1.本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种荧光探针及其在检测亚硝酸根离子中的应用。
技术背景
2.亚硝酸盐(no
2-)是一种可溶于水的工业盐，常作为抗氧化剂、着色剂、抑菌剂而广泛应用于肉类食品的生产加工过程中，以提高肉制品的风味和色泽。亚硝酸盐同样也是自然环境中氮循环的中间产物，是水中最常见的无机污染物。当摄入的亚硝酸盐量超过一定的限度时会对人体造成危害，会导致许多的疾病产生，如：食道癌、胃癌、孕妇自然流产、中枢神经系统先天性缺陷和血红蛋白发生不可逆的反应形成高铁血红蛋白导致蓝婴综合症；更为严重的是，在人体内亚硝酸盐在酸性环境中会与胺或亚胺类化合物反应生成致癌的亚硝胺。
3.文献中报道的基于环化反应检测亚硝酸根离子的荧光探针大多是基于邻苯二胺结构的，并且需要漫长的反应时间，因此开发一种可以快速检测亚硝酸根离子的探针十分重要。
技术实现要素：4.本发明提出了一种荧光探针及其在检测亚硝酸根离子中的应用，所述荧光探针为基于罗丹明800的偕胺肟结构的荧光探针，首次将含肟基团的荧光探针应用于亚硝酸根离子的检测中，通过探针对不同离子的选择性差异及探针与亚硝酸根离子的快速反应，实现对亚硝酸根离子的特异性识别和快速检测。
5.实现本发明的技术方案是：
6.一种荧光探针，所述荧光探针为基于罗丹明800的偕胺肟结构的荧光探针，所述荧光探针的结构式为
7.所述荧光探针的制备方法包括如下步骤：(1)将罗丹明800置于圆底烧瓶中，加入羟胺溶液，用二氯甲烷和无水甲醇作为反应溶剂，室温下搅拌8-10h；(2)反应结束后，将反应液重结晶、抽滤得固体，所得固体用二氯甲烷溶解后通过柱色谱法分离提纯，得到荧光探针。
8.所述步骤(1)中罗丹明800与羟胺的物质的量之比为1:16。
9.所述步骤(1)中的羟胺溶液为质量分数为50％的羟胺水溶液。
10.所述步骤(1)中二氯甲烷与无水甲醇的体积比为1:1。
11.所述步骤(2)中采用不同体积比的二氯甲烷和无水甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，所述二氯甲烷与无水甲醇的体积比分别为200:1、180:1、100:1和50:1，收集50:1的洗脱液。
12.利用罗丹明800制备荧光探针的合成路线如下：
[0013][0014]
所述荧光探针在检测亚硝酸根离子中的应用。
[0015]
采用所述荧光探针检测亚硝酸根离子时，通过荧光光谱或紫外吸收光谱进行检测，观察荧光探针与亚硝酸根离子反应前后的荧光光谱变化及紫外吸收光谱变化。
[0016]
荧光光谱的变化：在盐酸缓冲(0.1mol/l，ph＝1)体系中，6μm荧光探针和5μm的no
2-在65℃下加热5min，以625nm为激发波长时，在650nm处的荧光迅速猝灭，约5min达到响应平台；以625nm为激发波长时，在含有6μm荧光探针的盐酸缓冲(0.1mol/l，ph＝1)体系中，分别加入不同浓度的no
2-，于65℃下加热5min，冷却后测试荧光光谱，在650nm处的荧光逐渐猝灭，且荧光强度的变化量δf与no
2-的浓度具有很好的线性关系。
[0017]
紫外吸收光谱变化：在盐酸缓冲(0.1mol/l，ph＝1)体系中，加入探针储备液使荧光探针的浓度为6μm，然后再分别加入不同浓度的no
2-，于65℃下加热5min，冷却后测试紫外吸收光谱，625nm处的吸收峰强度逐渐减弱，且紫外吸收强度的变化量δa与no
2-的浓度具有很好的线性关系。
[0018]
所述荧光探针用于检测饮用水和环境水样中的亚硝酸根离子。
[0019]
本发明的有益效果是：
[0020]
