具有抗病毒作用的口服使用的包含乳铁蛋白和益生菌菌株的组合物
1.本发明涉及一种包含乳铁蛋白的组合物，所述组合物用于作为抗病毒剂口服使用，优选用于治疗呼吸系统的病毒感染以及源自所述病毒感染或与所述病毒感染有关的症状或病状，所述病毒感染优选为sars-冠状病毒的病毒感染(例如covid-19)。此外，本发明涉及一种用于在治疗病毒感染的所述方法中口服使用的组合物，除乳铁蛋白外，其也包含细菌菌株和/或n-乙酰半胱氨酸和/或透明质酸。特别地，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含乳铁蛋白或其衍生物，和至少一种细菌菌株，优选属于副干酪乳杆菌物种，例如副干酪乳杆菌(cncm i-1572)菌株，并且涉及用于治疗由sars冠状病毒导致的病毒感染(例如covid-19)的方法的所述组合物。
2.顾名思义，呼吸道病毒感染是由病毒引起的传染病，所述病毒影响上呼吸道系统和/或下呼吸道系统的器官(鼻、咽、喉、气管、支气管和肺)。
3.优选地，本发明涉及由严重急性呼吸综合征冠状病毒物种(缩写为sars-cov)的至少一种病毒引起的病毒感染。所述sars-cov物种的所述病毒是属于乙型冠状病毒属(genus betacoronavirus)的正链rna病毒(巴尔的摩分类法的第iv组)。
4.严重急性呼吸综合征冠状病毒物种的病毒是引起中国的2002-2003sars流行病的病毒，称为sars-cov毒株。
5.其首先在2002年11月在中国广东省中发现。从2002年11月1日到2003年8月31日，病毒在约30个国家感染了8,096个人，导致774例死亡，主要在中国大陆、香港、台湾和所有东南亚国家。在2019年末，被称为sars-cov-2毒株或2019-ncov的严重急性呼吸综合征冠状病毒物种的另一病毒引起中国和世界其余部分的新sars流行病，更通常称为covid-19(冠状病毒疾病19，也称为严重急性呼吸综合征冠状病毒2-sars-cov-2-或冠状病毒疾病2019，也称为冠状病毒综合征2019)。
6.在深入研究和开发活动之后，申请人通过提供用于口服使用的组合物，克服并解决了治疗病毒感染的问题，优选是呼吸道(上呼吸道和下呼吸道)的病毒感染，特别是由严重急性呼吸综合征冠状病毒物种的至少一种病毒引起的呼吸道病毒感染(例如sars-cov、sars-cov-2/2019-ncov毒株-其疾病被称为covid-19-或sars-cov样)，所述组合物包含乳铁蛋白或其衍生物，以及任选的至少一种细菌菌株和/或n-乙酰半胱氨酸或其盐，和/或透明质酸或其盐，用于治疗病毒感染或与其相关的症状或病症的方法。
7.乳铁蛋白，也称为乳运铁蛋白，是多功能球状蛋白质。乳铁蛋白属于转铁蛋白家族，并且其具有约80kda的分子质量，具有两个铁离子(fe
3+
)结合位点，类似于转铁蛋白本身。乳铁蛋白从未被铁饱和，并且其铁含量是变化的。乳铁蛋白具有抗微生物活性、杀细菌、杀真菌和抵抗各种病毒。假设乳铁蛋白的抗微生物活性与其对fe
3+
的亲和力相关，因此与其在自由状态与铁依赖性微生物竞争的能力高相关，并且与对革兰氏阴性菌外部膜的直接作用相关。乳铁蛋白在粘膜分泌物中与铁离子的组合调节细菌和病毒对细胞膜的活性和聚集性。这是由于一些细菌和病毒需要铁以便执行细胞复制的事实，而乳铁蛋白则相反地将其从周围环境中除去，从而防止所述细菌和病毒增殖。
8.乳铁蛋白对dna和rna病毒(包括轮状病毒、呼吸道合胞病毒、疱疹病毒和hiv)表现出抗病毒活性。乳铁蛋白的抗病毒作用在于感染的早期阶段。乳铁蛋白通过阻断细胞受体或直接结合到病毒颗粒上而阻止病毒进入宿主细胞。具体地，乳铁蛋白的抗病毒作用主要在于其与质膜的糖胺聚糖结合的能力。此外，在文献中已知通过改善nk细胞活性和通过刺激嗜中性粒细胞聚集和粘附，乳铁蛋白参与宿主对严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)的急性侵入的免疫响应。此外，考虑到hspg是涉及sars-cov细胞进入的细胞表面的必要分子，已经假设乳铁蛋白可以通过结合到hspg(hspg，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，广泛分布)和通过阻断sars-cov和宿主细胞之间的初步相互作用来在对抗sars-cov感染的宿主防御中发挥保护作用。
9.在本发明的上下文中，表述“乳铁蛋白衍生物”用于指示源自乳铁蛋白的任何多功能肽或球状蛋白质，其显示类似的抗病毒作用，例如缺铁乳铁蛋白(apolactoferrin)或乳铁素(lactoferricin)。乳铁素是具有已知抗菌活性的乳铁蛋白衍生物，缺铁乳铁蛋白是其中n-末端叶(或缺铁乳铁蛋白)呈开放构象的乳铁蛋白。
10.基于乳铁蛋白或其衍生物以及任选的至少一种细菌菌株和/或n-乙酰半胱氨酸或其盐和/或透明质酸或其盐的本发明的组合物，配制用于口服使用，优选以固体形式，可有效作为抗病毒剂，特别是有效用于治疗呼吸道病毒感染和与其相关的症状或病状，特别是由严重急性呼吸综合征冠状病毒物种的至少一种病毒(例如sars-cov、sars-cov-2或2019-ncov毒株-导致称为covid-19-或sars-cov样的疾病)引起的感染。
11.基于乳铁蛋白或其衍生物以及任选的透明质酸或其盐的本发明的组合物，可以通过添加特定的赋形剂和添加剂而配制为溶液或乳液或适合于雾化的分散体，并且施用(使用喷雾装置)至鼻和喉以用于吸入、口或鼻腔使用。所述可喷雾组合物有效作为抗病毒剂，特别是有效用于治疗呼吸道病毒感染和与其相关的症状或病状，特别是由严重急性呼吸综合征冠状病毒物种的至少一种病毒(例如sars-cov、sars-cov-2或2019-ncov毒株-导致称为covid-19-或sars-cov样的疾病)引起的感染。
12.基于乳铁蛋白或其衍生物和任选的至少一种细菌菌株和/或n-乙酰半胱氨酸或其盐和/或透明质酸或其盐的本发明的组合物没有显著的副作用，并且它们可以施用给有需要的所有类别的受试者，包括老年人、妊娠及哺乳妇女、儿科受试者(0-12岁)、患有呼吸或心血管并发症或糖尿病或可能在病毒感染的情况下造成风险或危险的其他并发症的受试者。
13.此外，基于乳铁蛋白和任选的至少一种细菌菌株和/或n-乙酰半胱氨酸和/或透明质酸的本发明的组合物易于制备且有成本效益。
14.此外，除了乳铁蛋白或其衍生物和任选的n-乙酰半胱氨酸或其盐和/或透明质酸或其盐之外还包含细菌菌株(益生菌或衍生物)的本发明的组合物可以是有利的，因为本发明的细菌菌株能够增加有需要的受试者中乳铁蛋白的胃肠吸收，并因此增加其血液生物利用度，如在本说明书和权利要求中所报道的那样。
15.此外，相对于根据本发明的组合物的免疫刺激/抗炎作用中的单独组分，乳铁蛋白或其衍生物与本发明的至少一种细菌菌株的组合提供了协同或增强效果。
16.最后，本发明的细菌菌株不受乳铁蛋白或其衍生物(例如，缺铁乳铁蛋白)的抗菌效果的影响，并且同时乳铁蛋白(或衍生物)对本发明的组合物中存在的细菌菌株施加益生
元效果，从而支持其生长。
17.特别地，已经证明了乳铁蛋白和至少一种属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株，优选副干酪乳杆菌(cncm i-1572)的组合对sars-cov-2的抗病毒活性。
18.对于益生菌菌株已经提出各种抗病毒作用模式，包括：细菌菌株和病毒之间的直接相互作用、抗病毒物质的产生和宿主免疫系统的刺激。在sars-cov-2感染的情况下，益生菌菌株，优选属于乳杆菌属的益生菌菌株，可以作为通过各种机制抵抗病毒渗如到宿主细胞中的屏障。此外，在covid-19感染之前、期间或之后施用益生菌菌株增加了受试者的自然免疫力。
