新型显性负性Fas多肽、包含其的细胞及其用途的制作方法

新型显性负性fas多肽、包含其的细胞及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年1月6日提交的美国临时专利申请第62/957,608号的优先权，其全部内容并入本文以供参考，并要求其优先权。
3.序列表
4.本技术包含序列表，该序列表已通过efs-web以ascii格式提交，并全部并入本文以供参考。所述ascii副本创建于2021年1月6日，命名为072734_1188_st.txt，大小为96,169字节。
技术领域
5.本公开提供新型显性负性fas多肽，其包含人fas的细胞质结构域中的第一修饰和n端区域中的第二修饰。本公开还提供包含这种新型显性负性fas多肽和抗原识别受体(例如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr))的细胞。还提供该细胞用于治疗的用途，例如用于治疗肿瘤和病原体感染。


背景技术：

6.用基因工程化自体或同种异体t细胞和nk细胞进行过继性细胞免疫治疗已显示出对一系列人类癌症治疗功效的证据，包括但不限于黑色素瘤和各种b细胞恶性肿瘤。可以通过引入编码受体(例如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr))的基因来修饰t细胞以靶向肿瘤相关抗原，从而传递对癌症或病毒感染细胞表达的抗原的特异性。这种工程化免疫细胞是一种靶向免疫疗法，具有用于治疗癌症或感染性疾病的潜力。
7.使用基因工程t细胞的过继性细胞转移(act)已进入难治性b细胞恶性肿瘤(包括儿童急性淋巴母细胞性白血病(1)和成人侵袭性b细胞淋巴瘤(2))患者的护理标准。无论机构、基因载体或细胞组成如何，act在血液淋巴恶性肿瘤中的卓越疗效在临床试验中一直被观察到(3-8)。相比之下，实体恶性肿瘤患者对过继免疫治疗的反应相对温和(10-13)，实体恶性肿瘤是成人癌症相关死亡的主要原因(9)。因此，仍然需要新的策略来增强转移的t细胞的效力。


技术实现要素：

8.本公开主题提供新型显性负性fas多肽，其包含人fas的细胞质结构域中的第一修饰和n端区域中的第二修饰。本公开主题还提供包含这种新型显性负性fas多肽和抗原识别受体(例如，嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr))的细胞。还提供该细胞用于治疗的用途，例如用于治疗肿瘤和病原体感染。
9.本公开主题提供显性负性fas多肽，其包含人fas的细胞质死亡结构域中的第一修饰和n端区域中的第二修饰。在某些实施方式中，第一和第二修饰各自独立地选自取代、缺失和插入。在某些实施方式中，取代是点突变。
10.在某些实施方式中，第一修饰包含人fas的氨基酸230-314的缺失或由其组成。在
某些实施方式中，第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成。
11.在某些实施方式中，第一修饰包含人fas的第260位的点突变或由其组成。在某些实施方式中，第一修饰由人fas的第260位的点突变组成。在某些实施方式中，点突变为d260v。
12.在某些实施方式中，第二修饰位于人fas的肽信号区和富含半胱氨酸的结构域1之间。在某些实施方式中，肽信号区由人fas的氨基酸1至25编码。在某些实施方式中，富含半胱氨酸的结构域1由人fas的氨基酸48至82编码。
13.在某些实施方式中，第二修饰包含人fas的第32位的修饰或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰包含人fas的氨基酸32的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰由人fas的氨基酸32的缺失组成。
14.在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含与seq id no:16所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含seq id no:16所示氨基酸序列或由其组成。
15.在某些实施方式中，第二修饰还包含第31位的第二修饰。在某些实施方式中，第二修饰包含人fas的氨基酸31和32的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含与seq id no:18所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含seq id no:18所示氨基酸序列或由其组成。
16.在某些实施方式中，第二修饰还包含第33位的第二修饰。在某些实施方式中，第二修饰包含人fas的第32和33位氨基酸的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含与seq id no:20所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含seq id no:20所示氨基酸序列或由其组成。
17.在某些实施方式中，第二修饰包含人fas的第33位的修饰或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰还包含第34位的第二修饰。在某些实施方式中，第二修饰包含人fas的氨基酸33和34的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含与seq id no:22所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含seq id no:22所示氨基酸序列或由其组成。
18.在某些实施方式中，第二修饰包含人fas的第32位的点突变或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰包含人fas的点突变s32a或由其组成。在某些实施方式中，第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含与seq id no:24所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含seq id no:24所示氨基酸序列或由其组成。
19.在某些实施方式中，人fas包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成。
20.在某些实施方式中，第一修饰防止显性负性fas多肽和fadd多肽之间的结合。在某些实施方式中，第二修饰增加(a)细胞的显性负性fas多肽的表面表达，和/或显性负性fas多肽进入细胞的转导效率，和/或(c)使显性负性fas多肽免受fasl诱导的凋亡的保护作用。
21.本公开主题提供细胞，其包含a)与抗原结合的抗原识别受体和b)本文公开的显性负性fas多肽。在某些实施方式中，显性负性fas多肽增强细胞持久性。在某些实施方式中，显性负性fas多肽减少细胞凋亡或无反应力(anergy)。在某些实施方式中，抗原识别受体为外源性或内源性。在某些实施方式中，抗原识别受体从载体中表达。在某些实施方式中，显性负性fas多肽从载体中表达。
22.在某些实施方式中，细胞是免疫应答细胞。在某些实施方式中，细胞是淋巴谱系的细胞或骨髓谱系的细胞。在某些实施方式中，细胞选自t细胞、自然杀伤(nk)细胞、b细胞、单核细胞和巨噬细胞。在某些实施方式中，细胞是t细胞。在某些实施方式中，t细胞是细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞(t
reg
)或自然杀伤t(nkt)细胞。在某些实施方式中，细胞是nk细胞。在某些实施方式中，细胞对预期受体是自体或同种异体的。
23.在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原。在某些实施方式中，抗原是肿瘤特异性抗原。在某些实施方式中，抗原是肿瘤相关抗原。在某些实施方式中，肿瘤抗原选自：cd19、muc16、muc1、caix、cea、cd8、cd7、cd10、cd20、cd22、cd30、cll1、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd74、cd133、cd138、egp-2、egp-40、epcam、erb-b2、erb-b3、erb-b4、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-α、gd2、gd3、her-2、htert、il-13r-α2、κ-轻链、kdr、突变体kras、突变体hras、突变体pik3ca、突变体idh、突变体p53、突变体nras、ley、l1细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、magea3、ct83(也称为kk-lc-1)、p53、mart1、gp100、蛋白酶3(pr1)、酪氨酸酶、生存素、htert、epha2、nkg2d配体、ny-eso-1、癌胚抗原(h5t4)、psca、psma、ror1、tag-72、vegf-r2、wt-1、bcma、cd123、cd44v6、nkcs1、egf1r、egfr-viii、cd99、cd70、adgre2、ccr1、lilrb2、prame、hpv e6癌蛋白、hpv e7癌蛋白和erbb。在某些实施方式中，抗原为cd19。
24.在某些实施方式中，抗原是病原体相关抗原。在某些实施方式中，病原体相关抗原是存在于巨细胞病毒(cmv)中的病毒抗原、存在于epstein-barr病毒(ebv)中的病毒抗原、存在于人免疫缺陷病毒(hiv)中的病毒抗原或存在于流感病毒中的病毒抗原。
25.在某些实施方式中，抗原识别受体是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。在某些实施方式中，抗原识别受体是识别病原体相关抗原的tcr，并且细胞是病原体特异性t细胞。在某些实施方式中，抗原识别受体是识别肿瘤抗原的tcr，并且细胞是肿瘤特异性t细胞。在某些实施方式中，tcr是内源性tcr或重组tcr。
26.在某些实施方式中，抗原识别受体是car。在某些实施方式中，car包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含天然cd3ζ多肽。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含经修饰的cd3ζ多肽。在某些实施方式中，经修饰的cd3ζ多肽包含天然itam1、由两个功能失去突变组成的itam2变体和由两个功能失去突变组成的itam3。在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域还包含至少一个共刺激信号传导区。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包含cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、或其组合。在某些实施方式中，
至少一个共刺激信号传导区包含cd28多肽。
27.在某些实施方式中，细胞还包含自杀基因。在某些实施方式中，自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、诱导型半胱天冬酶9自杀基因(icasp-9)或截断型人表皮生长因子受体(egfrt)多肽。
28.本公开主题还提供核酸组合物，其包含(a)编码与抗原结合的抗原识别受体的第一核酸序列，和(b)编码本文公开的显性负性fas多肽的第二核酸序列。在某些实施方式中，第一和第二核酸序列中的一个或两个可操作地连接到启动子元件。在某些实施方式中，第一和第二核酸序列中的一个或两个存在于载体上。在某些实施方式中，载体是逆转录病毒载体。在某些实施方式中，载体是慢病毒载体。本公开主题还提供包含本文公开的任何核酸组合物的细胞。
29.本公开主题还提供载体，其包含本文公开的任何核酸组合物，以及细胞，其包含本文公开的任何载体的。
30.此外，本公开主题提供药物组合物，其包含有效量的本文公开的任何细胞和药学上可接受的赋形剂。
31.在某些实施方式中，该药物组合物用于治疗和/或预防赘生物或病原体感染。
32.此外，本公开主题提供诱导和/或增强对靶抗原的免疫应答的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的任何细胞或药物组合物。
33.本公开主题提供减少受试者中肿瘤负荷的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的细胞或本文公开的药物组合物。在某些实施方式中，该方法减少肿瘤细胞的数量、减小肿瘤大小和/或根除受试者中的肿瘤。
34.此外，本公开主题提供治疗和/或预防赘生物的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的任何细胞或药物组合物。
35.还提供延长患有赘生物的受试者的生存期的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的细胞或本文公开的药物组合物。在某些实施方式中，赘生物是恶性赘生物。
36.在某些实施方式中，肿瘤或赘生物选自b细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金淋巴瘤、髓系白血病和骨髓增生异常综合征(mds)。在某些实施方式中，肿瘤或赘生物是实体瘤。在某些实施方式中，实体瘤是源自脑、乳腺、肺、胃肠道(包括食道、胃、小肠、大肠和直肠)、胰腺、前列腺、软组织/骨、子宫、宫颈、卵巢、肾脏、皮肤、胸腺、睾丸、头颈或肝脏的肿瘤。
37.此外，本公开主题提供预防和/或治疗受试者中病原体感染的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的任何细胞或药物组合物。在某些实施方式中，病原体选自能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原生动物。
38.本公开主题还提供用于产生抗原特异性细胞的方法。在某些实施方式中，该方法包括将(a)编码与抗原结合的抗原识别受体的第一核酸序列；和(b)编码本文公开的显性负性fas多肽的第二核酸序列引入细胞。在某些实施方式中，第一和第二核酸序列中的一个或两个可操作地连接到启动子元件。在某些实施方式中，第一和第二核酸序列中的一个或两个存在于载体上。在某些实施方式中，载体是逆转录病毒载体。
39.本公开主题还提供包含本文公开的细胞、本文公开的核酸组合物或本文公开的载
体的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒还包含用于治疗和/或预防赘生物或病原体感染的书面说明。
附图说明
40.可以结合附图理解以下通过示例给出的详细描述，但并非旨在将本公开主题限制到所描述的特定实施方式。
41.图1a-1e显示包含嵌合抗原受体(car)和显性负性fas多肽的细胞的产生及它们的活性。图1a显示人fasdnr构建体设计的两个版本。egfrt代表截断型egfr。p2a代表猪捷申病毒(porcine teschovirus)自裂解肽序列。fasdnr代表fas显性负性受体。ψ代表逆转录病毒包装信号。1928ζ1xxcar代表一种抗cd19嵌合抗原受体，其包含一个包含修饰的cd3ζ的细胞内结构域和一个包含cd28多肽的共刺激信号传导区。图1b是编辑后的t细胞的示意图。1928ζ1xxcar靶向cd19