(1)本发明首次将含肟基团的荧光探针应用于亚硝酸根离子的检测中，在罗丹明800上引入偕胺肟位点后，荧光探针与亚硝酸根反应时，形成稳定的五元氮氧杂环，能有效避免其他阴离子的干扰；
[0021]
(2)本发明中荧光探针的检测机理不同于常见的检测亚硝酸根离子的邻苯二胺结构，是一个新型的成环检测亚硝酸根离子的反应位点；
[0022]
(3)荧光探针的合成步骤简单，便于操作，具有良好的水溶性，能实现亚硝酸根离子的特异性检测和快速识别；
[0023]
(4)可以根据荧光强度信号与紫外吸收信号的变化定量分析亚硝酸根离子的含量，检测限低。
附图说明
[0024]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]
图1为本发明实施例1中合成的探针的1hnmr图谱；
[0026]
图2为本发明实施例1中合成的探针的高分辨质谱图；
[0027]
图3为在不同ph条件下6μm荧光探针与5μm亚硝酸根离子反应前后的荧光强度变化
图；
[0028]
图4为在盐酸缓冲(0.1mol/l，ph＝1)体系中，荧光探针6μm，以625nm为激发波长时，加入不同浓度no
2-在65℃下加热5min后的荧光变化图，及no
2-浓度与荧光强度的变化量(δf)之间的线性关系图。
[0029]
图5为在盐酸缓冲(0.1mol/l，ph＝1)体系中，荧光探针6μm，加入不同浓度no
2-在65℃下加热5min后的紫外吸收光谱图，及no
2-浓度与紫外吸收强度的变化量(δa)之间的线性关系图；
[0030]
图6为在盐酸缓冲(0.1mol/l，ph＝1)体系中，6μm荧光探针分别与不同的干扰物(干扰物浓度为250μm)作用后荧光强度变化的柱状图。
具体实施方式
[0031]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032]
实施例1
[0033]
荧光探针的合成
[0034]
在100ml圆底烧瓶中，加入111.5mg的罗丹明800，并加入200μl质量分数为50％的羟胺水溶液，再加入3ml无水甲醇和3ml二氯甲烷，室温下搅拌8-10h；反应结束后，将反应液重结晶、抽滤得固体，所得固体用二氯甲烷溶解，以二氯甲烷和无水甲醇为洗脱剂过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，洗脱剂中二氯甲烷和无水甲醇的体积比分别为200:1、180:1、100:1和50:1，收集50:1的洗脱液，经旋转蒸发得到探针的纯品。
[0035]
图1为实施例1合成的探针的核磁共振氢谱，谱图中显示如下数据：1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ10.05(s,1h),7.33(s,2h),6.41(s,2h),3.53(q,j＝5.6hz,8h),2.94(t,j＝6.4hz,4h),2.82(t,j＝6.3hz,4h),2.01
–
1.97(m,4h),1.94
–
1.91(m,4h)，其中δ＝10.05的单峰氢为偕胺肟上的羟基氢，δ＝6.41的两个氢为氨基上的两个氢，δ＝7.33的两个单峰氢为标号为1和14的两个氢，δ＝3.53的四重峰为标号是4、5、10、11的8个氢，δ＝2.94的三重峰为标号是7和8的4个氢，δ＝2.82的三重峰为标号是2和13的4个氢，δ在1.95附近的多重峰为标号为3、6、9和12的8个氢；
[0036]
图2为实施例1合成的探针的高分辨质谱图，质核比为429.2656的为探针的分子离子峰，质核比为430.2705的为m+1峰，质核比为413.2756的基峰为分子离子峰裂分出一个氨基后的碎片离子峰；
[0037]