19.通过体外实验，本说明书中报道的结果显示本发明的组合物增强抗病毒免疫系统的活性，以及其防止sars-cov-2的复制的能力，所述本发明的组合物包含乳铁蛋白和至少一种属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株，优选副干酪乳杆菌(cncm i-1572)或者副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和副干酪乳杆菌lpc-s01(dsm 26760)的组合。
20.在所测试的本发明的组合物中，除乳铁蛋白之外还包含细菌菌株(属于副干酪乳杆菌物种，优选副干酪乳杆菌(cncm i-1572)，或副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和副干酪乳杆菌lpc-s01(dsm 26760)的组合)的那些组合物，经证明在抗病毒免疫调节活性方面是最有希望的，能够诱导在抗病毒响应信号传导途径(例如tlr7、ifih、irf3、irf7和mavs)中涉及的ifn和基因的表达。
21.这在sars-cov-2感染的情况下有特别意义。冠状病毒具有避免先天免疫响应的各种机制，特别是通过改变i型ifn响应。与其它呼吸道病毒相比，sars-cov-2诱导较低的抗病毒转录响应，其特征在于低水平的i型ifn和高的趋化因子表达。此外，患有严重的covid-19的患者显示了减少的i型ifn响应和较低的病毒清除。此外，tlr7已经涉及作为在鼠类感染模型中识别中东呼吸综合征cov(mers-cov)和严重急性呼吸综合征cov(sars-cov)的ssrna的重要模式识别受体，使得其是作为sars-cov-2中的中心模式识别受体起作用的可能候选物。对sars-cov、mers-cov和sars-cov-2的整个基因组的测序已经表明，sars-cov-2基因组包含与sars-cov基因组相比可以与tlr7相互作用的更多ssrna模式，表明tlr7信号传导在covid-19的发病机制中可能甚至更相关。在具有严重covid-19的年轻男性患者的数个病例中下鉴定出具有tlr7 x染色体功能的缺失的少见假定变体，其与改变的i型和ii型ifn响应相关。
22.特征在于i型干扰素(ifn-is)的弱产生和促炎细胞因子的恶化释放的不平衡免疫响应有助于covid-19的严重形式。此外，慢性低等级全身性炎症伴随着不利地影响covid-19患者的结果的各种共病。
23.本说明书中报道的结果表明，利用包含乳铁蛋白和至少一种细菌菌株((属于副干酪乳杆菌物种，优选副干酪乳杆菌(cncm i-1572))的组合物进行的体外预防性治疗在caco-2细胞中抑制由sars-cov-2感染触发的免疫响应，这是因为相对于对照和相对于鼠李糖乳杆菌gg(atcc 53103)菌株而言，il-6、il-8和tslp1促炎细胞因子的转录水平降低。
24.此外，还观察到相对于鼠李糖乳杆菌gg(atcc 53103)菌株，乳铁蛋白与细菌菌株副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和副干酪乳杆菌lpc-s01(dsm 26760)组合的组合更大程度地正向调节抗病毒免疫响应，进一步显示在减少病毒复制和调节由sars-cov-2病毒引起
的促炎响应的作用，甚至在这种情况下，相对于鼠李糖乳杆菌gg(atcc 53103)菌株达到更大的程度。
25.因此，包含乳铁蛋白(或其衍生物)和至少一种属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株(例如副干酪乳杆菌cncm i-1572，或者副干酪乳杆菌cncm i-1572和副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760的组合)的本发明的组合物的预防性使用，有助于减轻由sars-cov-2感染引起的过度免疫响应。
26.由于在说明书中报道并在所附权利要求中要求保护的技术特性，通过本发明的组合物和混合物获得将从以下详细描述中清楚的这些和其它目的。
附图说明
27.图1a-c示意性地表示在以下情况下评价caco2肠道上皮细胞中的抗病毒响应的体外研究的图：(a)不存在利用本发明的组合物进行的治疗，(b)用根据本发明的组合物预处理，和(c)与本发明的组合物共处理，各自相对于使用sars-cov-2病毒的治疗。
28.附图2a-c表示与鼠李糖乳杆菌gg atcc 53103菌株的效果相比，本发明的组合物对细胞因子/趋化因子和具有抗病毒作用或参与由caco-2肠上皮细胞产生的抗病毒响应的分子的群组的效果。
29.图3a-b表示相对于sars-cov-2病毒的处理，在用本发明的组合物预处理后，本发明的组合物对细胞因子/趋化因子和具有抗病毒作用或参与由caco-2肠上皮细胞产生的抗病毒响应的分子的群组的效果。
30.图4a-c表示在用根据本发明的组合物预处理或未处理的体外感染sars-cov-2的caco-2细胞中的编码rna依赖性rna聚合酶(rdrp)和基因e(cove)的病毒特异性基因的表达水平、细胞因子表达谱(促炎和抗炎)，并将其与包含乳铁蛋白和鼠李糖乳杆菌gg atcc 53103菌株的组合物的效果进行比较。
31.图5a-b表示在用本发明的组合物共同处理或不处理的体外感染sars-cov-2的caco-2细胞中的编码rna依赖性rna聚合酶(rdrp)和基因e(cove)的病毒特异性基因的表达水平，以及炎性细胞因子表达谱，并将其与包含乳铁蛋白和鼠李糖乳杆菌gg atcc 53103菌株的组合物的效果进行比较。
具体实施方式
32.本发明的目的是一种用于口服使用的组合物，并且(简言之，本发明的组合物)用作抗病毒剂，优选用于预防性和/或治疗性治疗有需要的受试者中呼吸系统(上呼吸道和/或下呼吸道)的病毒感染以及源自所述病毒感染或与所述病毒感染有关的症状或病状的方法，其中所述组合物包括：
33.(i)混合物m(简言之本发明的混合物m)，其包含乳铁蛋白(简言之lf)或其可接受的药用级衍生物或由其组成：和任选的，
34.(ii)至少一种可接受的药用级添加剂和/或赋形剂。
35.优选地，使用本发明的组合物治疗的病毒感染是由以下病毒引起的感染：冠状病毒科，冠状病毒亚科，乙型冠状病毒属，严重急性呼吸综合征冠状病毒种(简言之，sars-cov或sars-冠状病毒)；优选地选自以下株：(i)严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov或
sars)，(ii)严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或2019-ncov-导致称为covid-19的疾病)，和(iii)严重急性呼吸综合征冠状病毒样病毒(sars-cov-样或sl-cov)；更优选地，sars-cov-2或2019-ncov，其导致称为covid-19的疾病。
36.简言之，在本发明的上下文中，这些病毒(例如(i)、(ii)和(iii))被称为“sars-冠状病毒物种的病毒”或简称为“sars-冠状病毒”。