+
恶性细胞。fasdnr保护t细胞免受fasl诱导的凋亡。当与西妥昔单抗施用时，egfrt可以被靶向并诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性。图1c显示，人源性jurkat细胞仅用egfrt或egfrt/fasdnr经逆转录病毒转导。在转导后第2天对细胞进行染色。图1d显示用靶向ny-eso抗原的tcr转导的原代人cd8
+
t细胞上tnfα的细胞内染色。在细胞内细胞因子染色之前，将具有或不具有fasdnr的细胞暴露于抗原6小时。图1e显示在指定时间点暴露于100ng/ml fasl亮氨酸拉链(fasl-lz)的原代人cd8
+
t细胞。活化的半胱天冬酶3/7和膜联蛋白v被用作早期凋亡标志物。
42.图2a-2c描绘从crispr编辑的jurkat细胞中选择的单个克隆的fas表达。图2a显示用载有靶向第2外显子中人fas基因的合成向导(sg)rna的重组cas9蛋白电穿孔的jurkat细胞。在电穿孔后单细胞克隆约3周后，在编辑后的t细胞上测量fas表面表达。wt代表fas的野生型基因序列。图2b显示表现为fas表达水平的mfi比较的数据，p值通过比较克隆#15和克隆#17的配对student t检验确定(***p《0.001)。图2c显示每个jurkat克隆的fas基因序列概要。下划线表示向导rna靶序列。粗体序列表示缺失。图2c按外观顺序分别公开了seq id no:69-74。
43.图3a和3b描绘克隆17jurkat细胞对fasl刺激的应答。图3a显示crispr编辑后单克隆jurkat细胞的凋亡测定。在指定时间点用100ng/ml fasl-lz处理细胞。克隆#15，野生型fas第2外显子序列。克隆#17，单等位基因6bp(2个密码子)框内缺失。克隆#19，双等位基因19bp(移码)缺失。图3b显示相同凋亡测定的一式三份数据。垂直条表示克隆#15和#17在每个时间点的比较，p值由每个匹配样品的配对student t检验确定(***p《0.001，****p《0.0001)。
44.图4a和4b描绘使fas敲除克隆19和fasdnr+jurkat细胞免受fasl诱导的凋亡的保护作用。图4a显示在指定时间点暴露于100ng/ml fasl-lz的jurkat细胞。克隆#15wt，野生型fas第2外显子序列。克隆#19indel-19，具有通过ice测序软件计算的19bp缺失的fas第2外显子。egfrt
+
和egfrt
+
fasdnr
+
分别代表在egfrt阳性(对照组)或egfrt和fasdnr双阳性细胞上门控的jurkat细胞。图4b显示由上述早期凋亡标志物代表的同一凋亡测定的一式三份的数据。
45.图5显示人fas n端区域中表达增强突变体的预测。fas蛋白(335个氨基酸)功能区的总结图。plad，前配体组装结构域。crd，富含半胱氨酸的结构域。tm，跨膜结构域。dd，死亡
结构域。dnr del222-306表示fasdnr截断区域。s32(氨基酸32处的丝氨酸)是导致克隆#17表型的预测突变位点。del 32，缺失s32。del31-32，缺失n31和s32。del32-33，缺失s32和k33。s32a，氨基酸32从s到a的取代。
46.图6a和6b描绘fas n端突变体的增强的fas转导效率。用具有s32突变的fas或fasdnr逆转录病毒载体转导克隆19敲除fas的jurkat细胞。在病毒转导后第3天对细胞进行fas表达染色。实心灰色为用fas wt(图6a)或fasdnr(图6b)转导的对照组细胞。空白点为用fas s32突变体转导的细胞。
47.图7a和7b描绘jurkat细胞凋亡测定的结果。使用通过亮氨酸拉链结构域(lz-fasl)寡聚的重组fas配体(cd178)诱导细胞凋亡，以模拟配体的天然发生活性形式。已知fasl通过与应答细胞上的fas受体结合来触发细胞凋亡。细胞用具有或不具有s32突变的fasdnr转导，并与重组fas配体孵育。图7a显示在不同时间点对活性半胱天冬酶3和半胱天冬酶7(x轴)和膜联蛋白v染色(膜联蛋白v与经受凋亡的细胞的质膜结合；y轴)的流式细胞术(facs)分析。半胱天冬酶3和半胱天冬酶7是参与fas信号传导的下游信号传导分子。凋亡启动需要激活半胱天冬酶3和7。图7b显示时间段内凋亡测量的定量分析。
48.图8描绘在被人il-2和辐射的k562克隆9细胞激活后，fas在人自然杀伤细胞(nk细胞)中的表达。
49.图9描绘用egfrt/1928z、egfrt/1928z/fasdnr或egfrt/1928z/fasdnr del31-32转导的人nk细胞中fas的表达。
50.图10描绘与暴露于fas配体后fas dnr修饰和未修饰的nk细胞相比，在nk细胞中表达n端突变体fas dnr导致细胞数量显著增加。
具体实施方式
51.本公开主题提供新型显性负性fas多肽和包含这些多肽的细胞。在某些实施方式中，该细胞还包含抗原识别受体(例如tcr或car)。本公开主题还提供使用这种细胞治疗和/或预防赘生物和病原体感染的方法。本公开主题至少部分基于以下发现：显性负性fas多肽的n端区域中的修饰增加了细胞对显性负性fas多肽的表面表达，和/或增加了显性负性fas多肽进入细胞的转导效率，和/或增加使显性负性fas多肽免受fasl诱导的凋亡的保护作用。
52.1、定义
53.除非在本文中定义，否则本详细描述中使用的所有技术和科学术语具有免疫肿瘤学领域技术人员通常理解的含义，例如，在以下一个或多个中包括的本公开主题中使用的许多术语的一般定义所反映出来的：singleton等人,dictionary of microbiology and molecular biology(第2版,1994)；the cambridge dictionary of science and technology(walker著,1988)；the glossary of genetics,第5版,r.rieger等人(著),springer verlag(1991)；和hale&marham,the harper collins dictionary of biology(1991)。
54.如本文所用，术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，其将部分取决于该值是如何测量或确定的，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或3个以上的标准差内。或者，“约”可以指给定值的至
多20％的范围，例如，至多10％、至多5％或至多1％。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在一个数量级内，例如在一个值的5倍或2倍内。
[0055]“免疫应答细胞”是指在免疫应答或其祖细胞或子代中发挥功能的细胞，包括启动、激活和/或调节(增加或减少)免疫应答的细胞。
[0056]“激活免疫应答细胞”是指在细胞中诱导信号转导或蛋白质表达的变化，从而引发免疫应答。例如，当cd3链聚集以响应配体结合和免疫受体酪氨酸基抑制基序(itam)时，产生信号转导级联。在某些实施方式中，tcr或car与抗原的结合导致免疫突触的形成，其包括靠近结合受体(例如cd4或cd8、cd3γ/δ/ε/ζ)的许多分子的聚集。这种膜结合信号传导分子的聚集允许包含cd3链内的itam基序磷酸化。这种磷酸化反过来启动t细胞激活通路，最终激活转录因子，如nf-κb和ap-1。这些转录因子诱导t细胞的整体基因表达，以增加il-2的产生，促进增殖和主调节t细胞蛋白的表达，从而启动t细胞介导的免疫应答。
[0057]“刺激免疫应答细胞”是指产生强大和持续免疫应答的信号。在各种实施方式中，这在免疫细胞(例如t细胞)激活后发生，或同时通过受体介导，该受体包括但不限于cd28、cd137(4-lbb)、ox40、cd40和icos。接收多个刺激信号对于启动强大和长期的t细胞介导的免疫应答非常重要，但接收多个刺激信号的t细胞可很快受到抑制并对抗原无应答，这种状态通常被称为“耗尽”。虽然这些共刺激信号的作用可能不同，但它们通常会导致基因表达增加，以产生长寿命、增殖和抗凋亡的t细胞，这些细胞对抗原强烈应答，从而实现彻底和持续的清除。
[0058]
本文使用的术语“抗原识别受体”是指能够激活免疫应答细胞(例如，t细胞)以响应其与抗原的结合的受体。抗原识别受体的非限制性实例包括天然或内源性t细胞受体(“tcr”)和嵌合抗原受体(“car”)。
[0059]
如本文所用，术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，而且还指保留抗原结合能力的抗体分子片段。这种片段在本领域中也是众所周知的，并且经常在体外和体内使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅指完整的免疫球蛋白分子，而且还指众所周知的活性片段f(ab’)2和fab。f(ab’)2和缺乏完整抗体的fe片段的fab片段，从循环中清除得更快，并且可能比完整抗体具有更少的非特异性组织结合(wahl等人,j.nucl.med.24:316-325(1983)。如本文所用，术语“抗体”包括全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；fab，fab’，单链v区片段(scfv)和融合多肽。
[0060]
如本文所用，术语“互补决定区”或“cdr”是指免疫球蛋白重链和轻链氨基酸序列的高变区。例如，见kabat等人，《免疫学相关蛋白质序列》，美国国家卫生研究院第四卫生与公共服务部(1987年)。通常，抗体包含可变区中的三个重链和三个轻链cdr或cdr区。cdr为抗体与其同源抗原或表位的结合提供了大部分接触残基。在某些实施方式中，使用kabat系统对cdr区进行编号(kabat，e.a.等人(1991)《免疫学相关蛋白质序列》，第五版，美国卫生与公共服务部，nih出版物第91-3242号)。
[0061]
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scfv”是共价连接形成vh::v
l
异二聚体的免疫球蛋白重链(vh)和轻链(v
l
)可变区的融合蛋白。vh和v
l
直接连接或通过肽编码接头(例如10、15、20、25个氨基酸)连接，该接头将vh的n端与v
l
的c端连接，或将vh的c端与v
l
的n端连接。接头通常富含i-甘氨酸以获得柔韧性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度。尽管去除了恒定区并引入了接头，但scfv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。如huston等人所述，
单链fv多肽抗体可以从包括vh和v
l
编码序列的核酸中表达。(proc.nat.acad.sci.usa,85:5879-5883,1988)。另见美国专利第5,091,513号、第5,132,405号和第4,956,778号；美国专利公开第20050196754号和第20050196754号。已经描述了具有抑制活性的拮抗scfv(参见，例如，zhao等人,hyrbidoma(larchmt)2008 27(6):455-51；peter等人,j cachexia sarcopenia muscle 2012august 12；shieh等人,j imunol2009 183(4):2277-85；giomarelli等人,thromb haemost 2007 97(6):955-63；fife等人,j clin invst 2006 116(8):2252-61；brocks等人,immunotechnology 1997 3(3):173-84；moosmayer等人,the immunol 1995 2(10:31-40)。具有刺激活性的激动性scfv已被描述(参见，例如peter等人,j biol chem 2003 25278(38):36740-7；xie等人,nat biotech 1997 15(8):768-71；ledbetter等人,crit rev immunol1997 17(5-6):427-55；ho等人,biochim biophys acta 2003 1638(3):257-66)。
[0062]
如本文所用，术语“亲和力”是指结合强度的度量。亲和力可以取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间立体化学拟合的紧密度、它们之间接触面积的大小和/或带电和疏水基团的分布。本领域已知用于计算抗体对抗原的亲和力的方法，包括但不限于各种抗原结合实验，例如功能测定法(例如流式细胞术测定法)。
[0063]
本文使用的术语“嵌合抗原受体”或“car”是指分子(例如，合成受体)，其包含融合到能够激活或刺激免疫应答细胞的细胞内信号传导结构域的细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，car还包含跨膜结构域。在某些实施方式中，car的细胞外抗原结合结构域包含scfv。scfv可以通过融合抗体的可变重区和轻区获得。在某些实施方式中，scfv可来自fab’(而不是来自抗体，例如从fab库获得)。在某些实施方式中，scfv融合到跨膜结构域，然后融合到细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，car被选择为对抗原具有高结合亲和力或亲合力。
[0064]
如本文所用，术语“核酸分子”包括编码目的多肽(例如显性负性fas多肽或抗原识别受体)或其片段的任何核酸分子。这种核酸分子不需要与内源性核酸序列具有100％同源性或同一性，但可表现出基本同一性。与内源序列具有“基本同一性”或“基本同源性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。
[0065]
如本文所用，术语“保守序列修饰”是指在蛋白质中具有特定物理化学特性的氨基酸被具有相同物理化学特性的另一氨基酸所取代(例如，用一种碱性氨基酸取代另一种碱性氨基酸)的氨基酸修饰。在某些实施方式中，这种取代不太可能对蛋白质的活性产生显著影响(例如，抗体cdr中的保守取代不太可能显著影响或改变蛋白质的结合特性)。可以通过本领域已知的标准技术，例如定点突变和pcr介导的突变，将修饰引入到本公开的car的人scfv中。氨基酸可以根据其理化性质(如电荷和极性)进行分类。在某些实施方式中，保守修饰是保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是指将氨基酸残基取代为同一组内的氨基酸。例如，氨基酸可以按电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，带中性电荷的氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。此外，氨基酸可按极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋
氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。在某些实施方式中，保守取代包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。在某些实施方式中，cdr区内或外部的一个或多个氨基酸残基可以用来自同一组的其他氨基酸残基取代，并且可以使用本文所述的功能分析测试改变后的抗体的保留功能(即，上述(c)至(l)中所述的功能)。在某些实施方式中，在cdr区或cdr区之外的指定序列中，改变的残基不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个。