由以上谱图数据可知，基于罗丹明800的偕胺肟结构的荧光探针已成功合成。
[0038]
实施例2
[0039]
荧光探针与no
2-反应前后，荧光强度变化量(δf)与ph之间的关系
[0040]
配制ph为1-10的缓冲溶液，其中ph为1和2的缓冲溶液采用盐酸配制，ph为3的缓冲溶液为hac-naac缓冲液，ph为4、5、6、7、8、9、10的缓冲溶液为pbs缓冲液；称取实施例1中合成的探针，用dmso溶解，准确配制2mm的探针储备液；准确称取亚硝酸钠13.8mg，配制20mm的亚硝酸钠母液10ml，准确量取1ml亚硝酸钠母液加水稀释至10ml，得到2mm的亚硝酸钠储备
液；将上述不同ph的缓冲溶液各取2ml，分别加入6μl的探针储备液，再分别加入5μl的亚硝酸钠储备液，在65℃下加热5min，冷却至室温后，以625nm为激发波长用荧光光谱仪测量各溶液的荧光光谱变化，观察不同ph条件下，探针与no
2-反应前后在650nm处的荧光强度变化。
[0041]
由图3可知，ph＝1时，探针的荧光强度的变化量最大，因此后续实施例中的实验均是在ph＝1的条件下进行的。
[0042]
实施例3
[0043]
荧光探针与不同浓度的no
2-反应后，荧光光谱与紫外吸收光谱的变化情况
[0044]
在2ml盐酸缓冲(0.1mol/l，ph＝1)体系中，加入6μl的探针储备液(2mmol/l)，再分别加入0μl、0.3μl、0.6μl、1μl、1.5μl、2μl、2.5μl、3μl、3.5μl、4μl、4.5μl、5μl、5.5μl、6μl的亚硝酸钠储备液(2mmol/l)，在65℃下加热5min，冷却至室温后，用荧光光谱仪和紫外吸收光谱仪分别测量各溶液荧光强度(激发波长625nm)及紫外吸收强度的变化。
[0045]
如图4所示，探针对亚硝酸根离子具有明显的响应，随着亚硝酸根离子浓度的增大，650nm处的荧光强度逐渐降低，并且亚硝酸根离子浓度在0.6-5.5μm时，荧光强度的变化量(δf)与亚硝酸根离子的浓度呈现良好的线性关系，线性方程为y＝334.37x-88.85，其中r2＝0.9907，y表示δf，x表示亚硝酸根离子的浓度，检测限为97nm，远低于包装饮用水(≤0.005mg/l)和环境水体(≤1mg/l)中no
2-的含量标准，灵敏度高。
[0046]
如图5所示，探针对亚硝酸根离子具有明显的响应，随着亚硝酸根离子浓度的增大，625nm处的紫外线吸收峰强度逐渐降低，并且亚硝酸根离子浓度在0.6-3.5μm时，紫外吸收峰强度的变化量(δa)与亚硝酸根离子的浓度呈现良好的线性关系，线性方程为y＝0.0904x-0.0236，其中r2＝0.9969，y表示δa，x表示亚硝酸根离子的浓度，检测限为86nm，远低于包装饮用水(≤0.005mg/l)和环境水体(≤1mg/l)中no
2-的含量标准，灵敏度高。
[0047]
上述现象说明，本发明制备的探针能够对溶液中的no
2-产生响应，可以通过荧光强度的变化或紫外吸收强度的变化实现no
2-的定量检测。
[0048]
实施例4
[0049]
荧光探针对no
2-的选择性
[0050]
干扰物溶液的配制：所有干扰物的浓度均为10mm，配制完成后，将所有溶液置于4℃条件下保存备用，干扰物包括：al
3+
，mg
2+
，mn
2+
，ca
2+
，fe
2+
，k
+
，cu
2+
，zn
2+
，na
+
，f-，br-，i-，s2o
32-，so
42-，so
32-，clo-，co
32-，no
3-，hpo
42-，gsh，cys；
[0051]
在2ml含有6μm探针的盐酸(0.1mol/l，ph＝1)缓冲体系中，分别加入no
2-和不同的干扰物溶液，no