37.由呼吸道(上呼吸道和/或下呼吸道)的病毒感染、优选如上所述的冠状病毒感染(例如，sars-cov、sars-cov-2或2019-ncov、sars-cov-样)导致或与其有关的症状或病状可以是：严重急性呼吸综合征(sars)、呼吸并发症、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、支气管炎(bronchitis)、肺气肿、囊性纤维化、咳嗽、百日咳、肺炎、胸膜炎(pleuritis)、细支气管炎(bronchiolitis)、感冒、鼻窦炎、鼻炎、气管炎、咽炎、喉炎、急性喉气管支气管炎(acute laryngotracheobronchitis)、会厌炎、支气管扩张、呼吸困难、气喘(dyspnoea、呼吸急促(breathlessness)、呼吸短促)、发烧、疲劳、肌肉痛(muscle aches)和/或疼痛(muscle pain)、鼻塞、流鼻涕、咽喉痛(sore throat)、胃肠症状例如恶心和腹泻、肾功能不全、食欲不振和/或总体不适感(general feeling of malaise)。
38.在一个实施方式中，用于口服使用作为本发明的抗病毒剂的组合物包含所述混合物m，所述混合物m除乳铁蛋白或其衍生物以外还包含至少一种属于乳杆菌属或双歧杆菌属的细菌菌株或细菌菌株的混合物；优选属于选自以下的物种的至少一种细菌菌株：副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌乳酸亚种、两歧双歧杆菌及其混合物，优选副干酪乳杆菌物种及其混合物。
39.例如，用于口服使用作为本发明的抗病毒剂的组合物包含所述混合物m，所述混合物m除乳铁蛋白或其衍生物以外还包含至少一种选自包含以下组的细菌菌株，所述组包含以下菌株或由其组成：
[0040]-(a)属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为副干酪乳杆菌(由索法尔公司注册的商标)并且保藏在巴黎的巴斯德研究所国家微生物保藏中心，保藏号cncm i-1572(1995年5月5日由索法尔公司保藏为干酪乳杆菌干酪亚种cncm i-1572，并随后重分类为副干酪乳杆菌cncm i-1572；应当观察到，其仍然并且排他地是相同的细菌菌株，无论名称是干酪乳杆菌cncm i-1572还是副干酪乳杆菌cncm i-1572)，
[0041]-(b)属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为副干酪乳杆菌lpc-s01并且保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 26760(2013年1月11日由索法尔公司保藏，并于2017年5月15日请求将保藏物转化成根据布达佩斯条约的保藏物)，
[0042]-(c)属于短双歧杆菌(bifidobacterium breve)物种的细菌菌株，其被鉴定为短双歧杆菌bbibs01并且保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 33231(2019年7月31日由索法尔公司保藏)，
[0043]-(d)属于短双歧杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为短双歧杆菌bbibs02并且保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 33232(2019年7月31日由索法尔公司保藏)，
[0044]-(e)属于动物双歧杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为动物双歧杆菌乳酸亚种blibs01并且保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 33233(2019年7月31日由索法尔公司保藏)，
[0045]-(f)属于植物乳杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为植物乳杆菌lpibs01并且保藏
在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 33234(2019年7月31日由索法尔公司保藏)，
[0046]-(g)属于两岐双岐杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为两岐双岐杆菌mimbb23sg＝bbfibs01或其衍生物，其中所述细菌菌株由索法尔公司于2017年12月4日保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 32708，和
[0047]-其混合物。
[0048]
在本发明中提及的所有细菌菌株根据布达佩斯条约的规定保藏。在本专利申请和其所有者中描述和/或要求保护的细菌菌株的保藏人从开始表示他们同意在整个专利的整个持续时间内所有上述菌株处于可获得状态。
[0049]
属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株在命名为副干酪乳酪杆菌(lacticaseibacillus paracasei)下被重新分类。
[0050]
本说明书的双歧杆菌对象，例如短双歧杆菌bbibs01(dsm 33231)、短双歧杆菌bbibs02(dsm 33232)、动物双歧杆菌乳酸亚种blibs01(dsm 33233)为人类来源，并且它们天然存在于人肠中；而植物乳杆菌lpibs01(dsm 33234)分离自人胃肠道。
[0051]
优选地，本发明的组合物的混合物m可以包含乳铁蛋白或其衍生物和副干酪乳杆菌cncm i-1572，或乳铁蛋白或其衍生物和副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760菌株，或乳铁蛋白或其衍生物、副干酪乳杆菌cncm i-1572菌株和副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760菌株。
[0052]
根据一个方面，本发明的组合物的所述混合物m包含乳铁蛋白(或其衍生物)、属于副干酪乳杆菌物种的菌株(优选副干酪乳杆菌cncm i-1572)以及还包含至少一种另外的细菌菌株，或者由其组成，所述另外的细菌菌株选自包含以下菌株或由其组成的组：短双岐杆菌bbibs01 dsm 33231、短双岐杆菌bbibs02 dsm 33232、动物双歧杆菌乳酸亚种blibs01 dsm 33233、植物乳杆菌lpibs01 dsm 33234、两岐双岐杆菌mimbb23sg(或bbfibs01)dsm 32708以及其混合物。
[0053]
根据一个方面，本发明的组合物的所述混合物m包含乳铁蛋白(或其衍生物)、副干酪乳杆菌cncm i-1572菌株以及还包含至少一种另外的细菌菌株，或者由它们组成，所述另外的细菌菌株选自包含以下菌株或由其组成的组：短双岐杆菌bbibs01 dsm 33231、短双岐杆菌bbibs02 dsm 33232、动物双歧杆菌乳酸亚种blibs01 dsm 33233、植物乳杆菌lpibs01 dsm 33234、两岐双岐杆菌mimbb23sg(或bbfibs01)dsm 32708以及其混合物，优选两岐双岐杆菌mimbb23sg(或bbfibs01)dsm 32708。
[0054]
根据一个方面，本发明的组合物的所述混合物m包含乳铁蛋白(或其衍生物)、副干酪乳杆菌cncm i-1572和/或副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760菌株以及还包含至少一种另外的细菌菌株，或者由它们组成，所述另外的细菌菌株选自包含以下菌株或由其组成的组：短双岐杆菌bbibs01 dsm 33231、短双岐杆菌bbibs02 dsm 33232、动物双歧杆菌乳酸亚种blibs01 dsm 33233、植物乳杆菌lpibs01 dsm 33234、两岐双岐杆菌mimbb23sg(或bbfibs01)以及其混合物，优选两岐双岐杆菌mimbb23sg(或bbfibs01)dsm 32708。
