催化活性和稳定性的单链dna分子，能特异性地裂解单链rna中的嘌呤-嘧啶连接的寡核苷酸，催化rna的降解。脱氧核酶具有合成成本低、稳定性高、可编程性、活性高等优点，可以作为一种潜在的治疗分子，抑制肿瘤相关基因的表达。相比于以抗体为代表的免疫检查点封闭疗法，脱氧核酶将高效的催化降解能力与靶向识别能力结合，能够特异地针对靶标从mrna水平阻断靶基因的表达。在早期研究中，靶向血管内皮生长因子受体2(vegfr2) mrna翻译起始位点的脱氧核酶被证明可以抑制乳腺癌在异种移植模型中的生长。针对肿瘤血管生成相关基因的脱氧核酶如dz13等也被发现可抑制多种肿瘤的增殖，并已进入临床试验。然而，由于固有的负电特性，脱氧核酶在生物体内的运输能力不足，细胞的摄取和生物利用度有限。此外，系统性给药也会导致脱靶效应的发生，产生不必要的不良反应。为了解决这些限制，开发传输系统以提高dna酶的治疗效率是至关重要的。
4.本专利为解决靶向pd-l1的脱氧核酶稳定递送，采用聚酰胺-胺型树枝状高分子(polyamidoamine，pamam)衍生物为载体。pamam是一种非病毒性的基因递送载体，与传统的病毒载体相比，其细胞毒性、免疫原性更低，生产更简单。最外层的氨基提供了高密度的阳
10.4.dz4:5
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ctgtgaataggctagctacaacgaaatgccagc-3’11.5.dz5:5
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caccacgtaggctagctacaacgaaagtccttt-3’12.6.dz6:5
’‑
agtacaccaggctagctacaacgataacgcaag-3’13.7.dz7:5
’‑
cctctcctgggctagctacaacgacacaaactg-3’14.8.dz8:5
’‑
agggcagcaggctagctacaacgattcccttca-3’15.9.dz9:5
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gaagggcagggctagctacaacgaatttccctt-3’16.10.dz10:5
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tcagcgtgaggctagctacaacgaacgcttgta-3’17.11.idz4:5
’‑
ctgtgaatggctacctacaacgaaaatgccagc-3’18.12.idz6:5
’‑
agtacaccggctacctacaacgaataacgcaag-3’19.本发明中脱氧核酶稳定性的增强可以通过对结合序列进行化学修饰来实现，在天然磷酸二酯键部分的自由单键氧位置对组成脱氧核酶的磷酸酯基团进行修饰以提高脱氧核酶的抗酸和抗酶降解的能力。本发明的脱氧核酶采用硫代磷酸二酯键修饰，使两个靶基因结合序列各含有2～3个硫代磷酸二酯键。
20.本发明还涉及一种肿瘤靶向递送载体，其是由如下步骤制备得到：
21.(1)将45～55mgpamam(fp，威海晨源分子新材料有限公司，中国)和50～60mg七氟丁酸酐(sigma-aldrich，美国)溶解于6～10ml甲醇中，在室温下搅拌36～50h，然后置于截留分子量为3000～4000da的透析袋中，在去离子水中透析48～72h，袋内的透析产物冷冻干燥过夜，得到氟化修饰pamam载体粉末；
22.(2)取50～60mg步骤(1)得到的氟化修饰pamam载体粉末溶解于2～4mlpbs溶液中，得到溶液a；另取70～80mg的马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(mal-peg
5000-nhs)或甲氧基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(mpeg
5000-nhs)(均购自北京键凯科技有限公司，中国)溶解于2～4ml的pbs溶液中，得到溶液b；混合溶液a和溶液b，室温下搅拌36～50h，然后置于截留分子量为7000～9000da的透析袋中，在去离子水中透析48～72h，袋内的透析产物过夜冷冻干燥，得到mal-peg
5000-fp或mpeg
5000-fp(命名为pfp，作为非靶向型对照载体)粉末；
23.(3)将od
260
为15～30的巯基化适配体as1411(5
′‑
ggtggtggtggttgtggtggtggtggtttttttttt-c6-sh-3
′
，由生工生物工程股份有限公司合成)溶解于4～6mlpbs溶液中，并加入终浓度为8～12mm的三(2-羧乙基)膦(tcep)，然后于室温下搅拌1～2h，得到溶液c；取40～50mg步骤(2)得到的mal-peg
5000-fp粉末溶解于4～6mlpbs溶液中，得到溶液d；混合溶液c和溶液d，室温下搅拌20～30h，然后置于截留分子量为7000～9000da的透析袋中，在去离子水中透析48～72h，袋内的透析产物冷冻干燥过夜，得到的树枝状高分子衍生物即本发明所述的肿瘤靶向递送载体as1411-peg-fp(命名为apfp)粉末。