2-的终浓度为5μm，干扰物的终浓度均为250μm，各溶液均在65℃条件下反应5min，冷却至室温后，以625nm为激发波长进行荧光光谱测定，观察各溶液在650nm处的荧光强度变化情况。
[0052]
如图6所示，所测干扰物对探针的荧光强度无明显影响，探针只对亚硝酸根离子有较强的响应，说明探针对亚硝酸根离子具有较高的选择性，能特异性识别亚硝酸根离子。
[0053]
实施例5
[0054]
荧光探针在饮用水及环境水样中的应用
[0055]
分别测试瓶装水(超市购买的瓶装饮用水，未做任何处理)和郑州大学校内眉湖水体(过0.22μm水系滤膜)中no
2-的含量，瓶装水和过滤后的眉湖水各取1ml作为待测样，在1ml盐酸和1ml待测样组成的ph＝1的体系中，先加入探针储备液，使探针的浓度为6μm，再分别
加入0μm、1μm、3μm和5μm的no
2-，在65℃条件下加热5min，冷却至室温，以625nm为激发波长，测量650nm处的荧光强度，根据图4中的标准工作曲线计算no
2-的含量，检测结果见表1。
[0056]
表1饮用水和眉湖水体中no
2-的检测结果
[0057][0058][0059]
由表1可知，瓶装水和眉湖水体中均未检出no
2-，符合包装饮用水和环境水体中no
2-含量的相关规定(国家规定包装饮用水中no
2-的含量不得超过0.005mg/l，美国环境保护协会要求环境水体中no
2-的含量不得超过1mg/l)，加标回收实验结果表明，本发明制备的探针可以用于检测饮用水和环境水体中no
2-的含量。
[0060]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的制备方法包括如下步骤：(1)将罗丹明800置于圆底烧瓶中，加入羟胺溶液，用二氯甲烷和无水甲醇作为反应溶剂，室温下搅拌；(2)反应结束，将反应液重结晶后用柱色谱法分离提纯，得到荧光探针。3.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，所述步骤(1)中罗丹明800与羟胺的物质的量之比为1:16。4.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，所述步骤(1)中的羟胺溶液为质量分数为50％的羟胺水溶液。5.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，所述步骤(1)中二氯甲烷与无水甲醇的体积比为1:1。6.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，所述步骤(2)中采用二氯甲烷和无水甲醇组成的混合液作为洗脱剂进行柱色谱分离。7.权利要求1-6任一项所述的荧光探针在检测亚硝酸根离子中的应用。8.根据权利要求7所述的荧光探针在检测亚硝酸根离子中的应用，其特征在于，用于检测饮用水和环境水样中的亚硝酸根离子。
技术总结本发明公开了一种荧光探针及其在检测亚硝酸根离子中的应用，在罗丹明800上引入肟的结构，得到基于罗丹明800的偕胺肟结构的荧光探针，首次将含肟基团的荧光探针应用于亚硝酸根离子的检测中，本发明合成的探针能与亚硝酸根离子发生快速反应，能特异性识别亚硝酸根离子，其结构式为本发明在罗丹明800上引入偕胺肟位点后，探针与亚硝酸根离子反应时，先与氨基发生重氮化反应，再与羟基发生环化反应，形成稳定的五元氮氧杂环，能有效避免其他阴离子的干扰，可以通过荧光强度变化或紫外吸收强度变化实现亚硝酸根离子的定量检测。定量检测。定量检测。
技术研发人员：杨冉 杨腾宇 孙远强 李朝辉 屈凌波
受保护的技术使用者：郑州大学
技术研发日：2022.07.14
技术公布日：2022/11/1
