1.本发明涉及草铵膦的检测技术领域，具体涉及一种草铵膦的检测方法。
背景技术：2.草铵膦为广谱、触杀型、灭生型、非残留除草剂，使用范围很广，其速效性在百草枯和草甘膦之间。从除草速度、除草效果、控制杂草再生时期等方面看，草铵膦的田间表现都很优异，随着草甘膦、百草枯的抗性杂草越来越严重，农民会因草铵膦卓越的防效及良好的环保性能而很易接受。对生态要求更安全的茶园、农场、绿色食品基地等，对草铵膦的需求也越来越大。因此，很有必要建立一种简单、快速的草铵膦检测方法。
3.草铵膦分子中含有-cooh，-oh及-nh2基团，具有很强的离子性，分子结构不存在共轭双键，缺少发色和荧光基团特性，直接进行检测时存在仪器响应低，干扰大的问题。目前对草铵膦检测的方法主要有气相色谱法、气相-质谱联用、高效液相色谱法、液相-质谱联用、离子色谱法、毛细管电泳法等；较大多数在检测草铵膦过程中存在使用特殊的不能普及的色谱仪或者色谱柱、又或者衍生温度高，衍生时间长等缺点。
技术实现要素：4.针对现有技术的不足和检测的理念，本发明在于提供一种草铵膦的检测方法，解决草铵膦的检测问题。
5.根据本发明具体实施方式的草铵膦含量的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
6.(1)使用芳香类酰氯对待测样品中的草铵膦进行衍生，其中，芳香类酰氯与待测样品的质量比为1:(8-50)；优选地，芳香类酰氯与待测样品的质量比为1:10；
7.(2)使用高效液相色谱检测草铵膦衍生物。
8.本发明中，待测样品包括草铵膦标准品和含有草铵膦的供试品；其中，草铵膦是有效成分，草铵膦铵盐是成盐稳定形式。
9.根据本发明具体实施方式的草铵膦含量的检测方法，步骤(1)中，芳香类酰氯为对氯苯甲酰氯。
10.对氯苯甲酰氯与草铵膦进行衍生反应，草铵膦衍生物可通过液相进行检测，并能够实现与草铵膦结构类似物质的有效分离(分离度大于1.5)。
[0011][0012]
在草铵膦的生产过程中，会有很多类似草铵膦的结构的杂质，具有很强的离子性，分子结构不存在共轭双键，缺少发色和荧光基团特性，直接进行检测时存在仪器响应低，干扰大的问题。此类草铵膦杂质的结构含有-oh或-nh2基团，残留的甲醇、乙醇等试剂均可以与活泼的对氯苯甲酰氯进行衍生，衍生产物在高效液相色谱中得到分离和检测，而且对氯
苯甲酰氯衍生产物含有氯元素，方便判断杂质的结构和性质。
[0013]
草铵膦所含有的杂质如下：
[0014][0015]
式中r可为h、-ch3、-c2h5等基团。
[0016]
根据本发明具体实施方式的草铵膦含量的检测方法，步骤(1)中，将芳香类酰氯溶液加入待测样品溶液中，在2500转/min涡旋3min混合均匀，进行衍生。
[0017]
本发明在常温下涡旋混合，5分钟内完成衍生，条件比较温和，时间短，反应快，效率高。
[0018]
根据本发明具体实施方式的草铵膦含量的检测方法，步骤(2)中，高效液相色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，以乙腈为流动相a，以0.01％的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为200-280nm。
[0019]
根据本发明具体实施方式的草铵膦含量的检测方法，步骤(2)中，采用150
×
4.6mm,5μm的十八烷基硅烷键合硅胶为填充物。
[0020]
根据本发明具体实施方式的草铵膦含量的检测方法，步骤(2)中，梯度洗脱条件为0-10min，流动相a的体积比例由5％变为90％，流动相b的体积比例由95％变为10％，后运行5min。
[0021]
根据本发明具体实施方式的草铵膦含量的检测方法，步骤(1)中，使用naoh来催化反应，中和水解产生的hcl，使得待检测溶液样品是中性，ph为5-7,便于检测分析，同时也利于保护色谱仪器。
[0022]
根据本发明具体实施方式的草铵膦含量的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0023]
(1)将草铵膦标准品或者供试品分别配制成浓度为1mg/ml的标准品溶液和供试品溶液；
[0024]
(2)精确移取配制好的标准品溶液、供试品溶液各1.0ml，分别于15ml塑料离心管中，加入1.0ml7.5mg/ml的naoh溶液，混合均匀。加入2.0ml浓度为5mg/ml对氯苯甲酰氯(pcbc)溶液，2500转/min涡旋3min混合均匀，再用超纯水定容至刻度线，2500转/min涡旋10s后用0.22μm ptfe滤膜过滤；
[0025]
(3)采用150
×
4.6mm,5μm的十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，以乙腈为流动相a，以0.01％的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为0-10min，流动相a的体