24.本发明中实现脱氧核酶靶向递送所用载体apfp是一种高效的肿瘤靶向递送载体，且具有较低的细胞毒性。apfp能够借助核酸适配体as1411对肿瘤细胞表面高表达核仁素的识别与结合能力，选择性地将脱氧核酶递送到肿瘤部位，并通过“质子海绵”效应从溶酶体中逃逸出来，实现脱氧核酶的释放与后续切割作用的发挥。
25.本发明还涉及一种担载脱氧核酶分子的肿瘤靶向型纳米复合物，其是由如下步骤制备得到：将靶向pd-l1基因的脱氧核酶分子(dz1～dz10)粉末与apfp粉末以1：20～100的质量比例溶于无核酸酶水(thermofisherscientific，美国)中并混匀，然后在0～40℃下孵育20～40min，即得到担载脱氧核酶分子的肿瘤靶向型纳米复合物apfp/dz1～10。
26.本发明所构建的担载脱氧核酶分子的肿瘤靶向型纳米复合物具备精准的肿瘤细胞靶向性，靶向pd-l1基因的脱氧核酶分子(dz1～dz10)高效切割pd-l1基因的活性与化学稳定性。以黑色素瘤肺转移小鼠为肿瘤模型进行给药，该体系能够实现对黑色素瘤细胞pd-l1表达的抑制，从而激活cd8
+ t细胞对肿瘤细胞的杀伤，抑制小鼠黑色素瘤的发展。
27.综上，本发明通过对pd-l1基因mrna二级结构进行模拟，设计并筛选出具有高效靶基因识别和切割活性的靶向pd-l1基因的脱氧核酶分子(dz1～dz10)；再对树枝状聚合物pamam进行一系列修饰获得细胞毒性低、转染效率高的肿瘤靶向递送载体apfp；将脱氧核酶分子(dz1～dz10)和肿瘤靶向递送载体apfp进行静电组装制备肿瘤靶向型纳米复合物，实现了对黑色素瘤细胞pd-l1基因表达的有效抑制。借助apfp载体，dz1～dz10在黑色素瘤肺转移小鼠体内实现了肿瘤部位的精准递送，显著抑制肿瘤细胞pd-l1的表达，成功激活了cd8
+ t细胞的肿瘤杀伤活性，从而延缓了小鼠转移性黑色素瘤的进展，为黑色素瘤免疫治疗提供了新的策略，进而本发明所述的靶向pd-l1基因的脱氧核酶分子(dz1～dz10)、肿瘤靶向递送载体apfp、担载脱氧核酶分子的肿瘤靶向型纳米复合物apfp/dz1～10可以用于制备治疗黑色素瘤的药物。
附图说明
28.图1：靶基因pd-l1 mrna的二级结构模拟图。
29.图2：脱氧核酶处理后小鼠黑色素瘤细胞b16f10的pd-l1 mrna表达相对定量图。
30.图3：脱氧核酶处理后小鼠黑色素瘤细胞b16f10的pd-l1蛋白表达图。
31.图4：肿瘤靶向型载体apfp的400mhz 1
h nmr谱图。
32.图5：fp和apfp载体对小鼠黑色素瘤细胞b16f10的细胞毒性示意图。
33.图6：不同n/p比下fp/dz、pfp/dz和apfp/dz纳米复合物的粒径和电位分析图。
34.图7：n/p比为20.0时pfp/dz和apfp/dz纳米复合物的透射电镜图。
35.图8：apfp/dz4纳米复合物对小鼠黑色素瘤细胞b16f10靶向性检测的荧光显微镜图。
36.图9：apfp/dz4纳米复合物处理后小鼠黑色素瘤细胞b16f10的pd-l1 mrna 表达相对定量图。*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
37.图10：apfp/dz4纳米复合物处理后小鼠黑色素瘤细胞b16f10的pd-l1蛋白表达图。
38.图11：apfp/dz4纳米复合物处理小鼠黑色素瘤细胞b16f10与cd8
+ t细胞共培养体系中cfse法检测cd8
+ t细胞增殖情况的流式图。
39.图12：mtt法检测apfp/dz4纳米复合物处理小鼠黑色素瘤细胞b16f10与 cd8
+ t细胞共培养体系中b16f10细胞活力相对定量图。ns表示无显著差异，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
40.图13：elisa法检测apfp/dz4纳米复合物处理小鼠黑色素瘤细胞b16f10与 cd8
+ t细胞共培养体系上清中免疫相关细胞因子ifn-γ(a)、il-2(b)及tnf-α (c)的定量图。ns表示无显著差异，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示 p《0.001。
41.图14：apfp/cy5-dz4纳米复合物在黑色素瘤肺转移小鼠体内各脏器分布图。
42.图15：黑色素瘤肺转移小鼠模型建立与给药流程图。
43.图16：不同治疗21天后黑色素瘤肺转移小鼠肺部图像
fisherscientific，美国)(完全培养基)，37℃、5％(v/v)co2培养箱中培养过夜。靶向pd-l1的sirna作为阳性对照(正义链：5
’‑
agacguaagcaguguugaadtsdt-3’；反义链：5
’‑
uucaacacugcuuacgucudtsdt-3’，由上海吉玛制药技术有限公司合成)，将商业化转染试剂聚乙烯亚胺(pei25k)(sigma-aldrich，美国)与脱氧核酶(dz1～dz10)或sirna以质量比为1.33：1的比例混合，37℃下孵育30min，加入细胞培养体系中，使脱氧核酶在培养基中终浓度为3μg/ml，sirna浓度为100nm。另设仅存在细胞而不加药组为阴性对照组，即control组。在无血清dmem培养基中培养6h，接着在dmem完全培养基中继续培养48h。收集细胞，trnzoluniversal总rna提取试剂(天根生化科技有限公司，中国)对各组细胞进行裂解，按照试剂盒说明方法提取细胞总rna。取1μg总rna，利用反转录primescriptrtreagent试剂盒(takara，日本)进行反转录以获取cdna。染料法荧光定量sybrspremixextaq试剂盒(takara，日本)被用于检测各组cdna中pd-l1mrna表达，加入cdna、试剂盒中premixextaqtm、roxreferencedyeii及相应引物后，加水补至20μl体系，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qrt-rcr)仪对各组样品的循环数(ct)值进行检测。以β-肌动蛋白(β-actin)的ct值为基准，采用2-δδct法计算pd-l1mrna表达量。相应mrna扩增引物序列如下(由生工生物工程股份有限公司合成)：
