一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒及其制备与检测方法
技术领域
1.本发明涉及免疫学测定领域，尤其涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒及其制备与检测方法。
背景技术：2.目前，p1np的检测方法主要有酶联免疫吸附测定法(elisa)和化学发光免疫分析法(clia)。其中，酶联免疫吸附测定法，是利用已知抗体与抗原的特异结合，再加入能与待测抗原产生特异反应的酶联抗体，最后加入相应酶的底物，抗原含量根据有色酶解产物的颜色深浅来判断；该方法检测灵敏度高，但操作过程略显复杂、测定时间较长、影响因素多，且此法多用于科学研究，不能用于临床诊断。化学发光免疫分析法，是将免疫反应与发光反应相结合的一种定量分析技术，运用抗原抗体反应，再利用某些化合物被氧化剂氧化或催化剂催化后，由激发态到基态转换从而将剩余能量转变为光子，利用这些原理，将发光物质标记于抗原或抗体上，其产生的光量子强度与所测抗原浓度成比例；该技术自动化操作速度快、准确度高，具有一定的临床应用价值，但成本高、设备昂贵、稳定性较差，无法普及中基层医院及医疗机构。
3.胶乳增强免疫比浊法(petia)，是利用抗原抗体的特异性结合，在纳米尺度的胶乳微球的表面交联或物理吸附抗体，试剂反应液中交联有抗体的微球与样本中的抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，形成浊度，从而改变反应液的散光性能或透光性能，在线性范围内可以反映被测抗原的浓度。胶乳增强免疫比浊法的优点是操作简便，几分钟就能获得结果。此外，全自动免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。
技术实现要素：4.本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒及其制备与检测方法。
5.本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
6.一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2；所述试剂r1包括：r1缓冲液20～50mmol/l，表面活性剂5～30ml/l，稳定剂5～20g/l，防腐剂0.05～2g/l，增敏剂10～30g/l；所述试剂r2包括：r2缓冲液20～50mmol/l，表面活性剂5～20ml/l，稳定剂5～30g/l，p1np抗体0.8～1.2ug/ml，100～120nm乳胶微球颗粒1～15ml/l，120～150nm乳胶微球颗粒1～15ml/l，防腐剂0.05～2g/l，活化缓冲液20～50mmol/l，偶联缓冲液20～50mmol/l。
7.作为本发明的优选方式之一，所述r1缓冲液、r2缓冲液、活化缓冲液与偶联缓冲液分别为硼酸缓冲液、硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、hepes缓冲液、tris-hcl
缓冲液、good's缓冲液中的一种。
8.作为本发明的优选方式之一，所述表面活性剂为吐温-20，曲拉通x-100，丙三醇中的至少一种。
9.作为本发明的优选方式之一，所述稳定剂为蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶、小牛血清白蛋白、酪蛋白中的至少一种。
10.作为本发明的优选方式之一，所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、proclin300、异噻唑啉酮中的至少一种。
11.作为本发明的优选方式之一，所述增敏剂为聚乙二醇6000、氟化钠中的至少一种。
12.作为本发明的优选方式之一，所述p1np抗体为鼠抗人p1np单克隆抗体、羊抗人p1np单克隆抗体、兔抗人p1np单克隆抗体中的至少一种，或者是，鼠抗人p1np多克隆抗体、羊抗人p1np多克隆抗体、兔抗人p1np多克隆抗体中的至少一种。
13.作为本发明的优选方式之一，所述p1np抗体分别与100～120nm乳胶微球颗粒、120～150nm乳胶微球颗粒偶联反应结合，形成包被有p1np抗体的两不同粒径胶乳微球。
14.一种上述基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
15.(1)配制试剂r1：
16.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
17.(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
18.按照试剂r2的组分含量，将r2缓冲液、表面活性剂、稳定剂和防腐剂进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液；
19.(3)配制试剂r2：
20.①
按1:1的比例取粒径为100～120nm的胶乳微与粒径为120～150nm的胶乳微球，加入活化缓冲液后充分混匀，置于恒温摇床中反应30～50min，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
21.②
加入p1np抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应30～50min，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
22.③
加入活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应1～2h，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
23.④
