1.本方明属于有机合成领域，涉及一种鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物及合成方法。
背景技术：2.近年来，伴随着众多新型抗肿瘤药物与制剂的开发，传统药物疗法得到了长足的发展。大量涌现的新型抗肿瘤药物分子表现出了显著改善的治疗效果与安全性；部分早期剂型与分子在体内代谢过程、生物相容性与药理活性等方面的缺陷通过改良剂型与结构优化得到了弥补。在这一过程中，药物递送系统(dds)在抗肿瘤药物制剂设计中的重要地位逐渐显露。大多数具有抗肿瘤活性的分子在缺乏药物递送系统辅助下不仅很难或无法达到预期的治疗效果，甚至还可能导致严重的不良反应。随着纳米技术的迅速发展，纳米药物载体作为天然产物的运载手段的设想逐渐纳入学术界的研究范围。在抗肿瘤研究领域，纳米尺度的药物递送系统因其显著增强的细胞通透性、由epr效应延长的体内循环半衰期、靶向肿瘤积聚乃至肿瘤细胞中药物的控缓释等特点在抗肿瘤药物递送的研究领域备受关注。目前报道的纳米药物载体包括聚合物胶束、脂质体和金属纳米粒子等。在过去的几十年中，基于纳米载体的抗肿瘤药物递送已经从盲目的全身给药发展到靶向的高精度的治疗。
3.在新药设计领域，氨基酸及多肽作为连接药物与其他能够改良药物体内代谢过程及治疗效果的分子的桥联结构已有先例，但以赖氨酸作为“linker”的报道相对较少。
4.鬼臼毒素是一种从小蘖科鬼臼属植物的根和根茎中提取的天然木脂素，其抗肿瘤活性已得到广泛认可。鬼臼毒素的抗肿瘤作用来源于其抑制微管蛋白聚合，破坏微管组装引发肿瘤有丝分裂阻滞和凋亡。但由于对正常细胞(尤其是分裂旺盛的组织)同样具有很高的细胞毒性，以及会导致严重的的胃肠道紊乱等不良效应，且其水溶性较差，难以直接应用于肿瘤治疗。
5.在众多关于抗肿瘤制剂设计的相关报道中，基于聚乙二醇(peg)的载药系统被认为是一种优化药物分子释放行为的理想选择。由于peg中既包含极性氧原子，也包括非极性(ch2)2单元，所以peg在大多数极性与非极性溶剂中均有较好的溶解度，并且作为改善疏水药物水溶性的理想手段而被广泛报道。在peg 及其众多衍生物中，线性peg长链既可以通过与其他聚合物结合形成两亲性聚合物构建新型载药系统(例如两亲性胶束、囊泡、纳米粒子等)，也可通过直接缀合药物改善药物水溶性；枝状peg结构在作为药物递送系统外层结构时，具有保护易被蛋白酶水解的多肽或其他生物大分子，并通过其“伞状结构”的屏蔽效应降低免疫原性；多臂peg可以作为聚合物骨架构建交联网络如水凝胶；梳状peg 结构则被报道可用于优化气体分离性能。
6.在药物化学领域，二硫键因其独特的化学性质而受到了广泛的关注。在药物分子设计中引入二硫键，依照设计目的的差异可从多个角度对母体结构进行功能化或结构改良。例如二硫键配对是一种稳定多肽构象的有效手段。在抗肿瘤药物分子与制剂设计中，二硫键则更多的作为一种赋予分子氧化还原响应性的方式，增强对肿瘤细胞的靶向给药能
力。
7.在关于“linker”的选择上，本发明中选用了赖氨酸作为中心“linker”结构支撑连接其他功能结构，其主要特点是结构简单、修饰位点丰富、化学性质稳定、价格低廉并且无毒无害。
技术实现要素：8.本发明提供了一种鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物与合成方法。本发明开创了一种二硫键与鬼臼毒素的桥联方式，并对聚乙二醇的偶联方法进行了一定的拓展，最后在赖氨酸上选择性裸露出远端氨基可以作为潜在修饰位点，可通过进一步引入其他功能基团，形成双功能或多功能运载系统。该化合物可以用于肿瘤的治疗，可应用于制备抗肿瘤药物中。
9.本发明的目的通过以下技术方案实现的：
10.一种鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤化合物的结构如下：
[0011][0012]
而且，所述鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药在细胞水平对抗肿瘤活性进行评价，结果表明该化合物在体外水平有抗肿瘤活性。
[0013]
上述鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物是通过以下合成路线得到的：
[0014][0015]
赖氨酸中间体的修饰步骤如下：
[0016][0017]
抗肿瘤药物(鬼臼毒素)中间体修饰的步骤如下：
[0018][0019]
聚乙二醇中间体修饰的步骤如下：
[0020][0021]
各片段连接的合成步骤如下：
[0022][0023]
本发明的优点和积极效果如下：
[0024]
1.本发明首次合成了一种以鬼臼毒素作为抗肿瘤活性部分的前药分子，以赖氨酸作为递送系统，且远端氨基可以作为潜在修饰位点，可以进一步引入其他功能基团，形成双功能或多功能运载系统，开创了一种二硫键与鬼臼毒素的桥联方式，并对聚乙二醇的偶联方法进行了途径拓展。
[0025]