67.β-actin：正向引物：5
’‑
agtgtgacgttgacatccgt-3’；
68.反向引物：5
’‑
gcagctcagtaacagtccgc-3’。
69.pd-l1：正向引物：5
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gggttctcttcttcctgacgacc-3’；
70.反向引物：5
’‑
caccttcaccgttccagttt-3’。
71.结果如图2所示，与control组相比，单独的pei25k转染试剂未对pd-l1表达水平造成影响，而十条脱氧核酶的转染均不同程度地降低了b16f10细胞pd-l1的表达，其中，dz4组转染效果最为显著，其pd-l1表达水平略低于sirna转染组，表明dz4具有较高的pd-l1切割活性，能够有效降低肿瘤细胞中pd-l1的表达，其效果略优于pd-l1靶向sirna。
72.实施例3
73.利用蛋白质印迹法检测经脱氧核酶处理后小鼠黑色素瘤细胞b16f10的pd-l1蛋白表达情况。如实施例2中方法分别向小鼠黑色素瘤细胞b16f10中转染靶向pd-l1的sirna、dz4以及无义脱氧核酶idz4，继续培养48h。收集处理后细胞，用加入蛋白酶抑复合物苯甲基磺酰氟(pmsf)的放射免疫沉淀试验(radio-immunoprecipitationassay,ripa)裂解液在冰上对细胞进行裂解，每15min轻弹以混匀，持续裂解1h，提取细胞总蛋白并用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninicacid,bca)法进行蛋白定量。向样品中加入5
×
十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，sds)上样缓冲液，100℃下变性处理15min。所得蛋白样品在12％(m/m)sds聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并以300ma恒流冰浴3h转移到聚偏氟乙烯(poly(1,1-difluoroethylene),pvdf)膜上。将脱脂奶粉溶于含有0.1％(v/v)吐温-20的磷酸缓冲盐溶液(phosphatebufferedsaline，pbs溶液)中，使奶粉最终质量浓度为5％，用该溶液在常温下对附有蛋白的pvdf膜封闭2h，以去除蛋白的非特异性结合。抗体以含有质量分数为3％牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,bsa)的pbs溶液稀释至适当比例(pd-l11：1000；β-actin1：5000，购自美国abcam公司)，4℃摇动孵育过夜。以含有0.1％(v/v)吐温-20的pbs溶液清洗三次后，加入对应种属的辣根过氧化物酶(horseradish
peroxidase,hrp)标记二抗，室温孵育1h。再次以含有0.1％吐温-20(v/v)的pbs溶液清洗三次后，用增强型化学发光试剂盒对膜进行显影并拍照。
74.如图3所示，本发明所制备的脱氧核酶分子dz4在蛋白水平上降低了pd-l1的表达，其效果优于靶向pd-l1的sirna处理组。而转染无义脱氧核酶idz4的细胞未见pd-l1蛋白表达水平的降低，说明脱氧核酶的作用发挥依赖于特定的靶向结合序列与目的基因的结合，本发明所设计的脱氧核酶dz4能够特异性且高效地抑制黑色素瘤细胞b16f10中pd-l1蛋白的表达。
75.实施例4
76.脱氧核酶靶向递送载体apfp制备过程：将50mg pamam(威海晨源分子新材料有限公司，中国)和54.12mg的七氟丁酸酐(sigma-aldrich，美国)溶解于8 ml甲醇溶液，在室温下搅拌48h，将混合物置于截留分子量为3500da的透析袋中，在去离子水中透析72h，冷冻干燥过夜成粉末，所得产物即氟化修饰载体fp。取50mg fp粉末溶解于2ml pbs溶液中，另取75mg的mal-peg
5000-fp溶解于2 ml pbs溶液中，混合两种溶液，室温下搅拌48h，将混合物置于截留分子量为 8000da的透析袋中，在去离子水中透析72h，冷冻干燥过夜成粉末，所得产物即 peg修饰载体mal-peg-fp。将od
260
为20的巯基化适配体as1411溶解于4mlpbs 溶液中，并加入终浓度为10mm的tcep室温搅拌1h，另取48mg peg修饰载体 mal-peg-fp溶解于4ml pbs溶液中，将两种溶液混合并于室温搅拌24h后置于截留分子量为8000da的透析袋中，在去离子水中透析72h，冷冻干燥过夜成粉末，即为本发明所述的肿瘤靶向递送载体as1411-peg-fp，命名为apfp。另外，在上述方法中，加入单端mpeg