[0066]
在某些实施方式中，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数的函数(即％同源性＝相同位置数#/位置总数#
×
100)，考虑到空位的数量和每个空位的长度，这需要引入以实现两个序列的最佳联配。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。
[0067]
两个氨基酸序列之间的同源性或同一性百分比可以使用e.meyers和w.miller(comput.appl.biosci.,4:11-17(1988))的算法确定，该算法已被纳入align程序(版本2.0)，使用pam120重量残基表，空位长度罚值为12，空位罚值为4。此外，可以使用needleman和wunsch(j.mol.biol.48:444-453(1970))算法确定两个氨基酸序列之间的同源性百分比，该算法已被纳入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
[0068]
在某些实施方式中，本公开主题的氨基酸序列可进一步用作“查询序列”，以对公共数据库执行搜索，以例如识别相关序列。可以使用altschul等人,(1990)j.mol.biol.215:403-10的xblast程序(2.0版)执行这种搜索。可以使用xblast程序进行blast蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本文中指定序列同源的氨基酸序列。为了获得空位联配以进行比较，可以使用gapped blast，如altschul等人,(1997)nucleic acids res.25(17):3389-3402所述。当使用blast和gapped blast程序时，可以使用各个程序(例如xblast和nblast)的默认参数。
[0069]
此外，可以使用序列分析软件(例如，sequence analysis software package of the genetics computer group，威斯康星大学生物技术中心，麦迪逊大学大道1710号，威斯康星州53705，blast，bestfit，gap，或pileup/prettybox程序)测量序列同一性。这种软件通过为各种取代、缺失和/或其他修改赋予同源度来匹配相同或类似的序列。
[0070]“基本同一性”或“基本同源性”是指与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任何一个氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述的任何一个核酸序列)表现出具有至少约50％同源性或同一性的多肽或核酸分子。在某些实施方式中，这种序列与用于比较的氨基酸或核酸序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性。
[0071]
在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，概率分数在e-3和e-100之间，表示密切相关的序列。
[0072]“类似物”是指具有参考多肽或核酸分子功能的结构相关多肽或核酸分子。
[0073]
本文使用的术语“配体”是指与受体结合的分子。在某些实施方式中，配体与另一细胞上的受体结合，允许细胞间识别和/或相互作用。
[0074]
本文使用的术语“组成型表达”或“组成性表达”是指在所有生理条件下的表达或表达。
[0075]“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官正常功能的任何状况、疾病或病症，例如赘生物和细胞的病原体感染。
[0076]“有效量”(或“治疗有效量”)是指足以产生治疗后有益或预期临床结果的量。可以一次或多剂剂量向受试者施用有效量。就治疗而言，有效量是指足以缓解、改善、稳定、逆转或减缓疾病进展，或以其他方式减少疾病病理后果的量。有效量通常由医生根据具体情况确定，并且在本领域人员的技术范围内。在确定达到有效量的适当剂量时，通常会考虑若干因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、正在治疗的疾病、疾病的严重程度以及所施用免疫应答细胞的形式和有效浓度。
[0077]“增强耐受性”意味着阻止靶向移植器官或组织的自反应细胞或免疫应答细胞的活性。
[0078]“内源性”是指通常在细胞或组织中表达的核酸分子或多肽。
[0079]“外源性”是指细胞内非内源性存在的核酸分子或多肽。因此，术语“外源性”将包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外源性、异源性和过表达的核酸分子和多肽。“外源性”核酸是指天然野生型细胞中不存在的核酸；例如，外源核酸可因序列、位置/定位或两者均有而与内源性对应物不同。为清楚起见，外源核酸相对于其天然内源性对应物可具有相同或不同的序列；它可以通过基因工程引入细胞本身或其祖细胞，并且可任选地与可替代的控制序列连接，例如非天然启动子或分泌序列。
[0080]“异源核酸分子或多肽”是指通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中的核酸分子(例如，cdna、dna或rna分子)或多肽。这种核酸可来自另一生物体，或者也可以是例如在细胞或样品中通常不表达的mrna分子。
[0081]“调节”是指正或负的改变。示例性调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％、或约100％的改变。
[0082]“增加”是指正改变至少约5％。改变可以是约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％或约100％或更多。
[0083]“减少”是指负改变至少约5％。改变可以是约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％或甚至约100％。
[0084]“分离细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞成分分离的细胞。
[0085]
术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指物质在不同程度上不含通常在其天然状态下伴随其存在的成分。“分离”表示与原始来源或环境的分离程度。“纯化”表示比分离更高的分离程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质充分不含其他物质，因此任何杂质都不会对蛋白质的生物学特性产生重大影响或造成其他不利后果。也就是说，如果核酸或肽在通过重组dna技术生产时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基，或在化学合成时不含化学前体或其他化学品，则它就是纯化的。纯度和均一性通常使用分析化学技术确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可以进行修饰(例如，磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可产生不同的分离蛋白质，其可分别纯化。
[0086]
本文使用的术语“抗原结合结构域”是指能够特异性结合细胞上存在的特定抗原
决定簇或一组抗原决定簇的结构域。
[0087]
本文中使用的“接头”是指共价连接两个或多个多肽或核酸以使其相互连接的官能团(例如，化学物或多肽)。如本文所用，“肽接头”是指用于将两个蛋白质偶联在一起(例如，偶联vh和v
l
结构域)的一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，接头包括ggggsggggsggggs[seq id no：1]所示序列。
[0088]“赘生物”是指以细胞或组织的病理性增殖及其随后向其他组织或器官迁移或侵袭为特征的疾病。赘生物生长通常是不受控制和进行性的，并且在不会诱发或会导致正常细胞停止增殖的条件下发生。赘生物可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自以下的器官：膀胱、骨、脑、乳腺、软骨、神经胶质、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠道、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道，或其组织或细胞类型。赘生物包括癌症，如肉瘤、癌或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。
[0089]“受体”是指存在于选择性结合一个或多个配体的细胞膜上的多肽或其部分。
[0090]“识别”是指选择性地结合到目标。识别肿瘤的t细胞可以表达与肿瘤抗原结合的受体(例如tcr或car)。
[0091]“参考”或“对照”是指比较标准。例如，表达car和scfv的细胞的scfv抗原结合水平可与仅表达car的相应细胞中的scfv抗原结合水平进行比较。
[0092]“分泌的”是指通过经内质网、高尔基体并作为囊泡在细胞质膜上短暂融合，从而将蛋白质释放到细胞外的分泌途径从细胞中释放的多肽。
[0093]“信号序列”或“前导序列”是指存在于新合成蛋白质的n-端的引导它们进入分泌途径的肽序列(例如，5、10、15、20、25或30个氨基酸)。示例性前导序列包括但不限于il-2信号序列：myrmollscialslalvtns[seq id no：2](人)，mysmqlascvtltlvllvns[seq id no：3](小鼠)；kappa前导序列：metpaqllfllllwlpdttg[seq id no：4](人)，metdtlllwvlllwvpgstg[seq id no：5](小鼠)；cd8前导序列：malpvtalllplalllhaarp[seq id no：6](人)；截短的人cd8信号肽：malpvtalllplalllha[seq id no：7](人)；白蛋白信号序列：mkwvtfisllfssays[seq id no：8](人)；催乳素信号序列：mdskgssqkgsrlllllvvsnlllcqgvvs[seq id no：9](人)。“可溶性”是指可在水环境中自由扩散的多肽(例如，不与膜结合)。
[0094]“特异性结合”是指识别并结合到目的生物分子(例如，多肽)的多肽或其片段，但其基本上不识别和结合样品中的其他分子，例如，天然包括本公开的多肽的生物样品。
[0095]
本文中使用的术语“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中产生的抗原物质。肿瘤抗原可以触发宿主的免疫应答。如本文所用，术语“肿瘤抗原”包括肿瘤特异性抗原(tsa)和肿瘤相关抗原(taa)。tsa是指与正常细胞相比，在肿瘤细胞上唯一或差异表达的抗原，例如，仅存在于肿瘤细胞上而不存在于正常细胞上。在某些实施方式中，肿瘤抗原包括由肿瘤表达的任何多肽，其能够通过抗原识别受体(例如cd19、muc-16)激活或诱导免疫应答，或能够通过受体-配体结合(例如cd47、pd-l1/l2、b7.1/2)抑制免疫应答。taa是存在于一些肿瘤细胞和一些正常细胞上的抗原。
[0096]
术语“包括”、“包含”具有美国专利法赋予它们的广义含义，可以指“包括”、“包含”等。
[0097]
如本文所用，“治疗”是指试图改变被治疗个体或细胞的病程的临床干预，可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的疗效包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以防止受影响或被诊断的受试者或怀疑患有该疾病的受试者因疾病而恶化，但治疗也可以防止该疾病的风险受试者或怀疑患有该疾病的受试者出现该疾病或该疾病的症状。
[0098]
本文中的“个体”或“受试者”是脊椎动物，例如人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、灵长类、家畜、运动动物、啮齿动物和宠物。非人动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；以及非人灵长类动物，如猿和猴子。本文使用的术语“免疫受损”是指患有免疫缺陷的受试者。受试者极易受到机会性感染，即由通常不会导致免疫系统健康的人患病，但可影响免疫系统功能不良或受抑制的人的生物体引起的感染。
[0099]
本公开主题的其他方面在以下公开中描述，并且在本公开主题的范围内。
[0100]
2、显性负性fas多肽
[0101]
fas细胞表面死亡受体(fas)也称为apt1；cd95；fas1；apo-1；fastm；alps1a；tnfrsf6。genbank id:355(人)、14102(小鼠)、246097(大鼠)、282488(牛)、486469(狗)。fas的蛋白质产物包括但不限于ncbi参考序列np_000034.1、np_001307548.1、np_690610.1和np_690611.1。
[0102]
fas是tnf受体超家族的成员，包含一个死亡结构域。在人fas中，死亡结构域由氨基酸226-319编码。fas参与细胞程序性死亡的调控，并参与各种恶性肿瘤和免疫系统疾病的发病机制。fas与其配体的相互作用允许与其他成分例如具有死亡结构域的fas相关蛋白(fadd)形成细胞死亡诱导信号传导复合体，其可诱导程序性细胞死亡，也称为凋亡。
[0103]
在某些实施方式中，术语“显性负性fas多肽”是指fas多肽的显性负性形式，其是fas基因的显性负性突变的基因产物。在某些实施方式中，包含显性负性突变(也称为“反效等位基因突变”)的fas多肽是对野生型fas多肽起拮抗作用的改变后的基因产物。在某些实施方式中，显性负性fas多肽对同一细胞内的正常野生型fas多肽产生不利影响。在某些实施方式中，显性负性fas多肽与野生型fas多肽相互作用，但阻止其向下游分子(例如fadd)的信号转导。
[0104]
在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含人fas的细胞内结构域中的第一修饰和n端区域中的第二修饰。在某些实施方式中，第一修饰在细胞质死亡结构域内。在某些实施方式中，第一修饰阻止fas与fadd多肽的结合。在某些实施方式中，第二修饰位于fas(例如，人fas)的肽信号区和富含半胱氨酸的结构域1之间。在某些实施方式中，人fas的肽信号区由人fas的氨基酸1至25编码。在某些实施方式中，人fas的富含半胱氨酸的结构域1由人fas的氨基酸48至82编码。
[0105]
在fas的肽信号区和富含半胱氨酸的结构域1之间的区域(例如，人fas)没有已知的功能描述。使用crispr/cas9筛选，本技术的发明人发现该区域的修饰(例如丝氨酸32的截断)增强fas细胞表面的表达。该功能独立于第一修饰，可以与显性负性fas多肽结合，进一步改善其表面表达和显性负性功能。
[0106]
在某些实施方式中，人fas包含ncbi参考号np_000034.1(seq id no:10)的氨基酸