[0055]
本发明的组合物的混合物m的其它实施方式(fr)如下，其中lf指示乳铁蛋白，并且细菌菌株用如上所述的字母(a)至(g)表示：lf+a+c；lf+a+d；lf+a+e；lf+a+d；lf+a+e；lf+a+f；lf+a+g；lf+b+c；lf+b+d；lf+b+e；lf+b+d；lf+b+e；lf+b+f；lf+b+g；lf+a+b+c；lf+a+b+d；
lf+a+b+e；lf+a+b+d；lf+a+b+e；lf+a+b+f；lf+a+b+g；lf+a+c+d+e+f；lf+b+c+d+e+f；lf+a+b+c+d+e+f；lf+a+c+d+e+f+g；lf+b+c+d+e+f+g；lf+a+b+c+d+e+f+g；lf+a+c+d；lf+b+c+d；lf+a+b+c+d；lf+a+c+d+g；lf+b+c+d+g；lf+a+b+c+d+g；lf+a+c+d+e；lf+b+c+d+e；lf+a+b+c+d+e；lf+a+c+d++eg；lf+b+c+d+e+g；lf+a+b+c+d+e+g。
[0056]
包含乳铁蛋白和细菌菌株混合物的混合物m的所述实施方式(fr)可进一步包含n-乙酰半胱氨酸(nac)或其盐。包括nac或其盐的优选实施方式是：lf+a+nac；lf+b+nac；lf+a+b+nac；lf+a+g+nac；lf+b+g+nac；lf+a+b+g+nac；lf+a+c+d+e+f+nac；lf+b+c+d+e+f+nac；lf+a+b+c+d+e+f+nac；lf+a+c+d+e+f+g+nac；lf+b+c+d+e+f+g+nac；lf+a+b+c+d+e+f+g+nac。
[0057]
包含乳铁蛋白和细菌菌株混合物和任选的n-乙酰半胱氨酸(nac)或其盐的混合物m的所述实施方式(fr)可进一步包含透明质酸(ha)或其盐。包含ha或其盐的优选实施方式是：lf+a+ha；lf+b+ha；lf+a+b+ha；lf+a+g+ha；lf+b+g+ha；lf+a+b+g+ha；lf+a+c+d+e+f+ha；lf+b+c+d+e+f+ha；lf+a+b+c+d+e+f+ha；lf+a+c+d+e+f+g+ha；lf+b+c+d+e+f+g+ha；lf+a+b+c+d+e+f+g+half+a+nac+ha；lf+b+nac+ha；lf+a+b+nac+ha；lf+a+g+nac+ha；lf+b+g+nac+ha；lf+a+b+g+nac+ha；lf+a+c+d+e+f+nac+ha；lf+b+c+d+e+f+nac+ha；lf+a+b+c+d+e+f+nac+ha；lf+a+c+d+e+f+g+nac+ha；lf+b+c+d+e+f+g+nac+ha；lf+a+b+c+d+e+f+g+nac+ha。
[0058]
存在于本发明的组合物的混合物m中的前述细菌菌株可以是根据本领域技术人员已知的方法和设备获得的有活力的(或益生菌)细菌菌株或所述细菌菌株的衍生物，例如副益生元(paraprobiotic)或后生元(postbiotic)裂解物、间歇灭活和/或失活的细菌菌株。
[0059]“益生菌”是活的和有活力的微生物(即细菌菌株)，其在以足够的量施用时赋予有益宿主健康的益处；术语“益生菌”是指存在于食物中或添加到食物中的微生物(fao和who定义)。
[0060]
在本发明的上下文中，术语细菌菌株的“衍生物”(或有活力的细菌菌株的“衍生物”)用于表示间歇灭活或超声灭活或使用本领域技术人员已知的其他技术(例如使用γ射线)失活的细菌菌株，或细菌菌株的裂解物，或细菌菌株的提取物(简而言之，副益生元)，或细菌菌株的任何衍生物和/或组分，优选由细菌菌株产生的表多糖、细胞壁级分(parietal fraction)、代谢物或代谢生物产物(简言之，后生元)，和/或源自细菌菌株的任何其他产物。优选地，本发明的细菌菌株的术语“衍生物”用于表示间歇灭活或失活的细菌菌株(例如使用γ射线)。
[0061]
换句话说，在本发明的上下文中，术语益生性、有活力的细菌菌株的“衍生物”基本上用于表示副益生元或后生元。
[0062]
在本发明的上下文中，术语“副益生元”用于表示非存活(即，没有复制的能力)的细菌细胞(即，完整的或破坏的)或粗制细胞提取物，其在以足够的量施用时赋予宿主健康益处(类似于它们源自的有活力的细菌菌株)。副益生元的实例是热灭活的细菌菌株(例如间歇灭活的细菌菌株)、超声处理(超声波)、γ照射(γ射线)、或细菌菌株的裂解物或细菌菌株的提取物。
[0063]
在本发明的上下文中，术语“后生元”用于表示通过益生性有活力的细菌菌株的代谢活性释放或产生的任何物质，其中所述后生元在以足够的量施用时赋予宿主健康益处(类似于它们源自的有活力的细菌菌株)。后生元的实例是表多糖、细胞壁级分(parietal fraction)、代谢物或代谢生物产物。
[0064]
在一个实施方式中，本发明的组合物的混合物m除乳铁蛋白或其衍生物和任选的至少一种细菌菌株之外，还包含n-乙酰半胱氨酸(nac)或其可接受的药用级盐。
[0065]
在本发明的上下文中，n-乙酰半胱氨酸(nac)的可接受的药用级盐包括本领域中已知的和/或本领域技术人员已知的并适用于本发明的所有盐。可接受的药用级n-乙酰半胱氨酸盐的优选实例是n-乙酰半胱氨酸的l-赖氨酸盐(nal)。
[0066]
n-乙酰半胱氨酸是由iupac名称2r-乙酰氨基-3-磺基丙酸命名的物质，cas实例：616-91-1。n-乙酰半胱氨酸是具有抗氧化和粘液溶解活性的半胱氨酸氨基酸的n-乙酰化的衍生物。抗氧化剂是减缓或防止其它物质氧化的物质。粘液是使呼吸系统分泌的粘液更具流体性并促进支气管和气管喷射粘液的工作的物质。已知呼吸系统的分泌物的粘度和弹性的主要决定因素是岩藻糖粘蛋白和igg免疫球蛋白。特别地，n-乙酰半胱氨酸的特征在于在蛋白质中分解硫桥的能力：在粘液的情况下，n-乙酰半胱氨酸将粘液蛋白质复合物(糖蛋白聚集物)解聚成较小的单元，提供较低的粘度，并且其对粘膜和粘液分泌效应进行重要的粘液溶解和流化作用。
[0067]
例如，本发明的组合物的混合物m可包含乳铁蛋白或其衍生物和n-乙酰半胱氨酸或其盐，或由它们组成。
[0068]
在另一实例中，本发明的组合物的m混合物可以包含乳铁蛋白或其衍生物、n-乙酰半胱氨酸或其盐和至少一种细菌菌株或细菌菌株的混合物，或由它们组成，所述细菌菌株选自包含以下菌株或由其组成的组：副干酪乳杆菌cncm i-1572、副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760、短双岐杆菌bbibs01 dsm 33231、短双岐杆菌bbibs02 dsm 33232、动物双歧杆菌乳酸亚种blibs01 dsm 33233和植物乳杆菌lpibs01 dsm 33234、两岐双岐杆菌mimbb23sg＝bbfibs01，和其混合物，优选副干酪乳杆菌cncm i-1572(例如：lf、nac和或lf、nac和lpc-s01，或lf、nac、和lpc-s01，以及本说明书中提到的其它实施方式)。
[0069]
在一个实施方式中，本发明的组合物的混合物m除了乳铁蛋白或其衍生物和任选的至少一种细菌菌株和/或n-乙酰半胱氨酸(nac)或其盐之外，还包含透明质酸(ha)或其可接受的药用级盐；优选地，其中所述混合物m包含乳铁蛋白或其衍生物和n-乙酰半胱氨酸和/或透明质酸或其可接受的药用级盐；优选地，其中所述混合物m包含乳铁蛋白或其衍生物、至少一种根据本发明中定义的任何一个实施方式的益生菌(或其衍生物)(例如副干酪乳杆菌cncm i-1572)、n-乙酰半胱氨酸和/或透明质酸或其可接受的药用级盐。在本发明中描述了包含透明质酸(ha)或其盐的本发明的组合物的混合物m的实例。