2.本发明所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药具有抗肿瘤性，可以用于非酒精性脂肪肝炎治疗，也可应用于制备抗非酒精性脂肪肝炎药物中。
附图说明
[0026]
图1为化合物1的1h-nmr谱图。
[0027]
图2为化合物2的1h-nmr谱图。
[0028]
图3为化合物3的1h-nmr谱图。
[0029]
图4为化合物4的1h-nmr谱图。
[0030]
图5为化合物5的1h-nmr谱图。
[0031]
图6为化合物6的1h-nmr谱图。
[0032]
图7为化合物9的1h-nmr谱图。
[0033]
图8为化合物10的1h-nmr谱图。
[0034]
图9为化合物11的1h-nmr谱图。
[0035]
具体实施方法
[0036]
本发明中所使用的原料如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
[0037]
本发明所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物结构式如下
[0038]
所述鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药在细胞水平对抗肿瘤活性进行评价，结果表明该化合物在体外水平有抗肿瘤活性。
[0039]
本发明所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物的合成路线如下式所示
[0040][0041]
本发明所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药中赖氨酸中间体的修饰步骤如下式所示：
[0042][0043]
本发明所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药中抗肿瘤药物(鬼臼毒素)中间体的修饰步骤如下式所示：
[0044][0045]
本发明所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药中聚乙二醇中间体的修饰步骤如下式所示：
[0046][0047]
各片段连接的合成步骤如下：
[0048][0049]
本发明提供的一种鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物，合成方法如下：
[0050]
本发明首先以两个胺基分别被选择性保护、羧基裸露的赖氨酸作为起始原料，通过酯化反应与丙炔醇构建赖氨酸中间体2，其中炔基用以连接peg模块。其次，在鬼臼毒素4号位引入活化酯端基与二硫键结构得到鬼臼毒素中间体6，其中活化酯结构用以连接赖氨酸模块。之后，在聚乙二醇单甲醚5000长链上引入叠氮基团，得到一侧末端为叠氮基的聚乙二醇中间体8，其中叠氮基团用以连接赖氨酸模块。最后，依次连接上述模块即得到前药分
子11，具体如下：
[0051]
中间体1的合成：
[0052]
将a(500mg，1.07mmol，1.0eq.)与丙炔醇乙氧基化合物(104.12μl，106.84 mg，1.07mmol，1.0eq.)、1h-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(pybop)(555.33mg，1.07mmol，1.0eq.)溶解于二氯甲烷5ml中，滴入n,n-二异丙基乙胺(diea)(352.74μl，275.84mg，2.14mmol，2.0eq.)，室温反应3h。 tlc检测反应完成后，30ml
×
3二氯甲烷萃取，饱和nacl水溶液洗涤有机相，无水na2so4干燥30min。300～400目硅胶柱层析纯化(洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯＝1：1)得到386mg中间体1，产率65.7％。
[0053]
中间体2的合成：
[0054]
将中间体1(5.17g，9.63mmol)溶解于三氟乙酸(tfa)二氯甲烷溶液(40mltfa+40mlch2cl2)中，室温反应1.5-2h。tlc检测反应完毕后减压蒸馏浓缩体系，300～400目硅胶柱层析纯化(梯度洗脱，洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯＝5： 1～1：10)得到3.62g中间体2，产率86.0％。
[0055]
中间体3的合成：
[0056]
将3-巯基丙酸(409.8μl，500mg，4.71mmol，1.0eq.)的30ml乙腈溶液于 30min缓慢滴入d(1.56g，7.07mmol，1.5eq.)的10ml乙腈溶液中，室温反应 3h。tlc检测反应完毕后，减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯＝5：1)得到489mg中间体3，产率48.4％。
[0057]
中间体4的合成：
[0058]