积比例由5％变为90％，流动相b的体积比例由95％变为10％，后运行5min，流速为1.0ml/min，检测波长为240nm。
[0026]
根据本发明具体实施方式的草铵膦含量的检测方法，按外标法，以峰面积计算草铵膦(或草铵膦衍生物)的含量；其中，
[0027]
草铵膦含量(％)＝(待测样品峰面积/标准品峰面积)*(标准品浓度/待测样品浓度)*100％。
[0028]
本发明的有益效果：
[0029]
本发明提供对氯苯甲酰氯衍生法检测草铵膦的高效液相方法，利用对氯苯甲酰氯的活性，通过衍生化反应生产具备紫外相应的基团，即对氯苯甲酰氯与草铵膦反应引入共轭结构，具有紫外响应特性，再根据外标法进行含量计算。
[0030]
本发明的方法经精密度试验、线性关系和范围试验和加标回收试验等方法学验证，结果表明本发明的方法准确可靠，检测迅速；成本低廉，检测范围宽；灵敏度高，精确度高，稳定性好，专属性高。
[0031]
样品中其他含有羟基或者氨基的杂质化合物均可以发生衍生反应，不干扰草铵膦含量的检测。本发明在农药检测分析领域具有良好的应用前景和潜在的应用价值。
附图说明
[0032]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]
图1显示草铵膦衍生物线性关系；
[0034]
图2显示草铵膦标准品溶液色谱图；
[0035]
图3显示苯甲酰氯衍生草铵膦标准品溶液色谱图；
[0036]
图4显示对甲基苯磺酰氯衍生草铵膦标准品溶液色谱图；
[0037]
图5显示对氯苯甲酰氯衍生草铵膦样品溶液色谱图及性能参数。
具体实施方式
[0038]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0039]
本发明经过广泛的研究和大量的实验，摸索到一种对氯苯甲酰氯衍生草铵膦高效液相色谱检测方法。
[0040]
本发明各实例的实验条件如下：
[0041]
色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，选用规格为agilent eclipse plus-c18(150
×
4.6mm,5μm)柱进行试验；
[0042][0043]
实施例1草铵膦含量的测定
[0044]
(1)样品配制：
[0045]
精确称量标准品或者供试品50mg，放入50ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度线，摇匀，浓度为1mg/ml的草铵膦溶液。
[0046]
(2)样品衍生化处理：
[0047]
精确移取配制好的标准品或者供试品溶液1.0ml于15ml塑料离心管中，加入1.0ml7.5mg/ml的naoh溶液，混合均匀。加入2.0ml浓度为5mg/ml对氯苯甲酰氯(pcbc)溶液，2500转/min涡旋3min混合均匀，再用超纯水定容至刻度线，2500转/min涡旋10s后用0.22μm ptfe滤膜过滤；
[0048]
(3)空白溶液配制：
[0049]
精确移取超纯水1.0ml于15ml塑料离心管中，加入1.0ml7.5mg/ml的naoh溶液，混合均匀。加入2.0ml浓度为5mg/ml对氯苯甲酰氯(pcbc)溶液，2500转/min涡旋3min混合均匀，再用超纯水定容至刻度线，2500转/min涡旋10s后用0.22μm ptfe滤膜过滤；
[0050]
采用设定的色谱条件分别对空白溶液、标准品溶液以及样品溶液，并记录色谱图。
[0051]
实施例2方法学验证
[0052]
1.定量限实验
[0053]
根据实施例1中溶液配制方法，配制定量限实验的标准溶液，即线性溶液的最低点，浓度为0.025mg/ml的标准溶液为定量限溶液)，并进行检测分析，记录色谱图。
[0054]
实验结果表明，当浓度为0.025mg/ml草铵膦经过衍生后，色谱峰峰高与基线噪音的比值依然可达到124，灵敏度好。
[0055]
2.线性关系及范围实验
[0056]
根据实施例1中溶液配制方法，配制浓度为10.0mg/ml的草铵膦标准储备溶液，移取适当标准品储备溶液到10ml容量瓶中，用水稀释至刻度，配制成草铵膦浓度为0.025mg/ml(定量限溶液)、0.1mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml以及1.5mg/ml的线性标准溶液，按照实施例1中衍生条件进行衍生成草铵膦溶液的衍生产物。
[0057]
将配制好的线性实验的标准溶液进行检测，连续进样，每个样品进一针，记录保留时间和衍生物峰面积，按照本发明分析方法，对进样量(x)和峰面积(y)进行数据回归分析，记录结果见表1和图1。
[0058]
表1线性关系实验结果