[0070]
透明质酸(例如cas 9004-61-9)是非硫酸化的糖胺聚糖并且没有蛋白质核。透明质酸及其盐是大分子。特别地，在本发明的上下文中，透明质酸或其盐，优选透明质酸钠的平均分子量优选为20kda至4000kda(例如100kda、500kda、1500kda、1000kda、2000kda或3000kda)，优选50kda至1500kda，甚至更优选150kda至1000kda。
[0071]
在本发明的上下文中，表述“透明质酸盐”优选用于表示碱金属或碱土金属的盐，例如钠、钾、镁或钙的盐；优选地，透明质酸盐是钠盐(透明质酸钠)。
[0072]
可以在本发明的上下文中使用的透明质酸可以是直链或支链的，并且可以是植物来源(例如通过对植物基质(例如大豆)进行微生物发酵获得)，是由允许特定酵母或细菌产
生自发发酵以产生它的生物技术过程。
[0073]
与n-乙酰半胱氨酸或其盐组合的本发明的组合物中透明质酸的存在提高了n-乙酰半胱氨酸的粘液溶解功效(降低粘液粘度，以及容易咳出/消除患有粘液超常产生的受试者的粘液)。
[0074]
乳铁蛋白可以存在于本发明的组合物中或本发明的混合物m(根据本发明的任何一个实施方式，例如单独的lf、lf和细菌菌株、lf和nac、lf和nac以及细菌菌株)中，并且相对于混合物m的组合物的总重量为10％至90％重量百分比(例如，15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％)，优选20％至80％，更优选30％至70％或30％至50％。
[0075]
在除了乳铁蛋白或其衍生物以外混合物m还包含n-乙酰半胱氨酸或其盐的实施方式中，在混合物m中乳铁蛋白或其衍生物与n-乙酰半胱氨酸或其盐的重量比(乳铁蛋白：n-乙酰半胱氨酸)为10:1至1:10(例如9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9)，优选5:1至1:5，更优选2:1至1:2。
[0076]
根据本发明的任何一个实施方式(即，单独的lf、lf和细菌菌株、lf和nac、lf和nac和细菌菌株)的包含所述混合物m的本发明的组合物可以还包含所述至少一种药物或食品级添加剂和/或赋形剂，即，不具有适合于药物或食品用途的治疗活性的物质。在本发明的上下文中，对于药物或食品用途而言可接受的添加剂和/或赋形剂包括本领域技术人员已知的用于制备固体、半固体或液体形式的组合物的所有辅助物质，例如稀释剂、溶剂(包括水、甘油、乙醇)、增溶剂、酸化剂、增稠剂、甜味剂、增香剂、着色剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、ph稳定缓冲剂以及它们的混合物。
[0077]
用于本发明的口服使用的组合物可以固体形式或液体形式或半液体形式配制，所述固体形式选自：片剂、咀嚼片、口服可溶性片剂、颗粒剂、粉末剂、薄片剂、可溶性粉末剂或颗粒剂、口腔可溶性粉末剂或颗粒剂、胶囊剂；所述液体形式选自：溶液剂、悬浮剂、分散剂、乳液剂、能够以喷雾形式分配的液体、糖浆；所述半液体形式选自：软凝胶、凝胶；优选地，本发明的组合物是固体形式。
[0078]
在根据本发明所述的任何一个实施方式的本发明的组合物的混合物m中，乳铁蛋白可以为脂质体形式，例如磷脂类脂质体形式。
[0079]
乳铁蛋白的所述脂质体形式(或制剂)可以在施用(通过口服或喷雾制剂鼻腔内)后降低乳铁蛋白的清除率，并因此增加其吸收程度。此外，由脂质体携带的物质受保护免遭酶(蛋白酶、核酸酶)或变性环境(ph)的作用。脂质体是由一个或多个脂双层形成的中空微球，其膜通常由胆固醇(或胆固醇酯)和磷脂如磷脂酰胆碱、二乙酰基磷酸酯和磷脂酰乙醇胺组成。脂质体的尺寸可以为20nm至25nm，至多至2.5μm。
[0080]
在本发明的上下文中，用于口服使用的术语用于表示口服(或肠溶)施用和舌下(或经颊)施用。
[0081]
本发明的用于口服使用的组合物(优选以固体形式)，作为抗病毒剂是有效的，特别是在治疗由sars冠状病毒(优选sars-cov或2019-ncov，其导致称为covid-19的疾病)引起的呼吸道感染是有效的，乳铁蛋白的每日剂量为5mg至1000mg，优选10mg至500mg，更优选20mg至400mg，例如50mg至350mg，50mg至300mg、50mg至250mg、50mg至200mg、100mg至200mg，10mg至180mg，10mg至160mg，10mg至140mg，10mg至120mg，10mg至100mg、10mg至90mg、10mg至
80mg、10mg至70mg，10mg至60mg，10mg至50mg。
[0082]
前述日剂量可以单次剂量(一剂)或重复剂量(例如两个、三个或四个日剂量)施用给受试者。
[0083]
当本发明的混合物m除乳铁蛋白和任选的n-乙酰半胱氨酸和/或透明质酸之外还包含所述至少一种细菌菌株或其混合物时，对于每日剂量，所述细菌菌株(或所述细菌菌株中的每一种)在本发明的组合物中的存在浓度为10x106cfu至10x10
12
cfu，优选地10x108cfu至10x10
10
cfu，更优选浓度为10x108cfu或10x109cfu(cfu：集落形成单位)。
[0084]
根据所述实施方式中的任一种的本发明的组合物可以用作用于治疗由sars冠状病毒引起的疾病的另外的抗病毒治疗方法的佐剂。
[0085]
本发明的目的是一种用于预防和/或治疗性治疗有需要的受试者的呼吸系统(上呼吸道和/或下呼吸道)的病毒感染以及相关症状或病状的方法，其中所述治疗方法提供治疗有效量的根据本发明的组合物(例如乳铁蛋白和任选的细菌菌株和/或n-乙酰半胱氨酸和/或透明质酸)的施用。
[0086]
除非另有说明，否则即使未指定，表述包含“x至y”的量的组分的组合物或混合物或其它表达也用于表示所述组分可以以所述范围中存在的所有量存在于所述组合物或混合物或其它表达中，包括所述范围的端值。
[0087]
除非另有说明，否则“包含”一种或多种组分或物质的组合物或混合物的指示是指除了具体指出的一种或多种组分或物质之外，还可以存在其他组分或物质。
[0088]
在本发明的上下文中，表达“治疗方法”用于表示对有需要的受试者的干预，包括施用治疗有效量(根据本领域技术人员)的物质的组合物或混合物，其目的是消除、减少/降低或预防疾病或病痛以及其症状或病状。
[0089]
在本发明的上下文中，术语“受试者”用于表示人或动物受试者，优选哺乳动物(例如宠物，如狗、猫、马、羊或牛)。优选地，本发明的组合物用于人类受试者的治疗方法。
[0090]
下面报告本发明fr-an的实施方式。
[0091]
fr-a1.一种应用于治疗病毒感染的方法的组合物，其中所述组合物包含(i)混合物m，其包含乳铁蛋白或其可接受的药用级衍生物，或由其组成；和任选的(ii)至少一种可接受的药用级添加剂和/或赋形剂；且其中所述组合物用于口服使用。
[0092]
fr-a2.根据fr-a1所述应用的组合物，其中所述组合物用于治疗呼吸系统的病毒感染和源自所述病毒感染或与所述病毒感染相关的症状或病状的方法。
[0093]
fr-a3.根据fr-a1或2所述应用的组合物，其中所述病毒感染由冠状病毒科，冠状病毒亚科，乙型冠状病毒属，严重急性呼吸综合征冠状病毒种的病毒引起，其选自下述菌株：严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid-19或2019-ncov)和严重急性呼吸综合征冠状病毒样病毒(sars-cov-样或sl-cov)；优选covid-19。