5000-nhs而不加入双功能mal-peg
5000-nhs，且未与as1411交联制备非靶向性peg修饰载体，命名为pfp。
77.对上述方法制备的载体apfp进行结构表征，具体过程如下：将冻干后的 apfp溶解于d2o中，在400mhz下利用1h nmr分析产物结构。结果如图4所示，在δ＝2.28(-nch2ch2co-)；2.49(-conhch2ch2nh2)；2.68(
‑ꢀ
conhchch2n-)；2.92(-nch2ch2co-)；3.16(-conhch2ch2n-)和3.32(
‑ꢀ
conhch2ch2nh
2-)处能够观察到fp分子的结构特征峰，同时，在δ＝3.58ppm处存在一个明显的peg特征峰，证明peg在fp分子表面的成功修饰。
78.实施例5
79.apfp及fp载体毒性检测过程如下：以7
×
103个细胞/孔的密度将小鼠黑色素瘤细胞b16f10接种到96孔板中，每孔中加入200μl dmem完全培养基，37℃、5％(v/v)co2培养箱中培养过夜。细胞汇合度到达70％时，将培养基更换为仅含有不同浓度的apfp或fp载体(0～160μg/ml)的dmem培养基，另设阴性对照组 control组(仅加入dmem培养基)和空白对照组blank组，每组设6个复孔。继续培养48h后向每孔加入20μl噻唑蓝(mtt)溶液(5mg/ml)，于37℃条件下孵育4h，弃去培养基。每孔加入200μl二甲基亚砜(dmso)并振荡3min以充分溶解甲臜结晶，记录各孔490nm下的吸光度(od)值。细胞存活率计算公式如下：
80.细胞存活率(％)＝(a
sample-a
blank
)/(a
control-a
blank
)
×
100％
81.其中，a
sample
分别为加入不同浓度apfp或fp载体后测定的od值，a
control
为用dmem培养基正常培养细胞后测定的od值，a
blank
为无细胞仅加入dmem细胞培养基后测定的od值。
82.如图5所示，随着fp载体浓度的增高，对小鼠黑色素瘤细胞b16f10的增殖抑制作用也明显增高，而修饰后的apfp载体在各浓度下都未见显著的细胞毒性，在浓度为160μg/ml时细胞存活率仍高于75％。上述结果表明本发明所制备的apfp 载体具有较低的细胞毒性。
83.实施例6
84.fp/dz4，pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物的粒径和电位分析：分别取10μl 浓度为1μg/μl的脱氧核酶水溶液与不同浓度的fp、pfp或apfp水溶液混合，并在37℃下孵育30min，即得到不同n/p比的fp/dz4，pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物。取20μg不同n/p比的fp/dz4，pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物分别溶于超纯水中，使每种样品在水中的终浓度为20μg/ml，采用zetasizer nano zs90粒度电位仪(malvern，英国)分别对三种纳米复合物的粒径与电位进行分析。
85.如图6所示，fp/dz4，pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物的正电荷依次递减，这种电荷的降低是由peg和适配体as1411的修饰引起的，同时也能够降低载体对细胞的毒性。由于载体自身的正电性，随载体比例升高，各纳米复合物的正电性均呈现上升趋势。因较高的正电性，随fp比例升高，fp/dz4纳米复合物的体积被进一步压缩，呈逐渐缩小的趋势；而对于pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物，由于 peg及as1411的修饰削弱了载体的正电性，体积有所增加，且随载体比例升高而更加显著。在n/p比为20.0时，apfp/dz4纳米复合物的粒径在200nm左右，电位约为+10mv,因此该比例为本发明中脱氧核酶dz4与肿瘤靶向递送载体apfp转染的最优比例。
86.实施例7
87.透射电镜检测pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物形貌：取10μl实施例6中制备的n/p比为20.0的pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物，分别滴于300目碳膜覆盖的铜网上，并于室温下晾干。用jem-2100透射电镜(日本电子株式会社)在加速电压为200kv的条件下对涂有纳米复合物的铜网进行检测与拍摄。
88.如图7所示，pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物均呈均匀的球形结构，粒径约为200nm，表明pfp及apfp载体均能够有效结合与压缩dz4，并形成稳定的纳米粒子。
89.实施例8
90.荧光显微镜验证apfp载体的肿瘤细胞靶向性：以2
×
105个细胞/孔的密度将小鼠黑色素瘤细胞b16f10或小鼠成纤维细胞nih-3t3(长期保存于本实验室)接种到6孔板中，每孔中加入2ml完全培养基，37℃、5％(v/v)co2培养箱中培养过夜。待细胞汇合度达到70％后，加入游离的核酸适配体as1411(5
′‑ꢀ
ggtggtggtggttgtggtggtggtggtttttttttt-3