[0059][0060][0061]
通过计算，线性回归方程为y＝42652x+72.569，r2＝0.9991，r＝0.99955。结果表明草铵膦衍生物在0.025mg/ml(定量限浓度)-1.5mg/ml(150％浓度)浓度范围内，峰面积和进样量呈良好的线性关系。
[0062]
3.精密度实验
[0063]
根据实施例1中溶液配制方法，配制精密度实验的样品溶液，配制浓度为1.0mg/ml的草铵膦溶液，平行配制6份，按照实施例1中衍生条件进行衍生成浓度为0.1mg/ml的草铵膦溶液的衍生产物。
[0064]
将配制好的精密度实验的样品溶液进行检测，连续进样，每个样品进一针，记录保留时间和衍生物峰面积，并外标法计算结果并对结果进行评价，记录结果见表2。
[0065]
表2精密度实验结果
[0066][0067]
结果如表2所示，含量测定的rsd值为0.48％，说明本发明衍生法测定草铵膦含量精密度高，重现性好。
[0068]
4.加标回收率实验
[0069]
准确称取已知含量的草铵膦样品，再分别加入一定量的草铵膦标准品溶液，配制成草铵膦浓度为0.8mg/ml(80％)、1.0mg/ml(100％)及1.2mg/ml(120％)的溶液，每种浓度平行配制3份。
[0070]
按照实施例1所述的方法，依次测定，外标法计算回收率，结果平均回收率为99.0％，rsd为0.53％，表明该方法的加标回收率好。
[0071]
5.稳定性实验
[0072]
取草铵膦样品，按照实施例1的方法衍生配制，室温下放置0h、12h、24h及48h后，采用实施例1的方法进行检测，计算草铵膦衍生物峰面积的相对标准偏差。
[0073]
衍生后的草铵膦样品室温放置0h、12h、24h及48h后，各样品测得的峰面积的rsd为0.47％，表明草铵膦衍生后溶液在48h内稳定。
[0074]
6.衍生时间实验
[0075]
取草铵膦样品，按照实施例1方法配制，室温下不同涡旋条件混合均匀，采用设定的方法进行检测，及液相色谱-质谱连用确认衍生情况。计算衍生完全后草铵膦衍生物峰面积的相对标准偏差，具体结果见表3。
[0076]
表3衍生时间实验结果
[0077][0078]
结果如表3所示，峰面积的rsd为0.67％，综合评估2000转/min涡旋2分钟基本衍生完全，本发明选择2500转/min涡旋3min混合均匀为实验条件。
[0079]
实施例3比较其他芳香类酰氯和磺酰氯衍生情况
[0080]
选择芳香类酰氯和磺酰氯在碱性溶液中，如常见的naoh、koh等强碱，或者强碱弱酸盐，如磷酸盐(如na3po4、k3po4等)、磷酸氢盐(如na2hpo4、k2hpo4等)、四硼酸钠强碱弱酸盐，或者强碱弱酸盐与强碱的混合溶液，与草铵膦进行衍生，目的在于引入有紫外吸收的芳环类基团，使草铵膦能够用普通的高效液相色谱进行检测。
[0081]
本发明中选择对氯苯甲酰氯、苯甲酰氯、对甲基苯磺酰氯等芳香类酰氯和磺酰氯为例，与草铵膦标准品进行衍生。衍生后溶液经过高效液相色谱质谱连用仪分析，发现对氯苯甲酰氯完全衍生，而苯甲酰氯和对甲基苯磺酰氯有微量剩余。
[0082]
图2中为对氯苯甲酰氯衍生溶液色谱图，经lcms确认，保留时间5.31min处为草铵膦衍生主峰，6.21min处为对氯苯甲酰胺峰，7.83min处为对氯苯甲酸峰，上述特征峰响应好且草铵膦衍生完全。
[0083]
图3中为苯甲酰氯衍生溶液色谱图，经lcms确认，保留时间4.36min处为草铵膦衍生主峰，4.82min处为苯甲酰胺峰，6.56min处为苯甲酸峰，上述特征峰响应好但草铵膦衍生微量剩余。
[0084]
图4中为对甲基苯磺酰氯衍生溶液色谱图，经lcms确认，保留时间5.31min处为草铵膦衍生主峰，6.21min处为对甲基苯磺酰胺峰，3.86min处为对甲基苯磺酸峰，对甲基苯磺酸峰型拖尾，且草铵膦衍生微量剩余。
[0085]
在实验中发现，对甲基苯磺酰氯的水解产物对甲基苯磺酸在液相中峰型拖尾，苯甲酰氯的水解产物苯甲酸的溶解度比对氯苯甲酰氯水解产物对氯苯甲酸的溶解度好，浓度高，在液相色谱中容易过载，出现平头峰。对氯苯甲酰氯的衍生物含有氯元素，结合质谱信
号，容易推断化合物的结构，且水解产物峰型相对苯甲酰氯和对甲基苯磺酰氯水解产物峰型更好一点，优选地选择对氯苯甲酰氯作为衍生剂。
[0086]
图5中为对氯苯甲酰氯衍生草铵膦样品溶液的色谱图，经lcms确认，保留时间5.3min处为草铵膦衍生主峰，5.08min处为草铵膦酰胺衍生峰，6.0min处为草铵膦氨基腈衍生峰，6.5min处为草铵膦甲酯衍生峰，6.9min处为草铵膦羟醇衍生峰，7.3min处为草铵膦乙酯衍生峰，10.0min处为甲醇衍生峰。衍生后，在本发明的摸索的色谱条件下，各个相邻峰的分离的均大于1.5，各个化合物均能达到分析检测的效果。
[0087]
实施例4本发明方法与其他方法对比
[0088]