加入封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应2～3h，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
24.⑤
加入偶联缓冲液，调整溶液的ph值至7.0～8.0；
25.⑥
反应完成后，离心用冷冻离心机去除上清液，温度为4℃，转速为20000rpm，离心时间为30～50min；
26.⑦
去除上清液，并用步骤(2)的稀释缓冲液进行复溶，重悬胶乳微球；重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，超声4～6min，功率210～300w，隔1s超1s，制得试剂r2。
27.作为本发明的优选方式之一，活化剂：nhs 25mg/ml，edc 9.0mg/ml，现配现用；封闭液：bsa 10g/l。
28.一种上述基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
29.(1)吸取10μl样本，加入240μl试剂r1，37℃孵育3～5min；
30.(2)再加入60μl试剂r2，置于37℃孵育；
31.(3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于600nm波长下测定吸光值bl；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值b2；
32.(4)按照
△
b＝b2-b1来计算吸光度变化值δb，并根据δb计算出样本中p1np含量。
33.作为本发明的优选方式之一，通过将δb代入“吸光度变化值与p1np浓度的线性关系公式”来确定p1np含量；其中，”吸光度变化值与p1np浓度的线性关系公式”通过如下方法获得：
34.(1)配制校准品缓冲液：
35.校准品缓冲液包括：
36.甘氨酸缓冲液 50mmol/l，ph7.2
37.nacl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5g/l
38.叠氮钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1g/l；
39.(2)配制各种浓度梯度的校准品
40.用校准品缓冲液稀释纯化好的p1np抗原，配制校准品浓度点依次为：0ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml；
41.(3)绘制校准曲线并得到相应公式：
42.分别向得到的10μl p1np标准品中加入240μl试剂r1，混匀，37℃孵育3～5min；接着，加入60μl试剂r2，置于37℃孵育；孵育20s后，采用全自动生化分析仪，600nm波长下测定吸光值al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值a2；分别计算标准品的吸光度变化值
△
a＝a2-a1，并绘制校准曲线；校准曲线使用多点非线性拟合，得出吸光度变化值与p1np浓度的线性关系公式。
43.本发明p1np测定试剂盒，基于胶乳增强免疫比浊法(petia)，其原理是采用化学偶联法将特异性抗体结合于一定粒径的胶乳颗粒表面，当交联有抗体的微球与抗原结合后，短时间内迅速聚集在一起，从而改变反应液的吸光度。根据吸光度增加量，即可在特定波长处测定免疫复合物浊度，定量检测血清中的p1np含量。
44.本发明相比现有技术的优点在于：
45.(1)本发明基于胶乳增强免疫比浊，抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了elisa法反复孵育和洗板等繁琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力；同时，相比化学发光免疫分析法，成本低，适用性强、测试方便，可广泛应用于临床检测；
46.(2)本发明试剂盒通过不同粒径的胶乳微球组合，可以使该p1np测定试剂的性能达到更宽线性范围，可实现对p1np的准确检测；
47.(3)本发明试剂盒可在具备有560～640nm波长的全自动生化分析仪上检测血液中p1np的含量，直接上机使用，快速精准，自动化程度高，大大提高工作效率；且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。
附图说明
48.图1是实施例6中本发明试剂盒的线性拟合曲线图。
具体实施方式
49.下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
50.实施例1
51.本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
52.试剂r1包括：硼酸缓冲液(ph7)20mmol/l，吐温-20 5ml/l，蔗糖5g/l，叠氮化钠0.05g/l，聚乙二醇600010g/l。
53.试剂r2包括：硼酸缓冲液(ph7)20mmol/l，吐温-20 5ml/l，乙二胺四乙酸二钠5g/l，羊抗人p1np单克隆抗体0.8ug/ml，100nm乳胶微球颗粒1ml/l，120nm乳胶微球颗粒1ml/l，庆大霉素0.05g/l，硼酸钠缓冲液(ph5)20mmol/l，甘氨酸缓冲液(ph7)20mmol/l。
54.其中，所述试剂r2中，p1np抗体分别与100nm乳胶微球颗粒、120nm乳胶微球颗粒偶联反应结合，形成包被有p1np抗体的两不同粒径胶乳微球。该过程中，硼酸钠缓冲液作为活化缓冲液，甘氨酸缓冲液作为偶联缓冲液。
55.制备方法：
56.(1)配制试剂r1：
57.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
58.(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
59.按照试剂r2的组分含量，将硼酸缓冲液、吐温-20、乙二胺四乙酸二钠和庆大霉素进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液；