[0094]
fr-a4.根据fr-a2或3所述应用的组合物，其中源自呼吸系统的所述病毒感染或与所述病毒感染相关的症状或病状选自：严重急性呼吸综合征(sars)、呼吸并发症、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、支气管炎、肺气肿、囊性纤维化、咳嗽、百日咳、肺炎、尿囊炎、细支气管炎、感冒、鼻窦炎、鼻炎、气管炎、咽炎、喉炎、急性喉气管支气管炎、会厌炎和支气管扩张。
[0095]
fr-a5.根据前述fr-as中任一项所述应用的组合物，其中所述混合物m还包含至少
一种属于乳杆菌属或双歧杆菌属的细菌菌株；优选至少一种属于选自以下的物种的细菌菌株：副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、短双岐杆菌、动物双歧杆菌乳酸亚种和两岐双岐杆菌。
[0096]
fr-a6.根据fr-a5所述应用的组合物，其中所述至少一种细菌菌株选自包含以下或由以下组成的组：副干酪乳杆菌cncm i-1572、副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760、短双岐杆菌bbibs01 dsm 33231、短双岐杆菌bbibs02 dsm 33232、动物双歧杆菌乳酸亚种blibs01 dsm 33233、植物乳杆菌lpibs01 dsm 33234、两岐双岐杆菌mimbb23sg(或bbfibs01)dsm 32708，及其混合物。
[0097]
fr-a7.根据fr-a6所述应用的组合物，其中所述混合物m包含乳铁蛋白或其衍生物和副干酪乳杆菌cncm i-1572菌株或副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760菌株或其混合物，或由它们组成。
[0098]
fr-a8.根据fr-a6所述应用的组合物，其中所述混合物m包含乳铁蛋白或其衍生物和细菌菌株混合物，或由它们组成，所述细菌菌株混合物包含副干酪乳杆菌cncm i-1572菌株和/或副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760菌株，以及短双岐杆菌bbibs01 dsm 33231、短双岐杆菌bbibs02 dsm 33232、动物双歧杆菌乳酸亚种blibs01 dsm 33233和植物乳杆菌lpibs01 dsm 33234的混合物，以及任选的两岐双岐杆菌mimbb23sg或bbfibs01 dsm 32708，或由它们组成。
[0099]
fr-a9.根据前述fr-a中任一项所述应用的组合物，其中所述混合物m还包含n-乙酰半胱氨酸或其可接受的药用级盐；优选地，其中所述混合物m包含乳铁蛋白或其衍生物，和n-乙酰半胱氨酸或其可接受的药用级盐；优选地，其中所述混合物m包含乳铁蛋白或其衍生物，至少一种根据fr-a5至8中任一种所述的益生菌，和n-乙酰半胱氨酸或其可接受的药用级盐。
[0100]
fr-a10.根据前述fr-a中任一项所述应用的组合物，其中所述混合物m还包含透明质酸或其可接受的药用级盐；优选地，其中所述混合物m包含乳铁蛋白或其衍生物和n-乙酰半胱氨酸和/或透明质酸，或其可接受的药用级盐；优选地，其中所述混合物m包含乳铁蛋白或其衍生物，至少一种根据fr-a5至8中任一种所述的益生菌，n-乙酰半胱氨酸和/或透明质酸，或其可接受的药用级盐。
[0101]
fr-a11.根据前述fr-a中任一项所述应用的组合物，其中所述组合物是固体形式或液体形式或半液体形式，所述固体形式选自：片剂、咀嚼片、口含片、颗粒剂、薄片剂、可溶性粉末剂、口服可溶性粉末剂、胶囊剂；所述液体形式选自：溶液剂、悬浮剂、分散剂、乳液剂、能够以喷雾、糖浆的形式分配的液体；所述半液体形式，选自：软凝胶、凝胶；优选为固体形式。
[0102]
下面报告本发明fr-bns的优选实施方式。
[0103]
fr-b1.一种应用于治疗呼吸系统的病毒感染和源自所述病毒感染或与所述病毒感染相关的症状或病状的方法中的组合物，
[0104]
其中所述病毒感染由冠状病毒科(family coronaviridae)，冠状病毒亚科(subfamily coronavirinae)，乙型冠状病毒属(genus betacoronavirus)，严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)种的病毒引起，
[0105]
其中所述组合物包含：
[0106]
(i)混合物m；和任选的，
乙酰半胱氨酸或其可接受的药用级盐。
[0124]
fr-b8.根据fr-b1-fb-b7中任一项所述应用的组合物，其中所述混合物m还包含透明质酸或其可接受的药用级盐。
[0125]
fr-b9.根据fr-b1-fb-b8中任一项所述应用的组合物，其中乳铁蛋白是脂质体形式；优选地磷脂类脂质体形式。
[0126]
fr-b10.根据fr-b1-fb-b9中任一项所述应用的组合物，其中源自所述呼吸系统的病毒感染或与所述病毒感染相关的症状或病状选自：严重急性呼吸综合征(sars)、呼吸并发症、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、支气管炎(bronchitis)、肺气肿、囊性纤维化、咳嗽、百日咳、肺炎、胸膜炎(pleuritis)、细支气管炎(bronchiolitis)、感冒、鼻窦炎、鼻炎、气管炎、咽炎、喉炎、急性喉气管支气管炎(acute laryngotracheobronchitis)、鼻窦炎、会厌炎、支气管扩张、呼吸困难、气喘(dyspnoea)、呼吸急促(breathlessness)、呼吸短促、发烧、疲劳、肌肉痛(muscle aches)、肌肉疼痛(muscle pain)、鼻塞、流鼻涕、咽喉痛(sore throat)、胃肠症状、恶心、腹泻、肾功能不全、食欲不振、总体不适感(general feeling of malaise)。
[0127]
实验部分
[0128]
根据本发明的包含乳铁蛋白和至少一种如在本发明的上下文中定义的细菌菌株的组合物被测试以验证以下：
[0129]-细菌菌株(益生菌)作为乳铁蛋白的增强剂(以增加吸收和生物利用度)；
[0130]-根据本发明的组合物的免疫刺激/抗炎作用(评估一些炎性细胞因子(例如il-8)的表达)；
[0131]-乳铁蛋白对益生菌的益生元作用，最终效果是增加细菌菌株的生长。
[0132]
1.目的
[0133]
本技术人进行体外研究以便评估根据本发明的组合物刺激受试者中的先天抗病毒免疫响应从而对抗病毒感染的能力，所述组合物包含乳铁蛋白和至少一种细菌菌株，所述细菌菌株属于副干酪乳杆菌物种，优选副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和/或副干酪乳杆菌lpc-s01(dsm 26760)，所述病毒感染特别是由sars-cov-2病毒引起的呼吸道病毒感染(covid-19)。
[0134]
详细地，在体外评估以下：
[0135]
(1)根据本发明的组合物增强肠上皮细胞中的抗病毒响应的能力(抗病毒免疫调节效果)；和
[0136]
(2)根据本发明的组合物影响人类肠上皮细胞中的sars-cov-2感染(体外模型中的sars-cov-2感染)的能力。
[0137]
2.材料
[0138]
2.1.细胞、病毒、细菌菌株和试剂.