序列或由其组成，如下所示。在某些实施方式中，人fas多肽包含与seq id no:10所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，或由其组成。
[0107][0108]
编码seq id no:10的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:11中。
[0109][0110]
2.1.第一修饰
[0111]
在某些实施方式中，第一修饰在fas的细胞质死亡结构域内。在某些实施方式中，第一修饰在人fas(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的人fas)的氨基酸约200至约320内。在某些实施方式中，第一修饰在人fas(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的人fas)的氨基酸约200至约319内。在某些实施方式中，第一修饰在人fas(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的人fas)的氨基酸约202至约319内。在某些实施方式中，第一修饰在人fas(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的人fas)的氨基酸约226至约319内。fas蛋白的死亡结构域在tartaglia la等人.cell.(1993)；74(5):845-53；itoh和nagata.j biol chem.(1993)；268(15):10932；boldin mp等人j biol chem.(1995)；270(14):7795-8；和huang b等人nature(1996)；384(6610):638-41中公开，其均并入本文以供参考。
[0112]
在某些实施方式中，第一修饰选自取代、缺失和插入。在某些实施方式中，取代是点突变。
[0113]
在某些实施方式中，第一修饰是缺失。在某些实施方式中，第一修饰包含死亡结构域的部分或完全缺失。在某些实施方式中，第一修饰包含人野生型fas多肽(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的fas多肽)的氨基酸残基230-314的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第一修饰由人野生型fas多肽(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的fas多肽)的氨基酸残基230-314的缺失组成。在某些实施方式中，显性负性多肽由第一修饰组成，该第一修饰由人野生型fas的氨基酸残基230-314的缺失组成，该野生型fas由seq id no:10所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，该显性负性多
肽被指定为“hfas
δdd”。在某些实施方式中，hfas
δdd
包含seq id no:12所示氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:12。
[0114][0115]
编码seq id no:12的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:13中。
[0116][0117]
在某些实施方式中，第一修饰由点突变组成。在某些实施方式中，第一修饰包含人fas多肽(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的人fas多肽)的第260位的点突变或由其组成。在某些实施方式中，点突变由d260v组成。在某些实施方式中，第一修饰由人野生型fas多肽的点突变d260v组成。在某些实施方式中，显性负性多肽由第一修饰组成，该第一修饰由人野生型fas多肽的点突变d260v组成，该人野生型fas多肽由seq id no:10所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，该显性负性多肽被指定为“hfas
d260v”。在某些实施方式中，hfas
d260v
包含seq id no:14所示氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:14。
[0118][0119]
编码seq id no:14的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:15中。
[0120][0121]
第二修饰
[0122]
第二修饰位于人fas多肽的n端区域。
[0123]
在某些实施方式中，第二修饰位于fas(例如，人fas)的肽信号区和富含半胱氨酸的结构域1之间。在某些实施方式中，人fas的肽信号区由人fas的氨基酸1至25编码。在某些实施方式中，人fas的肽信号区由seq id no:10的氨基酸1至25编码。在某些实施方式中，人fas的富含半胱氨酸的结构域1由人fas的氨基酸48至82编码。在某些实施方式中，人fas的富含半胱氨酸的结构域1由seq id no:10的氨基酸48至82编码。在某些实施方式中，第二修饰在人fas的氨基酸26至47内。在某些实施方式中，第二修饰在seq id no:10的氨基酸26至47内。
[0124]
在某些实施方式中，第二修饰选自取代、缺失和插入。在某些实施方式中，取代是点突变。在某些实施方式中，第二修饰在seq id no:10的氨基酸26至36内。在某些实施方式中，第二修饰在seq id no:10的氨基酸26至35内。在某些实施方式中，第二修饰包含seq id no:10的氨基酸26至36内的一个或两个点突变或单个氨基酸的缺失。在某些实施方式中，第二修饰包含seq id no:10的氨基酸26至35内的一个或两个点突变或单个氨基酸的缺失。在某些实施方式中，第二修饰增加细胞的显性负性fas多肽的表面表达，和/或增加显性负性fas多肽进入细胞的转导效率。在某些实施方式中，第二修饰增加了使显性负性fas多肽免受fasl诱导的凋亡的保护作用。在某些实施方式中，显性负性fas多肽所赋予的保护作用通过表达显性负性fas多肽的细胞在fasl刺激后的存活率来测量。
[0125]
在某些实施方式中，第二修饰包含人显性负性fas多肽(例如，一个包含seq id no:12或seq id no:14所示氨基酸序列或由其组成的fas多肽)的第32位的修饰或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰包含人显性负性fas多肽(例如，一个包含seq id no:12或seq id no:14所示氨基酸序列或由其组成的fas多肽)的第33位的修饰或由其组成。
[0126]
在某些实施方式中，第二修饰包含缺失或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰包含至多一个、至多两个、至多三个、至多四个或至多五个氨基酸的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰包含一个氨基酸的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰包含第32位氨基酸的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰包含第33位氨基酸的缺失或由其组成。
[0127]
在某些实施方式中，第二修饰由第32位氨基酸的缺失组成。在某些实施方式中，该缺失由人显性负性fas多肽(例如，包含seq id no:12或seq id no:14所示氨基酸序列或由其组成的人显性负性fas多肽)的氨基酸32的缺失组成。
[0128]
在某些实施方式中，第一修饰由人fas的点突变d260v组成，第二修饰由人fas的氨基酸32的缺失组成。
[0129]
在某些实施方式中，第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成，第二修饰由人fas的氨基酸32的缺失组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含：人野生型fas多肽的由第32位氨基酸的缺失组成的第一修饰和由氨基酸230-314的缺失组成的第二修饰，或由其组成，该人野生型fas多肽由seq id no:10所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽被指定为“fas del s32 dnr”。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含下文提供的seq id no:16所示氨基酸序列或由其组成。
[0130]
[0131]
编码seq id no:16的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:17中。
[0132][0133]
在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含与seq id no:16所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，包含与seq id no:16所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成的显性负性fas多肽包含人野生型fas多肽(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的人野生型fas多肽)的由氨基酸230-314的缺失组成的第一修饰和由氨基酸32的缺失组成的第二修饰，或由其组成。
[0134]
在某些实施方式中，第二修饰包含两个氨基酸的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰包含第32位氨基酸的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰包含第31和32位两个氨基酸的缺失或由其组成。
[0135]
在某些实施方式中，第二修饰由第31和32位氨基酸的缺失组成。在某些实施方式中，该缺失是人显性负性fas多肽(例如，包含seq id no:12或seq id no:14所示氨基酸序列或由其组成的人显性负性fas多肽)的氨基酸31和32的缺失。
[0136]
在某些实施方式中，第一修饰由人fas中的点突变d260v组成，第二修饰由人fas的氨基酸31和32的缺失组成。
[0137]
在某些实施方式中，第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成，第二修饰由人fas的氨基酸31和32的缺失组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含人野生型fas多肽的由氨基酸230-314的缺失组成的第一修饰和由氨基酸31和32的缺失组成的第二修饰，或由其组成，该人野生型fas多肽由seq id no:10所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，该显性负性fas多肽被指定为“fas del n31s32dnr”、“fasdnr del31-32”或“fas del31-32 dnr”。在某些实施方式中，该显性负性fas多肽包含下文提供的seq id no:18所示氨基酸序列或由其组成。
[0138][0139]
编码seq id no:18的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:19中。
[0140][0141]
在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含与seq id no:18所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，包含与seq id no:18所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成的显性负性fas多肽包含人fas多肽(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的人fas多肽)的由氨基酸230-314的缺失组成的第一修饰和由氨基酸31和32的缺失组成的第二修饰，或由其组成。
[0142]
在某些实施方式中，第二修饰包含第32和33位氨基酸的缺失或由其组成。在某些实施方式中，该缺失是人显性负性fas多肽(例如，包含seq id no:12或seq id no:14所示氨基酸序列或由其组成的人显性负性fas多肽)的氨基酸32和33的缺失。
[0143]
在某些实施方式中，第一修饰由人fas的点突变d260v组成，第二修饰由人fas的氨基酸32和33的缺失组成。
[0144]
在某些实施方式中，第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成，第二修饰由人fas的氨基酸32和33的缺失组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含人野生型fas多肽的由氨基酸230-314的缺失组成的第一修饰和由氨基酸32和33的缺失组成的第二修饰，或由其组成，该人野生型fas多肽由seq id no:10所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽被指定为“fas del s32k33dnr”。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含下文提供的seq id no:20所示氨基酸序列或由其组成。
[0145][0146]
编码seq id no:20的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:21中。
[0147][0148]
在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含与seq id no:20所示氨基酸序列具有
至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，包含与seq id no:20所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成的显性负性fas多肽包含人fas多肽(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的人fas多肽)的由氨基酸230-314的缺失组成的第一修饰和由氨基酸32和33的缺失组成的第二修饰，或由其组成。
[0149]
在某些实施方式中，第二修饰包含第33位氨基酸的缺失或由其组成。在某些实施方式中，第二修饰包含第33和34位氨基酸的缺失或由其组成。在某些实施方式中，该缺失包含人显性负性fas多肽(例如，包含seq id no:12或seq id no:14所示氨基酸序列或由其组成的人显性负性fas多肽)的氨基酸33和34的缺失或由其组成。
[0150]
在某些实施方式中，第一修饰由人fas的点突变d260v组成，第二修饰由人fas的氨基酸33和34的缺失组成。
[0151]