60.(3)配制试剂r2：
61.①
按1:1的比例取粒径为100nm的胶乳微与粒径为120nm的胶乳微球，加入活化缓冲液后充分混匀，置于恒温摇床中反应30min，温度30℃，转速200rpm/min；
62.②
加入p1np抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应30min，温度30℃，转速200rpm/min；
63.③
加入活化剂(nhs 25mg/ml，edc 9.0mg/ml，现配现用)，混匀，并置于恒温摇床中反应1h，温度30℃，转速200rpm/min；
64.④
加入封闭液(bsa 10g/l)，混匀，并置于恒温摇床中反应2h，温度范围：30℃，转速200rpm/min；
65.⑤
加入偶联缓冲液，调整溶液的ph值至7.0；
66.⑥
反应完成后，离心用冷冻离心机去除上清液，温度为4℃，转速为20000rpm，离心时间为30min；
67.⑦
去除上清液，并用步骤(2)的稀释缓冲液进行复溶，重悬胶乳微球；重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，超声4min，功率210w，隔1s超1s，制得试剂r2。
68.实施例2
69.本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
70.试剂r1包括：硼酸钠缓冲液(ph7.5)30mmol/l，曲拉通x-100 10ml/l，海藻糖10g/
l，硫柳汞1g/l，氟化钠20g/l。
71.试剂r2包括：硼酸钠缓冲液(ph7.5)30mmol/l，曲拉通x-100 10ml/l，明胶10g/l，鼠抗人p1np多克隆抗体1.0ug/ml，110nm乳胶微球颗粒10ml/l，130nm乳胶微球颗粒10ml/l，异噻唑啉酮1g/l，甘氨酸缓冲液(ph6)30mmol/l、磷酸盐缓冲液(ph7.5)30mmol/l。
72.其中，所述p1np抗体分别与110nm乳胶微球颗粒、130nm乳胶微球颗粒偶联反应结合，形成包被有p1np抗体的两不同粒径胶乳微球。该过程中，甘氨酸缓冲液作为活化缓冲液，磷酸盐缓冲液作为偶联缓冲液。
73.制备方法：
74.(1)配制试剂r1：
75.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
76.(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
77.按照试剂r2的组分含量，将硼酸钠缓冲液、曲拉通x-100、明胶和异噻唑啉酮进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液；
78.(3)配制试剂r2：
79.①
按1:1的比例取粒径为110nm的胶乳微与粒径为130nm的胶乳微球，加入活化缓冲液后充分混匀，置于恒温摇床中反应40min，温度35℃，转速300rpm/min；
80.②
加入p1np抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应40min，温度35℃，转速300rpm/min；
81.③
加入活化剂(nhs 25mg/ml，edc 9.0mg/ml，现配现用)，混匀，并置于恒温摇床中反应1.5h，温度35℃，转速300rpm/min；
82.④
加入封闭液(bsa 10g/l)，混匀，并置于恒温摇床中反应2.5h，温度35℃，转速300rpm/min；
83.⑤
加入偶联缓冲液，调整溶液的ph值至7.5；
84.⑥
反应完成后，离心用冷冻离心机去除上清液，温度为4℃，转速为20000rpm，离心时间为40min；
85.⑦
去除上清液，并用步骤(2)的稀释缓冲液进行复溶，重悬胶乳微球；重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，超声5min，功率250w，隔1s超1s，制得试剂r2。
86.实施例3
87.本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
88.试剂r1包括：tris-hcl缓冲液(ph7.4)50mmol/l，吐温-20 15ml/l，甘油5g/l，叠氮钠0.5g/l，聚乙二醇6000 15g/l。
89.试剂r2包括：tris-hcl缓冲液(ph7.4)50mmol/l，吐温-20 15ml/l，甘油10g/l，鼠抗人p1np单克隆抗体1.0ug/ml，104nm乳胶微球颗粒10ml/l，120nm乳胶微球颗粒10ml/l，proclin300 1.0g/l，hepes缓冲液(ph7.0)50mmol/l，硼酸缓冲液(ph7.4)50mmol/l。
90.其中，所述p1np抗体分别与104nm乳胶微球颗粒、120nm乳胶微球颗粒偶联反应结合，形成包被有p1np抗体的两不同粒径胶乳微球。该过程中，hepes缓冲液作为活化缓冲液，硼酸缓冲液作为偶联缓冲液。
91.制备方法：
92.(1)配制试剂r1：
93.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
94.(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
95.按照试剂r2的组分含量，将tris-hcl缓冲液、吐温-20、甘油和proclin300进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液；
96.(3)配制试剂r2：
97.①
按1:1的比例取粒径为104nm的胶乳微与粒径为120nm的胶乳微球，加入活化缓冲液后充分混匀，置于恒温摇床中反应40min，温度37℃，转速400rpm/min；
98.②
加入p1np抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应40min，温度37℃，转速400rpm/min；