[0139]
caco-2人类结肠腺癌细胞系(htb-37
tm
)和
[0140]
vero e6猴肾上皮细胞系(crl-1586
tm
)
[0141]
在补充有10％(v/v)fbs、1％(v/v)丙酮酸钠和1％(v/v)青霉素/链霉素(均来自gibco-thermo fisher scientific,waltham,usa)的dmem培养基中，在含有5％co2的加湿
温育器中在37℃下培养。
[0142]
乳杆菌菌株，例如：
[0143]-鼠李糖乳杆菌gg(atcc 53103)，新命名为乳杆菌鼠李糖乳酪杆菌(lacticaseibacillus rhamnosus)；
[0144]-副干酪乳杆菌(cncm i-1572；干酪乳杆菌干酪乳杆菌索法尔公司)，新命名为副干酪乳酪杆菌；
[0145]-副干酪乳杆菌lpc-s01(dsm26760)，新命名为副干酪乳酪杆菌；和
[0146]-两歧双歧杆菌mimbb23sg(或bbfibs01)(dsm 32708)。
[0147]
菌株在mrs板(deman rogosa sharpe,difco,bd)上培养。将菌株在厌氧条件下在37℃下温育72小时。
[0148]
atcc 53103菌株购自atcc保藏中心，而(cncm i-1572)和lpc-s01(dsm 26760由索法尔公司提供(milan，意大利)。
[0149]
乳铁蛋白是作为(sofar,italy)获得，批次m90578，有效期2021年11月。与益生菌组合使用，终浓度为100μg/ml。
[0150]
将具有补充有20％甘油的高葡萄糖含量的无菌dmem作为对照测试加入。
[0151]
2.2.病毒储备液的制备和滴度
[0152]
sars-cov-2分离自university hospital of padua的microbiology unit的患者。病毒毒株在vero e6细胞中繁殖，并且以整个基因组的测序来表征。使用牙斑试验方法测定病毒滴度。简而言之，将24孔板(costar，merck，italy)中的veroe6汇合细胞接种10倍连续稀释的病毒原液1小时。然后，除去生长培养基并将细胞与含有羧甲基纤维素(cmc，merck)的新鲜培养基一起温育。细胞用5％w/v甲醛(merck)固定72小时p.i.，并用结晶紫(merck)染色。基于在感染后在细胞培养物中形成的斑块，将病毒滴度测量为噬菌斑形成单位(pfu/ml)。所有感染实验都在意大利帕多瓦的帕多瓦大学的分子医学院的3级生物安全(bsl-3)实验室中进行。
[0153]
2.3.细菌菌株的制备。
[0154]
2.3.1.活细胞
[0155]
在de man，rogosa，sharpe(mrs)肉汤中制备肉汤培养物，在厌氧条件下在37℃下温育18小时。温育后，将菌株在3000rpm下离心10分钟，并用无菌蒸馏水洗涤细胞团两次。将洗涤培养物在600nm(od600)下的光密度调节至0.3，以达到在20μl体积中2.5x106cfu。将标准化的经洗涤培养物连续稀释以用于活菌计数，并在3000rpm下离心10分钟。将细胞团再悬浮于补充有20％甘油(merck)的无菌dmem培养基(gibco-thermo fisher scientific,waltham,usa)中。
[0156]
3.方法
[0157]
3.1.caco-2细胞培养和实验设计
[0158]
将caco-2细胞接种在12孔板(2
×
105个细胞/ml)中。在达到汇合后，细胞在1xpbs(gibco-thermo fisher scientific,waltham,usa)中洗涤，并在无抗生素培养基(afm)中温育或进行以下处理(图1)。
[0159]
在没有sars-cov-2病毒的情况下单独用乳铁蛋白和益生菌处理(图1a)。
[0160]
对于用sars-cov-2病毒处理，用本发明的组合物进行预处理(图1b)。
[0161]
对于汇合的caco-2细胞以细菌菌株(活的；moi为1：10)进行补充。
[0162]
将乳铁蛋白以100μg/ml的浓度与细菌菌株一起添加。3小时后，将细胞在1xpbs(gibco-thermo fisher scientific,waltham,usa)中洗涤，并与补充有抗生素(青霉素/链霉素)的新鲜培养基一起温育，然后用sars-cov-2(moi 1:2)感染1小时。收获24小时p.i细胞(p.i cells)用于rna提取。
[0163]
对于用sars-cov-2病毒处理，用本发明的组合物进行共处理(图1c)。
[0164]
对于汇合的caco-2细胞，用细菌菌株(活的；moi 1:10)以及sars-cov-2(moi 1:2)进行补充。添加乳铁蛋白(100μg/ml)和细菌菌株。3小时后，将细胞洗涤并与新鲜培养基一起温育24小时，然后收获以用于rna提取。
[0165]
3.2.rna提取和实时pcr
[0166]
使用总rna试剂盒i(omega bio-tek,tebu-bio,italy)，按照制造商的说明分离总rna。通过与无rna酶的dna酶i组(omega bio-tek)温育来除去污染物dna。在abi prism 7000序列检测(applied biosystems)中使用itaqtm通用探针一步试剂盒(bio-rad,milan,italy)按照制造商的说明进行互补dna合成和扩增。将目标基因表达相对于参考基因gapdh的表达标准化。
[0167]
3.3.统计分析.
[0168]
数据显示为平均值+/-sd(sd：标准偏差)。使用graphpad prism软件6.0软件(graphpad software inc.,la jolla,usa)进行统计分析。使用双尾学生t检验进行比较。如果p《0.05则差异被认为是显著的。
[0169]
4.结果.
[0170]
4.1.体外抗病毒免疫响应.
[0171]
使用caco-2人类肠上皮细胞在体外评估本发明的组合物的抗病毒免疫调节作用。
[0172]
如图2a-2c所示，用本发明的组合物处理引起抗病毒免疫响应中涉及的几种基因的表达谱的显著变化。
[0173]
评估与乳铁蛋白组合的副干酪乳杆菌cncm i-1572(单独或与副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760一起)的刺激抗病毒免疫响应的能力，并将其与鼠李糖乳杆菌gg(atcc 53103)(比较菌株)和乳铁蛋白的组合刺激抗病毒免疫响应的能力进行比较。
[0174]
用副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和乳铁蛋白(lf)一起处理caco-2细胞改善了干扰素α(ifn-α1)抗病毒细胞因子的水平，并且证明了干扰素β(ifn-β1)上调的趋势(图2a)。
[0175]
此外，副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和乳铁蛋白(lf)的组合显著增加tlr7(涉及检测rna病毒的模式识别受体)的表达、ifih1(编码作为病毒rna分子传感器的mda5的基因)的表达以及irf3、irf7和mavs(其参与响应的抗病毒信号传导途径)的表达(图2b和2c)。
[0176]
此外，将乳铁蛋白(lf)添加到副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和副干酪乳杆菌lpc-s01(dsm 26760)的组合显著增加上述病毒识别基因和抗病毒响应信号传导基因的表达，特别是通过增加ifn-α1、tlr7、ifih1、irf3、irf7和mavs基因(图2a-2b)的表达来增加上述病毒识别基因和抗病毒响应信号传导基因的表达。
[0177]
4.2.对sars-cov-2体外复制的抑制效果.
[0178]
为了评估本发明的组合物对sars-cov-2的抗病毒活性，进行了对caco-2细胞中的sars-cov-2的感染测定。
[0179]
在病毒感染之前，用根据本发明的组合物预处理细胞3小时，然后用sars-cov-2感染1小时(图1b)。从获自收获细胞的总rna分析编码rna依赖性rna聚合酶(rdrp)的病毒特异性基因和e基因(cove)的表达水平，这些基因对于sars-cov-2的复制和组装是关键的。
[0180]
观察到编码rna依赖性rna聚合酶(rdrp)的病毒特异性基因的表达在用包含副干酪乳杆菌(cncm i-1572)菌株和乳铁蛋白的组合物处理的caco-2细胞中显著减少，表明用根据本发明的组合物的预处理可以在体外抑制sars-cov-2复制。
[0181]
此外，还在收获的上清液中评价sars-cov-2滴度：所述上清液用副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和乳铁蛋白(lf)的组合预处理，确定了将sars-cov-2感染抑制52.8％，并将其与瑞德西韦(广谱抗病毒剂物(gilead sciences)比较(图3a，表示为抑制的值和图3b，表示为功效的值)。
[0182]
4.3.在体外用根据本发明的组合物预处理防止由sars-cov-2触发的免疫响应.
[0183]
已知促炎和促纤维化细胞因子由于sars-cov-2感染而增加，并且在最严重的情况下，患者的预后可由于促炎细胞因子的过度产生而显著恶化。
[0184]
为了确定用根据本发明的组合物预处理是否可以防止体外由sarm-cov-2感染触发的免疫响应，测试用根据本发明的组合物预处理或不用其处理的感染sars-cov-2的caco-2细胞的炎性和抗炎细胞因子的表达谱(图4)。将根据本发明的组合物对由sars-cov-2感染触发的免疫响应的所述保护活性与鼠李糖乳杆菌atcc 53103)(比较菌株)和乳铁蛋白的组合进行比较。
[0185]
所有测量的细胞因子的转录水平倾向于在sars-cov-2感染后上调(数据未示出)。
[0186]
特别地，相对于对照并且相对于鼠李糖乳杆菌gg(atcc 53103)，用包含副干酪乳杆菌(cncm i-1572)菌株和乳铁蛋白(lf)的本发明的组合物对感染的caco-2细胞的预处理显著降低了il6、il8和tslp1基因的mrna表达水平并提高tgf-β1基因的mrna表达水平(图4a-4c)。
[0187]
用包含乳铁蛋白(lf)以及副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和副干酪乳杆菌lpc-s01(dsm 26760)的组合的组合物获得类似的结果。
[0188]
此外，还应当观察到，相对于对照并且相对于鼠李糖乳杆菌gg(atcc 53103)，用包含两岐双岐杆菌mimbb23sg(＝bbfibs01)dsm 32708菌株和乳铁蛋白(lf)的本发明的组合物对感染的caco-2细胞的预处理显著降低il6、il8和tslp1基因的mrna表达水平以及编码rna依赖性rna聚合酶(rdrp)的病毒特异性基因和基因e(cove)的表达水平(图4a-4c)。
[0189]
4.4.体外用本发明的组合物共处理防止由sars-cov-2触发的免疫响应.