在某些实施方式中，第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成，第二修饰由人fas的氨基酸33和34的缺失组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含人野生型fas多肽的由氨基酸230-314的缺失组成的第一修饰和由氨基酸33和34的缺失组成的第二修饰，或由其组成，该野生型fas多肽由seq id no:10所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽被指定为“fas del k33g34dnr”。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含下文提供的seq id no:22所示氨基酸序列或由其组成。
[0152][0153]
编码seq id no:22的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:23中。
[0154][0155]
在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含与seq id no:22所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，包含与seq id no:22所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成的显性负性fas多肽包含人fas多肽(例如，一个包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的人fas多肽)的由氨基酸230-314的缺失组成的第一修饰和由氨基酸33和34的缺失组成的第二修饰，或由其组成。
[0156]
在某些实施方式中，第二修饰由点突变组成。在某些实施方式中，点突变位于人显性负性fas多肽(例如，包含seq id no:12或seq id no:14所示氨基酸序列或由其组成的人显性负性fas多肽)的第32位。在某些实施方式中，点突变为s32a。
[0157]
在某些实施方式中，第一修饰由人fas的点突变d260v组成，第二修饰由人fas的点突变s32a组成。
[0158]
在某些实施方式中，第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成，第二修饰由人fas的点突变s32a组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含人野生型fas多肽的由氨基酸230-314的缺失组成的第一修饰和由点突变s32a组成的第二修饰，或由其组成，该人野生型fas多肽由seq id no:10所示氨基酸序列组成。在某些实施方式中，显性负性fas多肽被指定为“fas s32a dnr”。在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含seq id no:24所示氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:24。
[0159][0160]
编码seq id no:24的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:25中。
[0161][0162]
在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含与seq id no:24所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，包含与seq id no:24所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成的显性负性fas多肽包含人fas多肽(例如，包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成的人fas多肽)的由氨基酸230-314的缺失组成的第一修饰和由人fas多肽的点突变s32a组成的第二修饰，或由其组成。
[0163]
在某些实施方式中，显性负性fas多肽包含异源信号肽，例如il-2信号肽、kappa前导序列、cd8前导序列或具有基本等效活性的肽。
[0164]
3、抗原识别受体
[0165]
本公开提供了与抗原结合的抗原识别受体。在某些实施方式中，抗原识别受体是嵌合抗原受体(car)。在某些实施方式中，抗原识别受体是t细胞受体(tcr)。抗原识别受体可以与肿瘤抗原或病原体抗原结合。在某些实施方式中，抗原识别受体与肿瘤抗原结合。在某些实施方式中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
[0166]
3.1.抗原
[0167]
在某些实施方式中，抗原识别受体与肿瘤抗原结合。任何肿瘤抗原(抗原肽)均可用于本文所述的肿瘤相关实施方式中。抗原的来源包括但不限于癌蛋白。抗原可表达为肽或完整蛋白质或其部分。完整蛋白质或其部分可以是天然的或诱变的。在某些实施方式中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(tsa)。在某些实施方式中，肿瘤抗原是肿瘤相关抗原(taa)。
[0168]
肿瘤抗原的非限制性实例包括cd19、muc16、muc1、caix、cea、cd8、cd7、cd10、cd20、cd22、cd30、cll1、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd74、cd133、cd138、egp-2、egp-40、epcam、erb-b2、erb-b3、erb-b4、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体a、gd2、gd3、her-2、htert、il-13r-α2、κ-轻链、kdr、突变体kras(包括但不限于g12v、g12d、g12c)、突变体hras、突变体pik3ca(包括但不限于e52k、e545k、h1047r、h1047l)、突变体idh(包括但不限于r132h)、突变体p53(包括但不限于r175h、y220c、g245d、g245s、r248l、r248q、r248w、r249s、r273c、r273l、r273h和r282w)、突变体nras(包括但不限于q61r、q61k和q61l)、ley、l1细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、erbb2、magea3、ct83(也称为kk-lc-1)、p53、mart1、gp100、蛋白酶3(pr1)、酪氨酸酶、生存素、htert、epha2、nkg2d配体、ny-eso-1、癌胚抗原(h5t4)、psca、psma、ror1、tag-72、vegf-r2、wt-1、bcma、cd123、cd44v6、nkcs1、egf1r、egfr-viii、cd99、cd70、adgre2、ccr1、lilrb2、prame、hpv e6癌蛋白、hpv e7癌蛋白和erbb。在某些实施方式中，肿瘤抗原为cd19。
[0169]
在某些实施方式中，抗原识别受体结合到人cd19多肽。在某些实施方式中，人cd19多肽包含seq id no:26所示氨基酸序列或其片段或由其组成。下文提供了seq id no:26。
[0170][0171]
在某些实施方式中，抗原识别受体与人cd19蛋白的细胞外结构域结合。
[0172]
在某些实施方式中，抗原识别受体与病原体抗原结合，例如用于治疗和/或预防病原体感染。病原体的非限制性实例包括能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原生动物。
[0173]
致病性病毒的非限制性实例包括逆转录病毒科(retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒，例如hiv-1(也称为hdtv-iii、lave或htlv-iii/lav或hiv-iii；以及其他分离株，例如hiv-lp)；小核糖核酸病毒科(picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(calciviridae)(例如引起胃肠炎的菌株)；披膜病毒科(togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(flaviridae)(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(coronoviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(rhabdoviridae)(例如水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(bungaviridae)(例如汉坦病毒、布尼亚病毒、白蛉病毒和naira病毒)；沙粒病毒科(arena viridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(birnaviridae)；嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)
(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(herpesviridae)(单纯疱疹病毒(hsv)1和2、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv)、疱疹病毒；痘病毒科(poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类病毒(例如丁型肝炎的病原体(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星)、非甲、非乙型肝炎的病原体(第1类＝肠道传播；第2类＝肠外传播(即丙型肝炎)；诺沃克及相关病毒和星形病毒)、人乳头瘤病毒(即hpv)、jc病毒、epstein-barr病毒、默克尔细胞多瘤病毒。
[0174]
致病菌的非限制性实例包括巴氏杆菌(pasteurella)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococcus)、大肠杆菌(escherichia coli)、假单胞菌(pseudomonas)种和沙门氏菌(salmonella)种。感染性细菌的具体实例包括但不限于幽门螺杆菌(helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(legionella pneumophilia)、分枝杆菌(mycobacteria sps)(例如结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(m.avium)、胞内分枝杆菌(m.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(m.kansaii)、戈登氏分枝杆菌(m.gordonae))、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)、单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)(a组链球菌)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)(b组链球菌)、链球菌(草绿色组)、粪链球菌(streptococcus faecalis)、牛链球菌(streptococcus bovis)、链球菌(厌氧sps.)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲杆菌(pathogenic campylobacter sp.)、肠球菌(enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、bacillus antracis、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌(corynebacterium sp.)、红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringers)、破伤风梭菌(clostridium tetani)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯杆菌(klebsiella pneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(pasturella multocida)、类杆菌(bacteroides sp.)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(streptobacillus moniliformis)、梅毒螺旋体(treponema pallidium)、细弱密螺旋体(treponema pertenue)、钩端螺旋体(leptospira)、立克次体(rickettsia)、艰难梭菌(clostridium difficile)和衣氏放线菌(actinomyces israelli)。
[0175]
在某些实施方式中，病原体抗原是存在于巨细胞病毒(cmv)中的病毒抗原、存在于epstein-barr病毒(ebv)中的病毒抗原、存在于人免疫缺陷病毒(hiv)中的病毒抗原或存在于流感病毒中的病毒抗原。
[0176]
3.2.t细胞受体(tcr)
[0177]
在某些实施方式中，抗原识别受体是tcr。tcr是一种二硫键连接的异二聚体蛋白质，由两条表达为具有不变cd3链分子的复合物的一部分的可变链组成。tcr存在于t细胞表面，负责将抗原识别为与主要组织相容性复合体(mhc)分子结合的肽。在某些实施方式中，tcr包括α链和β链(分别由tra和trb编码)。在某些实施方式中，tcr包括γ链和δ链(分别由trg和trd编码)。
[0178]
tcr的每条链由两个包含可变(v)区和恒定(c)区的细胞外结构域组成。该恒定区靠近细胞膜，其后是跨膜区和缺乏信号转导能力的短细胞质尾。可变区与肽/mhc复合物结合。tcr多肽每对(α/β或γ/δ)的可变结构域包括三个互补决定区(cdr)。
[0179]
在某些实施方式中，tcr可与三维信号传导模块cd3δ/ε、cd3γ/ε和cd3ζ/ζ或ζ/η形成受体复合物。当tcr复合物与其抗原和mhc(肽/mhc)结合时，表达tcr复合物的t细胞被激活。
[0180]
在某些实施方式中，tcr是内源性tcr。在某些实施方式中，tcr识别病毒抗原。在某些实施方式中，tcr在病毒特异性t细胞中表达。在某些实施方式中，病毒特异性t细胞衍生自对病毒感染(例如bk病毒、人疱疹病毒6、epstein-barr病毒(ebv)、巨细胞病毒或腺病毒)免疫的个体。在某些实施方式中，病毒特异性t细胞是leen等人,blood,vol.121,no.26,2013；barker等人,blood,vol.116,no.23,2010；tzannou等人,journal of clinical oncology,vol.35,no.31,2017；或bollard等人,blood,vol.32,no.8,2014中所公开的t细胞，通过引用将其全部并入。在某些实施方式中，tcr识别肿瘤抗原(包括taa或tsa)。在某些实施方式中，tcr在肿瘤特异性t细胞中表达。在某些实施方式中，肿瘤特异性t细胞是通过将t细胞与肿瘤(例如黑色素瘤或上皮癌)的外植体培养而产生的肿瘤浸润性t细胞。在某些实施方式中，肿瘤特异性t细胞是stevanovic等人,science,356,200-205,2017；dudley等人journal of immunotherapy,26(4):332