99.③
加入活化剂(nhs 25mg/ml，edc 9.0mg/ml，现配现用)，混匀，并置于恒温摇床中反应1.5h，温度37℃，转速300rpm/min；
100.④
加入封闭液(bsa 10g/l)，混匀，并置于恒温摇床中反应2～3h，温度37℃，转速400rpm/min；
101.⑤
加入偶联缓冲液，调整溶液的ph值至7.4；
102.⑥
反应完成后，离心用冷冻离心机去除上清液，温度为4℃，转速为20000rpm，离心时间为40min；
103.⑦
去除上清液，并用步骤(2)的稀释缓冲液进行复溶，重悬胶乳微球；重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，超声5min，功率250w，隔1s超1s，制得试剂r2。
104.实施例4
105.本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2。
106.试剂r1包括：good's缓冲液(ph8)50mmol/l，丙三醇30ml/l，酪蛋白20g/l，proclin300 2g/l，氟化钠30g/l。
107.试剂r2包括：good's缓冲液(ph8)50mmol/l，丙三醇20ml/l，酪蛋白30g/l，兔抗人p1np单克隆抗体1.2ug/ml，120nm乳胶微球颗粒15ml/l，150nm乳胶微球颗粒15ml/l，proclin300 2g/l，甘氨酸缓冲液(ph7.5)50mmol/l，磷酸盐缓冲液(ph8)50mmol/l。
108.其中，所述p1np抗体分别与120nm乳胶微球颗粒、150nm乳胶微球颗粒偶联反应结合，形成包被有p1np抗体的两不同粒径胶乳微球。该过程中，甘氨酸缓冲液作为活化缓冲液，磷酸盐缓冲液作为偶联缓冲液。
109.制备方法：
110.(1)配制试剂r1：
111.按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；
112.(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：
113.按照试剂r2的组分含量，将good's缓冲液、丙三醇、酪蛋白和proclin300进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液；
114.(3)配制试剂r2：
115.①
按1:1的比例取粒径为120nm的胶乳微与粒径为150nm的胶乳微球，加入活化缓冲液后充分混匀，置于恒温摇床中反应50min，温度37℃，转速500rpm/min；
116.②
加入p1np抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应50min，温度37℃，转速500rpm/min；
117.③
加入活化剂(nhs 25mg/ml，edc 9.0mg/ml，现配现用)，混匀，并置于恒温摇床中反应2h，温度37℃，转速500rpm/min；
118.④
加入封闭液(bsa 10g/l)，混匀，并置于恒温摇床中反应3h，温度37℃，转速500rpm/min；
119.⑤
加入偶联缓冲液，调整溶液的ph值至8.0；
120.⑥
反应完成后，离心用冷冻离心机去除上清液，温度为4℃，转速为20000rpm，离心时间为50min；
121.⑦
去除上清液，并用步骤(2)的稀释缓冲液进行复溶，重悬胶乳微球；重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，超声6min，功率300w，隔1s超1s，制得试剂r2。
122.对比例1
123.本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，其组分、制备工艺与实施例3大致相同，主要不同之处在于：两种微球使用的比例为3(104nm微球):1(120nm微球)。
124.对比例2
125.本实施例的一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，其组分、制备工艺与实施例3大致相同，主要不同之处在于：封闭后，直接用稀释液稀释。
126.实施例5
127.本实施例的一种上述基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
128.(1)吸取10μl样本，加入240μl试剂r1，37℃孵育3～5min；
129.(2)再加入60μl试剂r2，置于37℃孵育；
130.(3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于600nm波长下测定吸光值bl；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值b2；
131.(4)按照
△
b＝b2-b1来计算吸光度变化值δb，并将δb代入“吸光度变化值与p1np浓度的线性关系公式”来确定p1np含量。
132.其中，吸光度变化值与p1np浓度的线性关系公式通过如下方法获得：
133.(1)配制校准品缓冲液：
134.校准品缓冲液包括：
135.甘氨酸缓冲液 50mmol/l，ph7.2
136.nacl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
5g/l
137.叠氮钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1g/l；
138.(2)配制各种浓度梯度的校准品
139.用校准品缓冲液稀释纯化好的p1np抗原，配制校准品浓度点依次为：0ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml；
140.(3)绘制校准曲线并得到相应公式：
141.分别向得到的10μl p1np标准品中加入240μl试剂r1，混匀，37℃孵育3～5min；接着，加入60μl试剂r2，置于37℃孵育；孵育20s后，采用全自动生化分析仪，600nm波长下测定