′
，由生工生物工程股份有限公司合成)(0.25od260/孔)继续培养1h以遮蔽细胞膜表面核仁素。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(fam)标记的dz4由生工生物股份有限公司合成，记为fam
‑ꢀ
dz4。用fam-dz4如实施例6中所述方法制备荧光标记pfp/fam-dz4或 apfp/fam-dz4纳米复合物(n/p比为20.0)，加入无血清dmem培养基中并替换原有细胞培养基，使培养基中脱氧核酶的浓度为3μg/ml。孵育细胞6h后，在 ix73p1f荧光显微镜(olympus，日本)下观察细胞的荧光定位情况。
91.如图8所示，相对于游离dz4组，apfp/dz4或pfp/dz4复合物处理组细胞呈现明显的绿色荧光，其中apfp/dz4复合物处理组荧光强度显著高于pfp/dz4复合物处理组，表明apfp载体对b16f10细胞具有较高的靶向性，相比于非靶向性载体pfp，apfp载体能够更高效地实现dz4的肿瘤细胞内递送。值得注意的是，当 b16f10细胞表面核仁素被游离核酸适配体as1411遮蔽后，apfp/dz4复合物处理组细胞荧光强度显著降低，而pfp/dz4复合物处理组荧光强度未见明显变化，证明 apfp载体的肿瘤靶向性增强应归功于适配体as1411的成功修
饰。同时，对于nih-3t3细胞进行相同实验操作，apfp/dz4复合物与pfp/dz4复合物处理组细胞荧光强度相近，均弱于apfp/dz4复合物处理后b16f10细胞，表明apfp与pfp载体在nih-3t3细胞中均具有一定的转染能力，但由于nih-3t3细胞表面核仁素的低表达，apfp载体未对其体现靶向性优势。此外，游离as1411的遮蔽未对apfp/dz4复合物和pfp/dz4复合物处理组细胞的荧光强度产生影响，进一步证实了apfp载体对于正常细胞不具备特异性靶向能力。综上，本发明所制备的apfp载体对b16f10细胞具有较高的靶向性，相比于pfp载体能够更高效地将dz4递送进入肿瘤细胞中。
92.实施例9
93.以2
×
105个细胞/孔的密度将小鼠黑色素瘤细胞b16f10接种到6孔板中，每孔中加入2ml完全培养基，5％(v/v)co2培养箱中培养过夜。待细胞汇合度达到70％后，如实施例6中所述方法制备荧光标记pfp/dz4或apfp/dz4纳米复合物(n/p比为20.0)，加入无血清dmem培养基中并替换原有细胞培养基，使加药后培养基中脱氧核酶的浓度为3μg/ml。孵育细胞6h后，换为完全培养基继续培养48h。如实施例2中方式提取细胞rna，并利用qrt-pcr法检测细胞pd-l1mrna表达水平。
94.结果如图9所示，相对于control组、游离dz4组和无义脱氧核酶idz4处理组，pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物处理组均显著降低小鼠黑色素瘤细胞b16f10的pd-l1mrna表达，且apfp/dz4纳米复合物处理组效果略优于pfp/dz4纳米复合物处理组，得益于适配体as1411所带来的肿瘤靶向性。另外，如实施例3中方式提取细胞总蛋白，并利用蛋白质印迹法对细胞pd-l1蛋白表达水平进行检测，结果如图10所示，与mrna表达水平相似，pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物处理组的细胞pd-l1蛋白表达量均低于其他组别。由此可见，本发明所制备的apfp/dz4纳米复合物能够在肿瘤细胞中靶向降解pd-l1mrna，有效抑制肿瘤细胞pd-l1表达。
95.实施例10
96.采用来源于小鼠脾脏的cd8
+
t细胞与小鼠黑色素瘤细胞b16f10共培养，以检测dz4的递送对b16f10细胞pd-l1表达及免疫相关细胞功能的影响。小鼠脾脏来源cd8
+
t细胞获取、培养及激活方式如下：
97.脱颈处死6月龄雌性c57bl/6小鼠1只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，立即在75％(v/v)乙醇溶液中浸泡5min，用无菌镊子取出小鼠脾脏，放入预冷的含有2％(v/v)胎牛血清的hanks平衡盐溶液(hbss)的培养皿中，剪去多余的结缔组织和脂肪，用无菌注射器末端轻轻研磨至乳糜状液体，经70μm的细胞过滤器过滤后得到小鼠脾脏单细胞悬液，300g下离心10min，弃去上清，然后用含有2％(v/v)胎牛血清和1mm乙二胺四乙酸(edta)的hbss溶液重悬，使其终密度为1
×
108个细胞/ml。按照小鼠cd8
+
t细胞分离试剂盒(stemcell，加拿大)说明书进行操作，对所得细胞进行分选，分离出的细胞即为小鼠脾脏来源cd8
+
t细胞。向6孔板中加入含有1μg/mlcd3抗体和3μg/mlcd28抗体(thermofisherscientific，美国)的无菌pbs溶液2ml/孔，37℃下孵育2h后，移除孔内pbs溶液，即得到cd3抗体和cd28抗体包被6孔板。用含10％(v/v)胎牛血清和2mml-谷氨酰胺的rpmi-1640培养基(thermofisherscientific，美国)将cd8
+
t细胞按3
×
106个细胞/ml密度重悬，加入经抗体包被的6孔板中，并向培养基中加入100ng/ml的重组小鼠白介素-2(peprotech，美国)，孵育1-3天，即获得活化的cd8
+
t细胞。
98.以2
×