–
342,2003；或goff等人,journal of clinical oncology,vol.34,no.20,2016中所描述的t细胞，通过引用将其全部内容并入。
[0181]
在某些实施方式中，抗原识别受体是重组tcr。在某些实施方式中，重组tcr与任何天然存在的tcr的不同之处在于至少一个氨基酸残基。在某些实施方式中，非天然存在的tcr与任何天然存在的tcr的差异至少为约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100或更多氨基酸残基。在某些实施方式中，非天然存在的tcr由天然存在的tcr经至少一个氨基酸残基修饰。在某些实施方式中，非天然存在的tcr从天然存在的tcr修饰至少约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约20、约25、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100或更多氨基酸残基。
[0182]
3.3.嵌合抗原受体(car)
[0183]
在某些实施方式中，抗原识别受体是car。car是一种工程受体，它将目的特异性移植或赋予免疫效应细胞或免疫应答细胞。car可用于赋予t细胞非mhc限制性抗原特异性。逆转录病毒载体促进其编码序列的转移。
[0184]
car是通过一系列被称为“代”的重大改进而发展起来的。所谓的“第一代”car通常由融合到跨膜结构域(跨膜结构域融合到细胞质/细胞内信号传导结构域)的细胞外抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scfv))组成。细胞质/细胞内信号传导结构域可包含单个激活结构域-通常是衍生自cd3ζ的itam。“第一代”car可以提供从头抗原识别，并通过单个融合分子中的cd3ζ链信号传导结构域激活cd4
+
和cd8
+
t细胞，与hla介导的抗原呈递无关。“第二代”car将衍生自各种共刺激分子中(例如cd28、4-1bb、icos、ox40)的任何一种的细胞内信号传导结构域添加到car的细胞质尾部，以向t细胞提供额外信号。“第二代”car包括同时提供共刺激(例如cd28或4-1bb)和激活(cd3ζ)的car。“第三代”car包括提供多重共刺激(例如cd28和4-1bb)和激活(cd3ζ)的car。在某些实施方式中，抗原识别受体是第一代car。在某
些实施方式中，抗原识别受体是第二代car。在某些实施方式中，抗原识别受体是第三代car。
[0185]
在某些实施方式中，car的细胞外抗原结合结构域(例如体现在单链抗体或其类似物中)结合抗原，解离常数(kd)约为2
×
10-7
m或更小。在某些实施方式中，kd约为2
×
10-7
m或更小、约1
×
10-7
m或更小、约9
×
10-8
m或更小、约1
×
10-8
m或更小、约9
×
10-9
m或更小、约5
×
10-9
m或更小、约4
×
10-9
m或更小、约3
×
10-9
m或更小、约2
×
10-9
m或更小、约1
×
10-9
m或更小。在某些实施方式中，kd约为3
×
10-9
m或更小。在某些实施方式中，kd为约1
×
10-9
m至约3
×
10-7
m。在某些实施方式中，kd为约1.5
×
10-9
m至约3
×
10-7
m。在某些实施方式中，kd为约1.5
×
10-9
m至约2.7
×
10-7
m。
[0186]
细胞外抗原结合结构域(例如，scfv或其类似物)的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、facs分析、生物测定(例如，生长抑制)或western blot测定来确认。这些测定法中的每一种通常通过使用特定于目的复合物的标记试剂(例如抗体或scfv)来检测特定目的蛋白质抗体复合物的存在。例如，scfv可以被放射性标记并用于放射免疫测定(ria)(例如，见weintraub,b.,principles of radioimmunoassays,seventh training course on radioligand assay techniques,the endocrine society,march,1986，其并入本文以供参考)。放射性同位素可以通过使用γ计数器或闪烁计数器或放射自显影等方法来检测。在某些实施方式中，car的细胞外抗原结合结构域用荧光标志物标记。荧光标志物的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(gfp)、蓝色荧光蛋白(例如ebfp、ebfp2、azurite和mkalama1)、青色荧光蛋白(例如ecfp、cerulean和cypet)和黄色荧光蛋白(例如yfp、citrine、venus和ypet)。细胞外抗原结合结构域的结合也可以通过测量细胞因子的分泌来证实。
[0187]
根据本公开主题，car包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中细胞外抗原结合结构域特异性结合到抗原，该抗原可以是肿瘤抗原(taa或tsa)或病原体抗原。
[0188]
在某些实施方式中，car包含与cd19结合的细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，car是kochenderfer,jn等人.blood.2010nov 11；116(19):3875-86，其全文并入本文以供参考。
[0189]
3.3.1.car的细胞外抗原结合结构域
[0190]
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域与抗原特异性结合。在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原。在某些实施方式中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(tsa)。在某些实施方式中，肿瘤抗原是肿瘤相关抗原(taa)。在某些实施方式中，肿瘤抗原为cd19。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scfv。在某些实施方式中，scfv是人scfv。在某些实施方式中，scfv是人源化scfv。在某些实施方式中，scfv是小鼠scfv。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是fab，其任选地交联。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是f(ab)2。在某些实施方式中，上述任何分子可包含具有异源序列的融合蛋白中以形成细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，通过筛选具有抗原fc融合蛋白的scfv噬菌体库来鉴定scfv。在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原。在某些实施方式中，抗原是病原体抗原。
[0191]
3.3.2.car的跨膜结构域
[0192]
在某些实施方式中，car的跨膜结构域包含跨越膜的至少一部分的疏水性α螺旋。
不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。抗原识别后，受体聚集，信号传导到细胞。根据本公开主题，car的跨膜结构域可包含cd8多肽、cd28多肽、cd3ζ多肽、cd4多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、合成肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)、或其组合。
[0193]
在某些实施方式中，跨膜结构域包含cd8多肽。在某些实施方式中，跨膜结构域包含人cd8的跨膜结构域或其一部分。在某些实施方式中，cd8多肽包含与具有ncbi参考号np_001139345.1(seq id no:27)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代或由其组成。在某些实施方式中，cd8多肽包含作为seq id no:27的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，且至多235个氨基酸。在某些实施方式中，cd8多肽包含seq id no:27的氨基酸1至235、1至50、50至100、100至150、137至209、150至200或200至235的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，car包含cd8(例如，人cd8)的跨膜结构域或其一部分。在某些实施方式中，car的跨膜结构域包含cd8多肽，该cd8多肽包含seq id no:27的氨基酸137至209的氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:27。
[0194][0195]
在某些实施方式中，跨膜结构域包含小鼠cd8的跨膜结构域或其一部分。在某些实施方式中，cd8多肽包含与具有ncbi参考号aaa92533.1(seq id no:28)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代或由其组成。在某些实施方式中，cd8多肽包含作为seq id no:28的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、或至少约60、或至少约70、或至少约100、或至少约200，且至多247个氨基酸。在某些实施方式中，cd8多肽包含seq id no:28的氨基酸1至247、1至50、50至100、100至150、150至200、151至219或200至247的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，car的跨膜结构域包含cd8多肽或由其组成，该cd8多肽包含seq id no:28的氨基酸151至219的氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:28。
[0196][0197]
根据本公开主题，“cd8核酸分子”是指编码cd8多肽的多核苷酸。
[0198]
在某些实施方式中，本公开car的跨膜结构域包含cd28多肽。在某些实施方式中，跨膜结构域包含人cd28的跨膜结构域或其一部分。在某些实施方式中，cd28多肽包含与具有ncbi参考号np_006130(seq id no:29)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/
或可任选包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，cd28多肽包含作为seq id no:29的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，且至多220个氨基酸。在某些实施方式中，cd28多肽包含seq id no:29的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200、153至179或200至220的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，cd28多肽包含seq id no:29的氨基酸114至220的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，car的跨膜结构域包含cd28多肽，该cd28多肽包含seq id no:29的氨基酸153至179或由其组成。下文提供了seq id no:29：
[0199][0200]
编码seq id no:29的氨基酸153至179的示例性核酸序列示于下文提供的seq id no:30中。
[0201][0202]
在某些实施方式中，本公开的car的跨膜结构域包含小鼠cd28的跨膜结构域或其片段。在某些实施方式中，cd28多肽包含与具有ncbi参考号np_031668.3(seq id no:31)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代或由其组成。在某些实施方式中，cd28多肽包含作为seq id no:31的连续部分的氨基酸序列组成或由其组成，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，且至多218个氨基酸。在某些实施方式中，cd28多肽包含seq id no:31的氨基酸1至218、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200、151至177或200至220的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，cd28多肽包含seq id no:31的氨基酸114至220的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，car的跨膜结构域包含cd28多肽或由其组成，该cd28多肽包含seq id no:31的氨基酸151至177或由其组成。下文提供了seq id no:31：
[0203][0204]
根据本公开主题，“cd28核酸分子”是指编码cd28多肽的多核苷酸。
[0205]
在某些实施方式中，car还包括将细胞外抗原结合结构域连接到跨膜结构域的间隔区。间隔区可以足够灵活，以允许抗原结合结构域在不同方向上定向，以促进抗原识别。间隔区可以是来自igg1的铰链区或免疫球蛋白的ch2ch3区和cd3的部分、cd28多肽的一部分(例如，seq id no:29或seq id no:31的一部分)、cd8多肽的一部分(例如，seq id no:27的一部分或seq id no:28的一部分)、上述任何一种的变体(与其具有至少约80％、至少约85％、至少约90％，或至少95％同源性或同一性)、或合成间隔序列。
[0206]
3.3.3.car的细胞内信号传导结构域
[0207]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含cd3ζ多肽，其可激活或刺激
细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如t细胞)。野生型(“天然”)cd3ζ包含三个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(“itam”)(例如itam1、itam2和itam3)，并在抗原结合后将激活信号转导给细胞(例如淋巴谱系的细胞，例如t细胞)。天然cd3ζ多肽的细胞内信号传导结构域是内源性tcr信号的主要递质。