将鬼臼毒素(b)(2.85g，6.88mmol，1.0eq.)、中间体3(1.78g，8.25mmol， 1.2eq.)、二环己基碳二亚胺(dcc)(1.70g，8.25mmol，1.2eq.)、4-二甲氨基吡啶 (dmap)(168.04mg，1.38mmol，0.2eq.)溶解于540ml二氯甲烷中，室温反应3 h，反应过程中逐渐析出白色沉淀。tlc检测反应完毕后过滤，滤液经减压蒸馏浓缩后依次用0.1m稀盐酸、饱和nahco3水溶液、饱和nacl水溶液洗涤，无水na2so4干燥30min。300～400目硅胶柱层析纯化(洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯＝5：1)得到3.94g中间体4，产率91.6％。
[0059]
中间体5的合成：
[0060]
将3-巯基-1-丙醇(94.13μl，100.44mg，1.09mmol，1.0eq.)的24ml乙腈溶液于30min缓慢滴入中间体4(1.0g，1.63mmol，1.5eq.)的8ml乙腈溶液中，室温反应3h。tlc检测反应完毕后，减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(洗脱剂体系二氯甲烷：甲醇＝250：1)得到357mg中间体5，产率55.3％。
[0061]
中间体6的合成：
[0062]
将中间体5(350mg，590.54μmol，1.0eq.)溶解于25ml无水二氯甲烷中，滴加三乙胺(et3n)(91.94μl，66.93mg，661.41μmol，1.12eq.)，滴加对硝基苯基氯甲酸酯(166.64mg，826.76μmol，1.4eq.)的25ml无水二氯甲烷溶液，氩气保护下室温反应过夜。tlc检测反应完毕后减压蒸馏浓缩体系。300～400目硅胶柱层析纯化(洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯＝10：1分离过量对硝基苯基氯甲酸酯，洗脱剂体系二氯甲烷：甲醇＝250：1纯化得到产物)得到365mg中间体6，产率 81.6％。
[0063]
中间体7的合成：
[0064]
将原料c(5g，1mmol，1.0eq.)溶解于50ml无水二氯甲烷，冰水浴下滴加三乙胺
(694.99μl，505.95mg，5mmol，5.0eq.)，滴加甲基磺酰氯(mscl)(386.96 μl，572.70mg，5.00mmol，5.0eq.)，氩气保护下室温反应2～3h。tlc检测反应完成后以饱和nahco3水溶液洗涤2次，无水na2so4干燥30min，冷乙醚与二氯甲烷重结晶2次，减压蒸馏除去溶剂得到4.92g中间体7，产率91.2％。
[0065]
中间体8的合成：
[0066]
将中间体7(5.2g，1.04mmol，1.0eq.)与叠氮化钠(nan3)(135.22mg，2.08 mmol，2.0eq.)溶解于无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)20ml，氩气保护下50℃反应48h。tlc检测反应完毕后，冷乙醚与二氯甲烷重结晶2次，减压蒸馏除去溶剂得到3.24g中间体8，产率62.8％。
[0067]
中间体9的合成：
[0068]
将中间体2(120mg，274.91μmol，1.0eq.)、中间体6(624.96mg，824.73μmol， 3.0eq.)溶解于36ml无水二氯甲烷，滴加三乙胺240μl，氩气保护下室温反应过夜，反应体系由无色或淡黄色透明溶液转变为黄色透明溶液。tlc检测反应完毕后减压蒸馏浓缩体系，300～400目硅胶柱层析纯化(洗脱剂体系石油醚：乙酸乙酯＝1：1)得到104.5mg中间体9，产率36.0％。
[0069]
中间体10的合成：
[0070]
将0.5ml吗啉溶解于0.5ml二氯甲烷，加入中间体9(40mg，37.91μmol)，室温反应2h。tlc检测反应完毕后，依次用0.1m稀盐酸、饱和nahco3水溶液、饱和nacl水溶液洗涤，无水na2so4干燥30min。300～400目硅胶柱层析纯化(梯度洗脱，洗脱剂体系二氯甲烷：甲醇＝250：1～50：1)得到27.0mg中间体 10，产率85.5％。
[0071]
前药分子11的合成：
[0072]
将中间体10(20mg，24.01μmol，1.0eq.)与中间体8(120.05mg，24.01μmol， 1.0eq.)溶解于10ml超干四氢呋喃(thf)，加入溴化亚铜(cubr)(3.44mg，24.01 μmol，1.0eq.)，滴加五甲基二乙烯三胺(pmdeta)(5μl，4.16mg，24.01μmol， 1.0eq.)，氩气保护下50℃反应30～45min，反应体系逐渐由淡黄色溶液变为棕褐色溶液。tlc检测反应完毕后，过滤反应液，减压蒸馏浓缩，二氯甲烷稀释，中性氧化铝柱层析纯化除去反应体系中的cu盐，所得有机相减压蒸馏浓缩后用二氯甲烷20ml
×
3与水萃取，饱和nacl水溶液洗涤有机相，无水na2so4干燥 30min。减压蒸馏后用二氯甲烷与冷乙醚重结晶，减压蒸馏除去溶剂得到前药分子11。
[0073]