[0190]
在caco-2细胞共处理研究中获得与4.3节中报道的类似的结果(图1c和图5a-b)。
[0191]
5.结论.
[0192]
获得的结果表明，包含乳铁蛋白和至少一种属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株(优选副干酪乳杆菌(cncm i-1572)或者副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和副干酪乳杆菌lpc-s01(dsm 26760)的组合)的本发明的组合物能够正向调节抗病毒和抗炎响应，
从而证明是在sars-cov-2抗病毒治疗中有用的佐剂。
[0193]
具体地，通过使用本发明的组合物，本研究的体外测试显示抗病毒免疫系统增强活性和它们防止sars-cov-2复制的能力为约50％。
[0194]
在测试的益生菌菌株中，属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株，优选副干酪乳杆菌(cncm i-1572)，被证明在抗病毒免疫调节活性方面与乳铁蛋白组合最有希望，能够诱导ifn和参与抗病毒响应信号传导途径的基因(例如tlr7、ifih、irf3、irf7和mavs)的表达。
[0195]
此外，由于促炎细胞因子il-6、il-8和tslp1的转录水平相对于对照降低，用本发明的组合物(优选乳铁蛋白和副干酪乳杆菌(cncm i-1572))体外预防性处理或共处理在caco-2细胞中抑制了由sars-cov-2感染触发的免疫响应。
[0196]
因此，包含乳铁蛋白(或其衍生物)和至少一种属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株(优选副干酪乳杆菌(cncm i-1572))的本发明的组合物的预防性使用有助于减轻由sars-cov-2感染引起的过度免疫响应。
[0197]
如文献中已知的，细菌菌株副干酪乳杆菌(cncm i-1572)是益生菌菌株，其已经显示在成年人和儿童中在胃肠道转运中存活。
[0198]
在本研究中，与鼠李糖乳杆菌gg(atcc 53103)菌株和乳铁蛋白的组合(即相对于在文献中更广泛研究和使用并记录为发挥免疫调节性能的益生菌)相比，副干酪乳杆菌(cncm i-1572)细菌菌株与乳铁蛋白的组合显示出增强的活性。
[0199]
尽管支持在该研究中观察到的副干酪乳杆菌(cncm i-1572)抗病毒活性的机制是未知的，但是已经假设覆盖该细菌细胞的富含鼠李糖的异质表多糖(eps)分子可以有助于副干酪乳杆菌与宿主细胞的特殊交叉对话(cross-talk)。
[0200]
此外，观察到相对于鼠李糖乳杆菌gg(atcc 53103)，细菌副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和副干酪乳杆菌lpc-s01(dsm 26760)的组合与乳铁蛋白的组合更大程度地正向调节抗病毒免疫响应，进一步显示在减少病毒复制和调节由sars-cov-2病毒引起的促炎响应中的作用，甚至在这种情况下，相对于鼠李糖乳杆菌gg(atcc 53103)株更大程度地减少病毒复制和调节由sars-cov-2病毒引起的促炎响应。
技术特征：1.一种应用于治疗呼吸系统的病毒感染和源自所述病毒感染或与所述病毒感染相关的症状或病状的方法的组合物，其中所述病毒感染由冠状病毒科，冠状病毒亚科，乙型冠状病毒属，严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)种的病毒引起，其中所述组合物包含：(i)混合物m；和任选的，(ii)至少一种可接受的药用级添加剂和/或赋形剂；其中所述混合物m包括乳铁蛋白或其可接受的药物级衍生物和至少一种属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株，或者由它们组成；并且其中所述组合物用于口服应用。2.根据权利要求1所述应用的组合物，其中，所述严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)物种的病毒选自以下株：严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、导致covid-19疾病的严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或2019-ncov)，和严重急性呼吸综合征冠状病毒样病毒(sars-cov-样或sl-cov)；更优选sars-cov-2。3.根据权利要求1或2所述应用的组合物，其中，所述至少一种属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株选自包含以下细菌菌株或由以下细菌菌株组成的组：-属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为副干酪乳杆菌并且保藏在巴黎的巴斯德研究所的国家微生物保藏中心，保藏号cncm i-1572(1995年5月5日由索法尔公司保藏为干酪乳杆菌干酪亚种cncm i-1572)，-属于副干酪乳杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为副干酪乳杆菌lpc-s01并且保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 26760(2013年1月11日由索法尔公司保藏，并于2017年5月15日请求将保藏物转化成根据布达佩斯条约的保藏物)，以及其混合物。4.根据前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中，所述混合物m还包含至少一种另外的细菌菌株，所述另外的细菌菌株选自包含以下细菌菌株或由以下细菌菌株组成的组：-属于短双歧杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为短双歧杆菌bbibs01并且保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 33231(2019年7月31日由索法尔公司保藏)，-属于短双歧杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为短双歧杆菌bbibs02并且保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 33232(2019年7月31日由索法尔公司保藏)，-属于动物双歧杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为动物双歧杆菌乳酸亚种blibs01并且保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 33233(2019年7月31日由索法尔公司保藏)，-属于植物乳杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为植物乳杆菌lpibs01并且保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 33234(2019年7月31日由索法尔公司保藏)，-属于两岐双岐杆菌物种的细菌菌株，其被鉴定为两岐双岐杆菌mimbb23sg或bbfibs01或其衍生物，其中所述细菌菌株由索法尔公司于2017年12月4日保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号dsm 32708，和-其混合物。5.根据前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中，所述混合物m包含乳铁蛋白或其衍生物和副干酪乳杆菌cncm i-1572菌株，或者由它们组成。
6.根据前述权利要求中任一项应用的组合物，其中，所述至少一种细菌菌株是益生菌或副益生元(paraprobiotic)或后生元(postbiotic)活性细菌菌株。7.根据前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中，所述混合物m还包含n-乙酰半胱氨酸或其可接受的药用级盐。8.根据前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中，所述混合物m还包含透明质酸或其可接受的药用级盐。9.根据前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中，乳铁蛋白是脂质体形式；优选地磷脂类脂质体形式。10.根据前述权利要求中任一项所述应用的组合物，其中，源自所述呼吸系统的病毒感染或与所述病毒感染相关的症状或病状选自：严重急性呼吸综合征(sars)、呼吸并发症、哮喘、慢性阻塞性肺病(copd)、支气管炎(bronchitis)、肺气肿、囊性纤维化、咳嗽、百日咳、肺炎、胸膜炎(pleuritis)、细支气管炎(bronchiolitis)、感冒、鼻窦炎、鼻炎、气管炎、咽炎、喉炎、急性喉气管支气管炎(acute laryngotracheobronchitis)、会厌炎、支气管扩张、呼吸困难、气喘(dyspnoea)、呼吸急促(breathlessness)、呼吸短促、发烧、疲劳、肌肉痛(muscle aches)、肌肉疼痛(muscle pain)、鼻塞、流鼻涕、咽喉痛(sore throat)、胃肠症状、恶心、腹泻、肾功能不全、食欲不振、总体不适感(general feeling of malaise)。
技术总结本发明涉及一种组合物，所述组合物包含乳铁蛋白和任选的益生菌菌株和/或N-乙酰半胱氨酸和/或透明质酸，用于作为抗病毒剂口服使用，优选用于治疗由SARS冠状病毒导致的呼吸系统的病毒感染(例如COVID-19)。19)。
技术研发人员：A
受保护的技术使用者：索法尔公司
技术研发日：2021.03.09
技术公布日：2022/11/1