[0208]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含天然cd3ζ多肽。在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含人cd3ζ多肽。在某些实施方式中，cd3ζ多肽包含与具有ncbi参考号np_932170(seq id no:32)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代或由其组成。在某些实施方式中，cd3ζ多肽包含作为seq id no:32的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，且至多164个氨基酸。在某些实施方式中，cd3ζ多肽包含seq id no:32的氨基酸1至164、1至50、50至100、100至150、52或164或150至164的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含cd3ζ多肽，该cd3ζ多肽由seq id no:32的氨基酸52至164组成。下文提供了seq id no:32：
[0209][0210]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含小鼠cd3ζ多肽。在某些实施方式中，cd3ζ多肽包含与具有ncbi参考号np_001106864.2(seq id no:33)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代或由其组成。在某些实施方式中，cd3ζ多肽包含作为seq id no:33的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、或至少约90、或至少约100，且至多188个氨基酸。在某些实施方式中，cd3ζ多肽包含seq id no:33的氨基酸1至164、1至50、50至100、52至142、100至150或150至188的氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:33：
[0211][0212]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含cd3ζ多肽，该cd3ζ多肽包含seq id no:34所示氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:34。
[0213][0214]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含经修饰的cd3ζ多肽。在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含经修饰的人cd3ζ多肽。在某些实施方式中，经修饰的cd3ζ多肽包含与seq id no:35具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％、至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保
守氨基酸取代或由其组成。下文提供了seq id no:35：
[0215][0216]
编码seq id no:35的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的seq id no:36中。
[0217][0218]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含经修饰的cd3ζ多肽，该经修饰的cd3ζ多肽包含一个、两个或三个itam。在某些实施方式中，经修饰的cd3ζ多肽包含天然itam1，该天然itam1包含seq id no:37所示氨基酸序列或由其组成。
[0219][0220]
编码seq id no:37的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的seq id no:38中。
[0221][0222]
在某些实施方式中，经修饰的cd3ζ多肽包含itam1变体，该itam1变体包含一个或多个功能失去突变。在某些实施方式中，itam1变体包含两个功能失去突变或由其组成。在某些实施方式中，一个或多个(例如，两个)功能失去突变中的每一个包括itam1中酪氨酸残基的突变。在某些实施方式中，itam1变体(例如，由两个功能失去突变组成的变体)包含下文提供的seq id no:39所示氨基酸序列或由其组成。
[0223][0224]
编码seq id no:39的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的seq id no:40中。
[0225][0226]
在某些实施方式中，经修饰的cd3ζ多肽包含天然itam2，该天然itam2包含下文提供的seq id no:41所示氨基酸序列或由其组成。
[0227][0228]
编码seq id no:41所示氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的seq id no:42中。
[0229]
在某些实施方式中，经修饰的cd3ζ多肽包含itam2变体，该itam2变体包含一个或多个功能失去突变。在某些实施方式中，itam2变体包含两个功能失去突变或由其组成。在某些实施方式中，一个或多个(例如，两个)功能失去突变中的每一个包含itam2中酪氨酸残基的突变或由其组成。在某些实施方式中，itam2变体(例如，由两个功能失去突变组成的变体)包含下文提供的seq id no:43所示氨基酸序列或由其组成。
[0230][0231]
编码seq id no:43的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的seq id no:44中。
[0232][0233]
在某些实施方式中，经修饰的cd3ζ多肽包含天然itam3，该天然itam3包含下文提供的seq id no:45所示氨基酸序列或由其组成。
[0234][0235]
编码seq id no:45的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的seq id no:46中。
[0236][0237]
在某些实施方式中，经修饰的cd3ζ多肽包含itam3变体，该itam3变体包含一个或多个功能失去突变。在某些实施方式中，itam3变体包含两个功能失去突变或由其组成。在某些实施方式中，一个或多个(例如，两个)功能失去突变中的每一个包含itam3中酪氨酸残基的突变或由其组成。在某些实施方式中，itam3变体(例如，由两个功能失去突变组成的变体)包含下文提供的seq id no:47所示氨基酸序列或由其组成。
[0238][0239]
编码seq id no:47的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的seq id no:48中。
[0240][0241]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含经修饰的cd3ζ多肽，该经修饰的cd3ζ多肽包含或由以下组成：天然itam1、包含一个或多个功能失去突变或由其组成的itam2变体、和包含一个或多个功能失去突变或由其组成的itam3变体、或其组合。在某些实施方式中，itam2变体包含两个功能失去突变或由其组成，itam3变体包含两个功能失去突变或由其组成。在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含经修饰的cd3ζ多肽，该经修饰的cd3ζ多肽包含或由以下组成：天然itam1、包含两个功能失去突变或由其组成的itam2变体和包含两个功能失去突变或由其组成的itam3变体。在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含经修饰的cd3ζ多肽，该经修饰的cd3ζ多肽包含或由以下组成：由seq id no:37所示氨基酸序列组成的天然itam1、由seq id no:43所示氨基酸序列组成的itam2变体、由seq id no:47所示氨基酸序列组成的itam3变体。在某些实施方式中，car结合到cd19，并且该car被指定为“1xx”。在某些实施方式中，经修饰的cd3ζ多肽包含seq id no:35所示氨基酸序列或由其组成。
[0242]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含如wo2019/133969中所公开的经修饰的cd3ζ多肽，其并入本文以供参考。
[0243]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域不包含共刺激信号传导区，即，car是第一代car。
[0244]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域还包含至少一个共刺激信号传
导区。在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含可提供最佳淋巴细胞激活的至少一个共刺激分子或其一部分，或由其组成。如本文所用，“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。共刺激分子可以提供最佳的淋巴细胞激活。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包含cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、或其组合，或由其组成。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包含cd28多肽或由其组成。共刺激分子可与共刺激配体结合，该配体是在细胞表面表达的蛋白质，其在与其受体结合时产生共刺激应答，即影响抗原与其car分子结合时提供的刺激的细胞内应答。共刺激配体包括但不限于cd80、cd86、cd70、ox40l和4-1bbl。例如，4-1bb配体(即4-1bbl)可结合到4-1bb(也称为“cd137”)以提供细胞内信号，该信号与car信号结合诱导car
+
t细胞的效应细胞功能。u.s.7,446,190中公开了包含细胞内信号传导结构域的car，该细胞内信号传导结构域包含：包含4-1bb、icos或dap-10的共刺激信号传导区，其全文并入本文以供参考。
[0245]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含cd28多肽或由其组成。在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含cd28的细胞内结构域或其一部分或由其组成。在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含人cd28的细胞内结构域或其一部分或由其组成。在某些实施方式中，cd28多肽包含与seq id no:29所示氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代或由其组成。在某些实施方式中，cd28多肽包含作为seq id no:29的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50，且至多220个氨基酸。在某些实施方式中，cd28多肽包含seq id no:29的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200、181至220或200至220的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，cd28多肽包含seq id no:29的氨基酸181至220的氨基酸序列或由其组成。
[0246]
在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含小鼠cd28的细胞内结构域或其一部分或由其组成。在某些实施方式中，cd28多肽包含与seq id no:31所示氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代或由其组成。在某些实施方式中，cd28多肽包含作为seq id no:31的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50，且至多218个氨基酸。在某些实施方式中，cd28多肽包含seq id no:31的氨基酸1至218、1至50、50至100、100至150、114至218、115至218、150至200、178至218或200至218的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，cd28多肽包含seq id no:31的氨基酸115至218的氨基酸序列或由其组成。
[0247]
根据本公开主题，“cd28核酸分子”是指编码cd28多肽的多核苷酸。
[0248]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含两个共刺激分子的细胞内结构域或其部分或由其组成：cd28的细胞内结构域或其一部分和4-1bb的细胞内结构域或其一部分，或cd28的细胞内结构域或其一部分和ox40的细胞内结构域或其一部分。
[0249]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含4-1bb多肽或由其组成。在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含4-1bb的细胞内结构域或其一部分或由其组成。在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含人4-1bb的细胞内结构域或其一部分或由其组成。4-1bb可以作为肿瘤坏死因子(tnf)配体并具有刺激活性。在某些实施方式中，4-1bb多肽包含与具有ncbi参考号np_001552(seq id no:49)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代或由其组成。在某些实施方式中，4-1bb多肽包含作为seq id no:49的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50，且至多255个氨基酸。在某些实施方式中，4-1bb多肽包含seq id no:49的氨基酸1至255、1至50、50至100、100至150、150至200、214-255或200至255的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方式中，4-1bb多肽包含seq id no:49的氨基酸214-255的氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:49：
[0250][0251]
根据本公开主题，“4-1bb核酸分子”是指编码4-1bb多肽的多核苷酸。
[0252]
在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含小鼠4-1bb的细胞内信号传导结构域或其一部分。