105个细胞/孔的密度将小鼠黑色素瘤细胞b16f10接种到6孔板中，每孔中加入2ml完全培养基，37℃、5％(v/v)co2培养箱中培养过夜。细胞汇合度到达70％时，如实施例6中所述方法制备pfp/dz4或apfp/dz4纳米复合物(n/p比为20.0)，加入无血清dmem培养基中并替换原有细胞培养基，使加药后培养基中脱氧核酶的浓度为3μg/ml。孵育细胞6h后，换为完全培养基继续培养48h。使用celltrace羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(cfse)细胞增殖试剂盒(thermofisherscientific，美国)通过cfse稀释测定法确定t细胞增殖：将活化的cd8
+
t细胞与cfse染料(重悬于dmso中的浓度为5mm)在37℃的无血清rpmi-1640培养基中孵育20min(使其终浓度为5μm)，然后添加等体积的新鲜无血清rpmi-1640培养基。将细胞重悬于含有10％(v/v)血清的rpmi-1640培养基中，与处理过的b16f10细胞以10:1比例共培养48h，通过流式细胞术分析cfse标记细胞的荧光表达。
99.结果如图11所示，相对于其他各组，pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物处理组cd8
+
t细胞增殖均显著增加，且apfp/dz4纳米复合物处理组cd8
+
t细胞增殖最为明显。肿瘤细胞表面表达的pd-l1与cd8
+
t细胞表面pd-1结合后可以触发多种免疫抑制机制，抑制cd8
+
t细胞增殖及活化，而pd-l1表达的降低可以在一定程度上解除这种抑制。因此，本发明所制备的apfp/dz4纳米复合物能够通过实现dz4的肿瘤细胞靶向递送降低肿瘤细胞pd-l1表达，从而恢复cd8
+
t细胞的增殖能力。
100.实施例11
101.以6
×
103个细胞/孔的密度将小鼠黑色素瘤细胞b16f10接种到96孔板中，每孔中加入200μl完全培养基，37℃、5％(v/v)co2培养箱中培养过夜。细胞汇合度到达70％时，如实施例6所述方法制备pfp/dz4或apfp/dz4纳米复合物(n/p比为20.0)，加入无血清dmem培养基中并替换原有细胞培养基，使加药后培养基中脱氧核酶的浓度为3μg/ml。孵育细胞6h后，换为完全培养基继续培养48h。如实施例10所述方法获取活化的cd8
+
t细胞，将cd8
+
t细胞重悬于含有10％(v/v)血清的rpmi-1640培养基中，与处理过的肿瘤细胞以10:1比例共培养，另设对应的不加入cd8
+
t细胞的肿瘤细胞单独培养组，每组设6个复孔，继续培养48h。轻柔移除上清及悬浮的cd8
+
t细胞，替换为无血清dmem培养基，向每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，于37℃条件下孵育4h，弃去培养基。每孔加入200μldmso并振荡3min以充分溶解甲臜结晶，记录各孔490nm下的od值。细胞活力计算公式如下：
102.细胞活力(％)＝(a
共培养孔-a
空白孔
)/(a
单独培养孔-a
空白孔
)
×
100％
103.其中，a
共培养孔
为经不同纳米复合物处理的肿瘤细胞与cd8
+
t细胞共同培养并去除cd8
+
t细胞后测定的od值，a
单独培养孔
为经不同纳米复合物处理的肿瘤细胞单独培养后测定的od值，a
空白孔
为无细胞仅加入dmem细胞培养基后测定的od值。
104.如图12所示，相对于其他组，pfp/dz4和apfp/dz4纳米复合物处理组细胞活力明显降低，表明dz4的肿瘤靶向递送能够有效增加cd8
+
t细胞对肿瘤细胞的杀伤。
105.实施例12
106.如实施例11所述方法进行肿瘤细胞与cd8
+
t细胞的共培养，收集培养上清。根据酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)试剂盒(生工生物工程股份有限公司，上海)说明书要求，测定共培养上清中的肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、干扰素-γ(ifn-γ)以及白介素-2(il-2)的含量。具体流程如下：向预先包被了相应一抗的酶标孔中，加入标准品和培养上清样本，孵育后，加入生物素标记的对应二抗。再与hrp标记的链霉
亲和素结合，形成免疫纳米复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入显色底物四甲基联苯胺，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。最后，在450nm处测定反应孔样品od值，样本中的细胞因子浓度与od值成正比，通过绘制标准曲线计算出样本中细胞因子的浓度。
107.如图13所示，pfp/dz4及apfp/dz4纳米复合物处理后的肿瘤细胞能够刺激 cd8
+ t细胞免疫相关细胞因子的分泌，且apfp/dz4纳米复合物的刺激效果略为明显，表明dz4的肿瘤靶向递送能够实现cd8
+ t细胞的有效激活。
108.实施例13
109.通过检测药物在黑色素瘤肺转移小鼠体内分布情况验证apfp/dz纳米复合物的肿瘤靶向性：自北京维通利华实验动物技术有限公司购买6月龄雌性c57bl/6小鼠若干，以每只小鼠6.0
×