草铵膦常用的检测方法有国标法gb/t33808-2017草铵膦原药和衍生化法，其中常用的衍生剂是9-芴甲基氯甲酸酯(fmoc-cl)，有很多研究者对其进行了改进。在本发明中也进行了国标法和9-芴甲基氯甲酸酯(fmoc-cl)衍生法的对比，对比结果见表4。
[0089]
表4不同检测方法实验结果
[0090][0091]
对比国标法和衍生化法，同样三批次实验结果基本一致，方法准确性一致，但是国标采用的内装sax的强阴离子交换柱，柱子较贵，使用高盐体系，易造成柱效降低，保留时间漂移。而衍生法使用常规色谱柱，柱子稳定耐用，保留时间稳定，重复性好，结果同国标法一样准确可靠。pcbc衍生法对比fmoc-cl衍生法更是操作简单，时间短，衍生快，并且能检测到其他含-oh和-nh2类杂质，方法的准确性、专属性都较好。
[0092]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
技术特征：1.一种草铵膦含量的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：(1)使用芳香类酰氯对待测样品中的草铵膦进行衍生，其中，芳香类酰氯与待测样品的质量比为1:(8-50)；(2)使用高效液相色谱检测草铵膦衍生物。2.根据权利要求1所述的草铵膦含量的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，芳香类酰氯为对氯苯甲酰氯。3.根据权利要求1或2所述的草铵膦含量的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，将芳香类酰氯溶液加入待测样品溶液中，在2500转/min涡旋3min混合均匀，进行衍生。4.根据权利要求1所述的草铵膦含量的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，高效液相色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，以乙腈为流动相a，以0.01％的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为200-280nm。5.根据权利要求4所述的草铵膦含量的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，采用150
×
4.6mm,5μm的十八烷基硅烷键合硅胶为填充物。6.根据权利要求4所述的草铵膦含量的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，梯度洗脱条件为0-10min，流动相a的体积比例由5％变为90％，流动相b的体积比例由95％变为10％，后运行5min。7.根据权利要求1所述的铵膦铵盐含量的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，在待测样品溶液中加入naoh溶液后，再加入芳香类酰氯进行衍生。8.根据权利要求1所述的草铵膦含量的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：(1)将草铵膦标准品或者供试品分别配制成浓度为1mg/ml的标准品溶液和供试品溶液；(2)精确移取配制好的标准品溶液、供试品溶液各1.0ml，分别于15ml塑料离心管中，加入1.0ml7.5mg/ml的naoh溶液，混合均匀；加入2.0ml浓度为5mg/ml对氯苯甲酰氯(pcbc)溶液，2500转/min涡旋3min混合均匀，再用超纯水定容至刻度线，2500转/min涡旋10s后用0.22μm ptfe滤膜过滤；(3)采用150
×
4.6mm,5μm的十八烷基硅烷键合硅胶为填充物，以乙腈为流动相a，以0.01％的磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为0-10min，流动相a的体积比例由5％变为90％，流动相b的体积比例由95％变为10％，后运行5min，流速为1.0ml/min，检测波长为240nm。9.根据权利要求1或8所述的草铵膦含量的检测方法，其特征在于：按外标法，以峰面积计算草铵膦的含量；其中，草铵膦含量(％)＝(待测样品峰面积/标准峰面积)*(标准品浓度/待测样品浓度)*100％。
技术总结本发明提供了一种快速定量检测草铵膦的高效液相方法，其中，流动相：乙腈和0.01％的磷酸水溶液(体积比)；流速：1.0mL/min；色谱柱：AgilentEclipse Plus-C18(150
技术研发人员：李静 张金萍 吴少祥 高瑞 李梦菲 马文旭 李海伟
受保护的技术使用者：锦州怡嘉科技有限公司
技术研发日：2022.06.30
技术公布日：2022/11/1