吸光值al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值a2；分别计算标准品的吸光度变化值
△
a＝a2-a1，并绘制校准曲线；校准曲线使用多点非线性拟合，得出吸光度变化值与p1np浓度的线性关系公式。
142.采用实施例5检测方法对实施例3及对比例1、2试剂盒进行样品测定(上市的某厂家p1np检测试剂盒测定结果为对照)，结果如表1-1、表1-2所示。
143.表1-1实施例3及对比例1、2试剂盒样品检测结果
[0144][0145]
表1-2 p1np血清样本检测结果
[0146][0147]
结果显示，根据实施例3、对比例1、对比例2检测结果，计算出20例样品检查结果平均值分别为123.77、128.65、128.97，计算出的相对偏差分别为-3.03％、0.79％、1.04％；根据实施例3、对比例1、对比例2、对照试剂检测结果，靶值为500ng/ml的质控品3次测定结果平均值分别为507.3、503.3、509.0、497.0，计算出的相对偏差分别为1.46％、0.66％、1.80％、-0.60％，表明本发明及对比例1、对比例2试剂盒的测结果与对照结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)，但本发明试剂盒的结果最好。
[0148]
基于上述结果可知，本发明试剂盒制备工艺中的两种微球的使用比例、包被有克隆抗体的胶乳微球制备过程均是关键。
[0149]
实施例6
[0150]
本实施例用以评价本发明基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒的使用效果。
[0151]
一、准确度分析：
[0152]
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
[0153]
检测样本：20例p1np随机血清样本。
[0154]
对照试剂盒：国家食品药品监督管理局已批准上市的某厂家p1np检测试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)(包括试剂r1和r2，但成分与本发明不同，以下简称为对照试剂)。
[0155]
分别使用本发明制备得到的试剂盒(以实施例3试剂盒为例)和对照试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)同时对20例p1np随机血清样本进行测定，重复3遍，计算均值、cv和偏差。偏差范围在
±
10％以内视为无干扰，偏差范围超过
±
10％视为干扰。结果如上述表1-1、1-2所示。
[0156]
结果表明，本发明检测试剂盒检测结果与对照试剂盒结果无明显差异，具有较高准确度(符合度)。
[0157]
二、灵敏度分析：
[0158]
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
[0159]
检测样本：1份纯化水、1份浓度为20ng/ml的p1np抗原低值样本。
[0160]
用本发明制备得到的试剂盒(以实施例3试剂盒为例)和对照试剂盒(某厂家p1np抗原检测试剂盒)用各自的检测方法同时定标同时对每份待测样本重复检测20次，记录吸光度数值，计算平均值和标准偏差(sd)；水的吸光度平均值加上2sd作为最低检出限对应的吸光度值，由于吸光度与浓度的关系基本为线性关系，可以通过和20ng/ml样本的吸光度平均值比较计算出最低检测限的浓度，即灵敏度。灵敏度＝(水吸光度差值平均值+2sd)*样本浓度/样本吸光度差值平均值。检测结果见表2。
[0161]
表2本发明试剂盒与对照试剂盒灵敏度分析结果(单位：ng/ml)
[0162]
[0163][0164]
结果显示，本发明试剂盒检测p1np抗原的灵敏度为2.01ng/ml，对照试剂的灵敏度为2.90ng/ml，表明本发明试剂盒具有较高的灵敏度。
[0165]
三、精密度分析：
[0166]
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
[0167]
检测样本：2份临床血清样本(35.0ng/ml)(低值样本)、(550.0ng/ml)(高值样本)。
[0168]
用本发明制备得到的试剂盒(以实施例3试剂盒为例)和对照试剂盒(某厂家p1np抗原检测试剂盒)对每份待测样本重复检测10次，检测结果见表3。
[0169]
表3本发明试剂盒精密度分析结果(单位：ng/ml)
[0170]
[0171][0172]
结果显示，本发明试剂盒的精密度：cv低值为1.64％、cv高值为0.13％，均小于等于10％；而对照试剂盒cv低值为4.89％、cv高值为0.55％，表明本发明试剂盒比对照试剂盒具有更高的精密度。
[0173]
四、线性分析：
[0174]
试验仪器：日立7180全自动生化分析仪。
[0175]
检测样本：高p1np抗原血清样本(800ng/ml)。
[0176]
将高p1np抗原血清样本(1000ng/ml)用校准品稀释液稀释成5个不同浓度，分别为0ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml；采用本发明制备得到的试剂盒(以实施例3试剂盒为例)对上述样品的每个浓度进行检测，每个浓度检测三次，计算相关系数r值，检测结果见表4。
[0177]
表4试剂盒线性分析结果
[0178]
[0179][0180]
结果显示，本发明制备得到的试剂盒检测结果得到的回归方程为y＝y＝0.9924x+2.4917，相关系数r2＝0.9998，如图1所示，表明本发明试剂盒在1000ng/ml范围内具有良好的线性度。