105个细胞的剂量通过尾静脉注射b16f10细胞悬液，以构建小鼠黑色素瘤肺转移模型。21天后，随机选取9只小鼠，平均分为3组：游离 dz4、pfp/dz4和apfp/dz4组。合成cy5荧光标记脱氧核酶cy5-dz4(由生工生物工程股份有限公司合成)，并按照实施例6所述方式制备pfp/cy5-dz4和apfp/cy5
‑ꢀ
dz4纳米复合物(n/p比为20.0)，通过尾静脉注射给药，给药剂量以cy5-dz4为 0.5mg/kg小鼠体重计算。在1h、4h、24h三个时间节点，分别从每组各取出1只小鼠处死，解剖取出心、肝、脾、肺和肾组织，通过小动物活体成像系统ivisspectrum(caliper life sciences，美国)进行脏器成像，观察药物在小鼠各脏器中的分布情况。
110.如图14所示，注射1h后，药物随血液循环分布到各个脏器，pfp/cy5-dz4和 apfp/cy5-dz4组小鼠肺部可见较强的cy5-dz4荧光信号，表明在系统性给药1h 时，pfp/cy5-dz4和apfp/cy5-dz4可迅速富集在肿瘤部位。得益于适配体as1411 所提供的肿瘤靶向作用，apfp/cy5-dz4在小鼠肺部的富集更为明显，且在注射后 4h和24h时小鼠肺部仍保持较强的荧光信号，表明apfp/dz4纳米复合物可以准确且高效地在肿瘤部位富集，为后续作用的发挥提供了良好的基础。
111.实施例14
112.购买6月龄雌性c57bl/6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)若干，构建黑色素瘤肺转移小鼠模型，构建过程及给药流程如图15所示，以每只小鼠 6.0
×
105个细胞的剂量通过尾静脉注射b16f10细胞悬液，以构建小鼠黑色素瘤肺转移模型。将种瘤后小鼠随机分为5组：control组(仅注射生理盐水)、apfp/sirna 组、pfp/dz4组、apfp/dz4组和apfp/idz4组，同时设立由健康小鼠组成的正常对照组(记为normal组)，每组6只小鼠。从注射肿瘤细胞后第6天开始，每三天通过尾静脉注射给药一次(给药剂量以dz4为0.5mg/kg小鼠体重计算)，共给药五次。最后一次给药后的第三天，所有小鼠被处死，解剖并取出小鼠主要脏器，观察小鼠肺部肿瘤分布情况。
113.结果如图16所示，相对于control组和apfp/idz4组，apfp/sirna组、 pfp/dz4组、apfp/dz4组小鼠肺部肿瘤结节均显著减少。相对于pfp/dz4组， apfp/dz4组小鼠的肺部肿瘤生长抑制更为明显，达到与apfp/sirna组相近的治疗效果，也说明了apfp载体能够靶向地将脱氧核酶dz4递送到小鼠肺部肿瘤部位，dz4对靶基因pd-l1的特异性切割达到抑制肿瘤生长的效果，其作用效果达到与sirna相近水平。
114.实施例15
115.通过流式细胞术对肿瘤组织浸润淋巴细胞进行分析：分离实施例14中各组小鼠肺部肿瘤组织，用眼科剪剪成匀浆状，再加入含有1mg/ml胶原酶iv(北京金泰宏达生物科技有限公司，中国)以及10μl/mldna酶i(neb，英国)的hbss溶液中，37℃下孵育2h对其进行消化。消化后的细胞悬液经70μm细胞滤网过滤去除细胞团块，小心叠加在淋巴细胞分离液(索莱宝，中国)的液面上(比例为1:1)，室温下500-900g离心20min。吸取环状乳白色淋巴细胞层放入含4-5ml细胞洗涤液的试管中，充分混匀后，以500g离心20min。沉淀经2次洗涤后即得肿瘤组织浸润淋巴细胞。将所得细胞在含有2％(v/v)胎牛血清的pbs溶液中重悬，使其细胞密度为1
×
10
5-108个/ml，用apc-cd3、fitc-cd4及pe-cd8荧光标记抗体(ebioscience，美国)对所得细胞进行染色，流式细胞仪分析染色情况。
116.结果如图17及图3、19a所示，cd3+细胞代表肿瘤部位t细胞总量，相对于对照组及apfp/idz4组，apfp/sirna、pfp/dz4及apfp/dz4复合物治疗组小鼠肿瘤组织中t细胞总量略有增加。在cd3
+
细胞群体中进一步分析cd4
+
t细胞及cd8
+
t细胞数量，如图18所示，可见在apfp/sirna、pfp/dz4及apfp/dz4复合物治疗组中，代表细胞毒性t细胞的cd8
+
t细胞浸润程度明显升高。对两种细胞比值的定量结果(图19b)显示，cd8
+
t细胞/cd4
+
t细胞值在apfp/sirna、pfp/dz4及apfp/dz4复合物治疗组中显著增加，表明这三种复合物的治疗促使肿瘤部位t细胞趋向于分化为细胞毒性t细胞，而这种趋向性往往代表着局部免疫系统的激活以及对肿瘤细胞杀伤能力的增强。其中，apfp/dz4治疗组相对于pfp/dz4组体现了更多的cd8
+
t细胞浸润，与apfp/sirna组水平相近，这一结果也与之前肿瘤生长的抑制程度相一致，表明apfp/dz4的治疗能够实现dz4的肿瘤靶向递送，从而增加肿瘤部位细胞毒性t细胞的募集和浸润来达到抗肿瘤疗效。
117.实施例16
118.免疫组织化学染色检测小鼠肺部肿瘤组织免疫相关指标表达：取实施例14中小鼠肺部肿瘤组织，在4％(m/m)多聚甲醛溶液中固定，并用石蜡进行包埋。将石蜡包埋好的组织用切片机切成4μm厚的薄片，放入水中展平后贴在载玻片上，在60℃恒温箱中烘干后进行免疫组织化学染色。依次用二甲苯溶液、100％、95％和85％(v/v)乙醇溶液及蒸馏水对切片进行脱蜡处理。用edta抗原修复液对脱蜡后肿瘤组织切片进行热抗原修复，随后在组织表面滴3％(m/m)的过氧化氢溶液，室温孵育15min。将切片置于湿盒中，滴加封闭山羊血清(索莱宝，中国北京)，37℃封闭30min。向组织滴加稀释比例为1:500的一抗溶液(抗pd-l1、抗cd8和抗颗粒酶-b，购自abcam，美国)，4℃湿盒中孵育过夜。pbs缓冲液清洗3次，滴加hrp标记二抗，室温孵育50min。最后，切片用即时配置的显色剂二氨基联苯胺(dab)染色10min，并用苏木精染液复染。在显微镜下进行观察并拍摄。