本发明鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇前药的相关检测如下：
[0074]
本发明首次合成出鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇前药，并首次在细胞水平运用 mtt法评价了鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药的抗肿瘤活性。
[0075]
取对数生长期的细胞，调整细胞密度为5
×
104cells/ml接种于96孔板上，每孔100μl，同时设置空白孔和对照孔，每个化合物浓度设置3个平行孔。于 37℃、5％co2培养箱中培养(悬浮细胞培养2h，贴壁细胞培养24h)。分别加入终浓度为1μm的化合物和阳性对照cpt，每孔0.5μl。空白孔为不含有细胞、 dmso以及化合物的纯培养基孔，对照孔为含相同浓度dmso作用的细胞。按照以上方案处理后，将孔板置于37℃、5％co2恒温培养箱中培养48h。此后，每孔加入5mg/ml的mtt溶液20μl(用pbs配制，0.22μm滤膜过滤除菌)，置于37℃、5％co2恒温培养箱中继续孵育4h，终止培养。悬浮细胞每孔直接加入100μl盐酸异丙醇，贴壁细胞小心移除孔内培养上清液，每孔加入100μl dmso。37℃，培养箱内放置10min，使紫色结晶
物充分溶解。用酶标仪(悬浮细胞选择578、630nm，贴壁细胞选择490、630nm)测定各孔的吸光度(od) 值。根据测出的od值按照以下公式计算细胞存活率。
[0076]
细胞存活率(％)＝(实验组od-空白组od)/(对照组od-空臼组od)
×
100％。
[0077]
活性测试结果如表1所示，结果显示，在1μm时，鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇前药与鬼臼毒素相比，其对mcf-7、k562及hct-116肿瘤细胞的增殖活性显著提高。
[0078]
表1鬼臼毒素及鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇前药的抗肿瘤活性测试结果
[0079][0080]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
技术特征：1.一种鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物，其特征在于：结构如下：2.权利要求1所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物的合成方法，其特征在于：步骤如下：3.根据权利要求2中所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物的合成方法，其特征在于：所述鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药中赖氨酸中间体修饰的步骤如下：4.根据权利要求2中所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物的合成方
法，其特征在于：所述鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药中抗肿瘤药物(鬼臼毒素)中间体修饰的步骤如下：5.根据权利要求2中所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物的合成方法，其特征在于：所述鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药中聚乙二醇中间体修饰的步骤如下：6.根据权利要求2中所述的鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药化合物的合成方法，其特征在于：所述鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药中各片段连接的合成步骤如下：
技术总结本发明涉及一种鬼臼毒素-赖氨酸-聚乙二醇抗肿瘤前药及合成方法，首先通过酯化反应与丙炔醇构建赖氨酸中间体2，其次，在鬼臼毒素4号位引入活化酯端基与二硫键结构得到鬼臼毒素中间体6，之后，在聚乙二醇单甲醚5000长链上引入叠氮基团，得到一侧末端为叠氮基的聚乙二醇中间体8，其中叠氮基团用以连接赖氨酸模块。最后，依次连接上述模块即得到前药分子11。本发明合成了一种以鬼臼毒素作为抗肿瘤活性部分的前药分子，开发了一种二硫键与鬼臼毒素的桥联方式，且赖氨酸上远端的裸露氨基可以作为潜在修饰位点，可通过进一步引入其他功能基团，形成双功能或多功能运载系统。形成双功能或多功能运载系统。形成双功能或多功能运载系统。
技术研发人员：向岑 丁鑫 徐雪萍 傅玉鹏 李佳莉 刘江 郁彭 滕玉鸥
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2022.06.30
技术公布日：2022/11/1