[0181]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，其特征在于，包括试剂r1和试剂r2；所述试剂r1包括：r1缓冲液20～50mmol/l，表面活性剂5～30ml/l，稳定剂5～20g/l，防腐剂0.05～2g/l，增敏剂10～30g/l；所述试剂r2包括：r2缓冲液20～50mmol/l，表面活性剂5～20ml/l，稳定剂5～30g/l，p1np抗体0.8～1.2ug/ml，100～120nm乳胶微球颗粒1～15ml/l，120～150nm乳胶微球颗粒1～15ml/l，防腐剂0.05～2g/l，活化缓冲液20～50mmol/l，偶联缓冲液20～50mmol/l。2.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，其特征在于，所述r1缓冲液、r2缓冲液、活化缓冲液与偶联缓冲液分别为硼酸缓冲液、硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、good's缓冲液中的一种。3.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为吐温-20，曲拉通x-100，丙三醇中的至少一种。4.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶、小牛血清白蛋白、酪蛋白中的至少一种。5.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、proclin300、异噻唑啉酮中的至少一种。6.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，其特征在于，所述增敏剂为聚乙二醇6000、氟化钠中的至少一种。7.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，其特征在于，所述p1np抗体为鼠抗人p1np单克隆抗体、羊抗人p1np单克隆抗体、兔抗人p1np单克隆抗体中的至少一种，或者是，鼠抗人p1np多克隆抗体、羊抗人p1np多克隆抗体、兔抗人p1np多克隆抗体中的至少一种。8.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒，其特征在于，所述p1np抗体分别与100～120nm乳胶微球颗粒、120～150nm乳胶微球颗粒偶联反应结合，形成包被有p1np抗体的两不同粒径胶乳微球。9.一种如权利要求1～8任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)配制试剂r1：按照试剂r1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；(2)配制试剂r2的稀释缓冲液：按照试剂r2的组分含量，将r2缓冲液、表面活性剂、稳定剂和防腐剂进行混合，获得试剂r2的稀释缓冲液；(3)配制试剂r2：
①
按1:1的比例取粒径为100～120nm的胶乳微与粒径为120～150nm的胶乳微球，加入活化缓冲液后充分混匀，置于恒温摇床中反应30～50min，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
②
加入p1np抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应30～50min，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
③
加入活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应1～2h，温度范围：30～37℃，转速200～
500rpm/min；
④
加入封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应2～3h，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
⑤
加入偶联缓冲液，调整溶液的ph值至7.0～8.0；
⑥
反应完成后，离心用冷冻离心机去除上清液，温度为4℃，转速为20000rpm，离心时间为30～50min；
⑦
去除上清液，并用步骤(2)的稀释缓冲液进行复溶，重悬胶乳微球；重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，超声4～6min，功率210～300w，隔1s超1s，制得试剂r2。10.一种如权利要求1～8任一所述的基于胶乳增强免疫比浊法的p1np测定试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)吸取10μl样本，加入240μl试剂r1，37℃孵育3～5min；(2)再加入60μl试剂r2，置于37℃孵育；(3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于600nm波长下测定吸光值bl；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值b2；(4)按照
△
b＝b2-b1来计算吸光度变化值δb，并根据δb计算出样本中p1np含量。
技术总结本发明提供了一种基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括：R1缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、增敏剂；所述试剂R2包括：R2缓冲液、表面活性剂、稳定剂、P1NP抗体、100～120nm乳胶微球颗粒、120～150nm乳胶微球颗粒、防腐剂、活化缓冲液，偶联缓冲液。本发明还提供了上述测定试剂盒的制备与测定方法。本发明的优点在于：不仅操作简便、检测时间短、测定成本低，同时还具备较高灵敏度、精密度和准确度。精密度和准确度。精密度和准确度。
技术研发人员：芮双印 滕安然
受保护的技术使用者：安徽大千生物工程有限公司
技术研发日：2022.07.26
技术公布日：2022/11/1