119.结果如图20所示，apfp/dz4组pd-l1阳性细胞相对于其他组明显减少，达到与apfp/sirna组相当的水平，表明apfp/dz4纳米复合物有效地降低了肿瘤部位pd-l1的表达。此外，对于cd8表达的检测也表明了apfp/dz4组肿瘤组织cd8
+
t细胞浸润的增多，由cd8
+
t细胞释放的颗粒酶-b(granzyme-b)也在apfp/dz4组出现了相应的表达水平升高。由此可见，apfp/dz4纳米复合物的治疗能够实现dz4的肿瘤靶向递送，从而激活肿瘤部位免疫反应，利用机体自身免疫能力实现对肿瘤细胞的杀伤。
120.实施例17
121.取实施例14中小鼠肺部肿瘤组织，利用组织匀浆器对其进行匀浆，根据elisa试
剂盒说明书要求，测定肿瘤组织匀浆中免疫相关细胞因子tnf-α、ifn-γ以及il-2的含量。具体流程如下：向预先包被了相应一抗的酶标孔中，加入标准品和肿瘤组织匀浆样本，温育后，加入生物素标记的对应二抗。再与hrp标记的链霉亲和素结合，形成免疫纳米复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入显色底物tmb，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。最后，在450nm处测定反应孔样品od值，样本中的细胞因子浓度与od值成正比，通过绘制标准曲线计算出样本中细胞因子的浓度。
122.结果如图18所示，相对于其他各组，apfp/dz4组肿瘤组织中免疫相关细胞因子水平明显升高，与apfp/sirna组水平相当，表明apfp/dz4纳米复合物的治疗能够实现dz4的肿瘤靶向递送，促进了免疫相关细胞因子的分泌，进而提高cd8
+
t细胞的增殖与杀伤能力。

技术特征：
1.一种靶向pd-l1基因的脱氧核酶分子，其核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10之一所示。2.一种肿瘤靶向递送载体，其是由如下步骤所述方法制备得到：(1)将45～55mg pamam和50～60mg七氟丁酸酐溶解于6～10ml甲醇中，在室温下搅拌36～50h，然后置于截留分子量为3000～4000da的透析袋中，在去离子水中透析48～72h，袋内的透析产物冷冻干燥过夜，得到氟化修饰pamam载体粉末；(2)取50～60mg步骤(1)得到的氟化修饰pamam载体粉末溶解于2～4ml pbs溶液中，得到溶液a；另取70～80mg的马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯mal-peg
5000-nhs溶解于2～4ml的pbs溶液中，得到溶液b；混合溶液a和溶液b，室温下搅拌36～50h，然后置于截留分子量为7000～9000da的透析袋中，在去离子水中透析48～72h，袋内的透析产物过夜冷冻干燥，得到mal-peg
5000-fp粉末；(3)将od
260
为15～30的巯基化适配体as1411溶解于4～6ml pbs溶液中，并加入终浓度为8～12mm的三(2-羧乙基)膦，然后于室温下搅拌1～2h，得到溶液c；取40～50mg步骤(2)得到的mal-peg
5000-fp粉末溶解于4～6ml pbs溶液中，得到溶液d；混合溶液c和溶液d，室温下搅拌20～30h，然后置于截留分子量为7000～9000da的透析袋中，在去离子水中透析48～72h，袋内的透析产物冷冻干燥过夜，得到的树枝状高分子衍生物即肿瘤靶向递送载体as1411-peg-fp粉末。3.一种担载脱氧核酶分子的肿瘤靶向型纳米复合物，其是由如下方法制备得到：将权利要求1所述的靶向pd-l1基因的脱氧核酶分子与权利要求2所述的as1411-peg-fp粉末以1：20～100的质量比例溶于无核酸酶水中并混匀，然后在0～40℃下孵育20～40min，即得到担载脱氧核酶分子的肿瘤靶向型纳米复合物。4.权利要求1所述的一种靶向pd-l1基因的脱氧核酶分子在制备治疗黑色素瘤药物的应用。5.权利要求2所述的一种肿瘤靶向递送载体在制备治疗黑色素瘤药物的应用。6.权利要求3所述的一种担载脱氧核酶分子的肿瘤靶向型纳米复合物在制备治疗黑色素瘤药物的应用。

技术总结
一种靶向PD-L1基因的脱氧核酶、靶向递送载体、肿瘤靶向型纳米复合物其在制备治疗黑色素瘤药物的应用，属于生物技术领域。本发明首先设计筛选出具有高效靶基因识别和切割活性的脱氧核酶Dz1～Dz10，再制备得到具有肿瘤靶向性的脱氧核酶递送载体APFP，将APFP与脱氧核酶进行静电组装制备APFP/Dz1～Dz10纳米复合物。本发明实现了对脱氧核酶的肿瘤细胞靶向递送，显著抑制肿瘤细胞PD-L1的表达，成功激活了CD8


技术研发人员：李全顺 卫思梦 刘子玲 崔朋飞 刘勇 邵新欣 熊博宇
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2022.04.28
技术公布日：2022/11/1