[0253]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含ox40多肽或由其组成。在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含ox40的细胞内结构域或其一部分或由其组成。在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含人ox40的细胞内结构域或其一部分或由其组成。在某些实施方式中，ox40多肽包含与具有ncbi参考号np_003318(seq id no:50)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代或由其组成。在某些实施方式中，ox40多肽包含作为seq id no:50的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30，或至少约40、或至少约50，且至多277个氨基酸。在某些实施方式中，4-1bb多肽包含seq id no:50的氨基酸1至277、1至50、50至100、100至150、150至200或200至277的氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:50：
[0254][0255]
根据本公开主题，“ox40核酸分子”是指编码ox40多肽的多核苷酸。
[0256]
在某些实施方式中，car的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导区，该共刺激信号传导区包含icos多肽或由其组成。在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含icos的细胞内结构域或其一部分或由其组成。在某些实施方式中，共刺激信号传导区包含人icos的细胞内结构域或其一部分或由其组成。在某些实施方式中，icos多肽包含与具有ncbi参考号np_036224(seq id no:51)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，或由其组成，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代或由其组成。在某些实施方式中，icos多肽包含作为seq id no:51的连续部分的氨基酸序列或由其组成，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50，且至多199个氨基酸。在某些实施方式中，icos多肽包含seq id no:51的氨基酸1至277、1至50、50至100、100至150或150至199的氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:51：
[0257]
根据本公开主题，“icos核酸分子”是指编码icos多肽的多核苷酸。
[0258]
3.3.4.示例性car
[0259]
在某些实施方式中，本公开的car包含或由以下组成：a)与cd19多肽(例如，人cd19多肽)结合的细胞外抗原结合结构域，b)包含cd28多肽或由其组成的跨膜结构域(例如，人cd28的跨膜结构域或其一部分)，和c)包含cd3ζ多肽或由其组成的细胞内信号传导结构域和包含cd28多肽或由其组成的共刺激信号传导区(例如，人cd28的细胞内结构域或其一部分)。在某些实施方式中，car被指定为“cd1928ζ”。在某些实施方式中，car(例如cd1928ζ)包含seq id no:52所示氨基酸序列或由其组成。下文提供了seq id no:52。
[0260][0261]
编码seq id no:52的氨基酸序列的示例性核酸序列示于seq id no:53中。下文提供了seq id no:53。
[0262][0263]
在某些实施方式中，细胞包含i)本公开的显性负性fas多肽和ii)包含或由以下组成的car：a)细胞外抗原结合结构域，其与cd19(例如，人cd19)结合，b)跨膜结构域，其包含cd28多肽(例如，人cd28多肽，例如，cd28的跨膜结构域(例如，人cd28)或其一部分)或由其组成，以及c)细胞内信号传导结构域和共刺激信号传导区，该细胞内信号传导结构域包含经修饰的cd3ζ多肽或由其组成，该经修饰的cd3ζ多肽或由以下组成：由seq id no:37所示氨基酸序列组成的天然itam1、由seq id no:43所示氨基酸序列组成的itam2变体和由seq id no:47所示氨基酸序列组成的itam3变体，该共刺激信号传导区包含cd28多肽(例如人cd28多肽，例如cd28的细胞内结构域(例如人cd28)或其一部分)或由其组成。在某些实施方式中，car被指定为“1928ζ1xx”。在某些实施方式中，car(例如1928ζ1xx)包含与下文提供的seq id no:54所示氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或由其组成。seq id no:54能够与cd19(例如，人cd19)结合。
[0264][0265]
编码seq id no:54的氨基酸序列的示例性核酸序列示于下文提供的seq id no:55中。
[0266][0267][0268]
4、细胞
[0269]
本公开主题提供包含本文公开的显性负性fas多肽的细胞。在某些实施方式中，细胞还包含与抗原结合的抗原识别受体(例如，car或tcr)。在某些实施方式中，显性负性fas多肽是外源性显性负性fas多肽。在某些实施方式中，抗原识别受体能够激活细胞。在某些实施方式中，显性负性fas多肽(例如，外源性显性负性fas多肽)能够促进细胞的抗肿瘤作用。可以用抗原识别受体和外源显性负性fas多肽转导细胞，使得细胞共表达抗原识别受体和外源显性负性fas多肽。
[0270]
在某些实施方式中，细胞是免疫应答细胞。在某些实施方式中，该细胞是淋巴谱系
的细胞。淋巴谱系的细胞产生抗体，调节细胞免疫系统，并检测血液中的异物和宿主外源细胞等。淋巴谱系的细胞的非限制性实例包括t细胞、自然杀伤(nk)细胞、b细胞、树突状细胞和可分化出淋巴细胞的干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。
[0271]
在某些实施方式中，细胞是t细胞。t细胞可以是胸腺中成熟的淋巴细胞，主要负责细胞介导的免疫。t细胞是适应性免疫系统的一部分。在某些实施方式中，本文提供的t细胞包括任何类型的t细胞，包括但不限于辅助性t细胞、细胞毒性t细胞、记忆性t细胞(包括中枢记忆性t细胞、干细胞样记忆性t细胞(或干样记忆性t细胞)和两种类型的效应记忆性t细胞：例如，t
em
细胞和t
emra
细胞、调节性t细胞(也称为抑制性t细胞或t
regs
)、肿瘤浸润淋巴细胞(til)、自然杀伤t细胞、粘膜相关不变t细胞和γδt细胞。细胞毒性t细胞(ctl或杀伤性t细胞)是能够诱导感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的t淋巴细胞子集。患者自身的t细胞(即自体t细胞)可通过引入抗原识别受体(例如car或tcr)进行遗传修饰以靶向特定抗原。在某些实施方式中，细胞是t细胞。t细胞可以是cd4
+
t细胞或cd8
+
t细胞。在某些实施方式中，t细胞是cd4
+
t细胞。在某些实施方式中，t细胞是cd8
+
t细胞。
[0272]
在某些实施方式中，细胞是病毒特异性t细胞。在某些实施方式中，病毒特异性t细胞包含识别病毒抗原的内源性tcr。在某些实施方式中，细胞是肿瘤特异性t细胞。在某些实施方式中，肿瘤特异性t细胞包含识别肿瘤抗原(tsa或taa)的内源性tcr。
[0273]
在某些实施方式中，细胞是nk细胞。自然杀伤(nk)细胞可以是淋巴细胞，是细胞介导免疫的一部分，在先天免疫应答中起作用。nk细胞无需事先激活，即可对靶细胞发挥细胞毒性作用。
[0274]
本公开主题的人淋巴细胞类型包括但不限于外周供体淋巴细胞，例如，在sadelain,m.,等人2003nat rev cancer 3:35-45(公开了经遗传修饰以表达car的外周供体淋巴细胞)、morgan,r.a.,等人2006science 314:126-129(公开了经基因改造以表达全长肿瘤抗原识别t细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞，该复合物包含α和β异二聚体)、panelli,m.c.,等人2000j immunol 164:495-504；panelli,m.c.,等人2000j immunol 164:4382-4392(公开了肿瘤活检中肿瘤浸润淋巴细胞(til)衍生的淋巴细胞培养物)以及dupont,j.等人2005cancer res65:5417-5427；papanicolaou,g.a.,等人2003blood 102:2498-2505(公开了使用人工抗原呈递细胞(aapc)或脉冲树突状细胞选择性体外扩增的抗原特异性外周血白细胞)中公开的那些。免疫应答细胞(例如t细胞)可以是自体的、非自体的(例如同种异体的)或从工程祖细胞或干细胞体外衍生的。
[0275]
在某些实施方式中，细胞是骨髓谱系的细胞。骨髓谱系的细胞的非限制性实例包括单核细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、红细胞、巨核细胞、血小板细胞和可从中分化出骨髓细胞的干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导多能干细胞)。
[0276]
本公开的细胞能够调节肿瘤微环境。肿瘤具有对宿主免疫应答不利的微环境，涉及恶性细胞保护自身免受免疫识别和消除的一系列机制。这种不利的“肿瘤微环境”包括多种免疫抑制因子，包括浸润性调节性cd4
+
t细胞(treg)、髓源性抑制细胞(mdsc)、肿瘤相关巨噬细胞(tam)、包括tgf-β在内的免疫抑制细胞因子，以及针对活化t细胞表达的免疫抑制受体(ctla-4和pd-1)的配体的表达。这些免疫抑制机制在维持耐受性和抑制不当免疫应答
方面发挥作用，然而在肿瘤微环境中，这些机制阻止了有效的抗肿瘤免疫应答。总的来说，这些免疫抑制因子在与靶向肿瘤细胞相遇时可以诱导过继转移的car修饰的t细胞显著无反应力或凋亡。
[0277]
在某些实施方式中，本公开的细胞具有增加的细胞持久性。在某些实施方式中，本公开的细胞具有降低的凋亡和/或无反应力。
[0278]
5、组合物和载体
[0279]
本公开主题提供包含本文公开的显性负性fas多肽(例如，第2节公开的)和本文公开的抗原识别受体(例如，第3节公开的)的组合物。还提供包含这种组合物的细胞(例如，免疫应答细胞)。
[0280]
在某些实施方式中，显性负性fas多肽可操作地与第一启动子连接。在某些实施方式中，抗原识别受体可操作地与第二启动子连接。
[0281]
此外，本公开主题提供核酸组合物，其包含编码本文公开的显性负性fas多肽的第一多核苷酸(例如，在第2节中公开的)和编码本文公开的抗原识别受体的第二多核苷酸(例如，在第3节中公开的)。还提供了包含这种核酸组合物的细胞。
[0282]
在某些实施方式中，核酸组合物还包含可操作地与显性负性fas多肽连接的第一启动子。在某些实施方式中，核酸组合物还包含可操作地与抗原识别受体连接的第二启动子。
[0283]
在某些实施方式中，第一和第二启动子中的一个或两者是内源性或外源性的。在某些实施方式中，外源启动子选自延伸因子(ef)-1启动子、cmv启动子、sv40启动子、pgk启动子、长末端重复序列(ltr)启动子和金属硫蛋白启动子。在某些实施方式中，第一和第二启动子中的一个或两者是诱导型启动子。在某些实施方式中，诱导型启动子选自nfat转录应答元件(tre)启动子、cd69启动子、cd25启动子、il-2启动子、il-12启动子、p40启动子和bcl-xl启动子。
[0284]
此外，本公开主题提供包含核酸组合物的载体。在某些实施方式中，载体是逆转录病毒载体。在某些实施方式中，载体是慢病毒载体。
[0285]
组合物和核酸组合物可通过本领域已知或本文所述的方法施用于受试者或和/或递送至细胞中。细胞(例如t细胞)的遗传修饰可以通过用重组dna构建体转导基本均匀的细胞组合物来实现。在某些实施方式中，使用逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体)将dna构建体引入细胞。例如，编码抗原识别受体的第一多核苷酸和编码显性负性fas多肽的第二多核苷酸可以克隆到逆转录病毒载体中，并且表达可以从其内源性启动子、逆转录病毒长末端重复序列或特定于目标细胞类型的启动子驱动。也可以使用非病毒载体。
[0286]
为了使细胞的初始遗传修饰包括显性负性fas多肽和抗原识别受体(例如car或tcr)，通常使用逆转录病毒载体进行转导，但是可以使用任何其他合适的病毒载体或非病毒递送系统。抗原识别受体和显性负性fas多肽可以构建在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中。可用于创建多顺反子表达盒的元件实例包括但不限于，各种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(ires，例如fgf-1ires、fgf-2ires、vegf ires、igf-ii ires、nf-κb ires、runx1ires、p53 ires、甲型肝炎ires、丙型肝炎ires、瘟病毒属ires、口蹄疫病毒属ires、小核糖核酸病毒ires、脊髓灰质炎病毒ires和脑心肌炎病毒ires)和可切割接头(例如2a肽，例如p2a、t2a、e2a和f2a肽)。逆转录病毒载体和适当包装线的组合也适
用，其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知多种生产双嗜性病毒的细胞系，包括但不限于pa12(miller等人(1985)mol.cell.biol.5:431-437)；pa317(miller等人(1986)mol.cell.biol.6:2895-2902)和crip(danos等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:6460-6464)。非双嗜性颗粒也适用，例如，具有vsvg、rd114或galv包络的假型颗粒以及本领域的任何其他已知颗粒。
[0287]
可能的转导方法还包括细胞与生产细胞的直接共培养，例如通过bregni,等人(1992)blood 80:1418-1422的方法或用单独的病毒上清液或带有或不带有适当生长因子和聚阳离子的浓缩载体原液培养，例如通过xu等人(1994)exp.hemat.22:223-230；和hughes等人(1992)j.clin.invest.89:1817的方法。
[0288]
其他转导病毒载体可用于修饰细胞。在某些实施方式中，所选择的载体表现出高效的感染和稳定的整合与表达(参见例如，cayouette等人,human gene therapy 8:423-430,1997；kido等人,current eye research 15:833-844,1996；bloomer等人,journal of virology71:6641-6649,1997；naldini等人,science 272:263 267,1996；和miyoshi等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.94:10319,1997)。可使用的其他病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、痘苗病毒、牛乳头状瘤病毒或疱疹病毒，例如epstein-barr病毒(例如，另请参阅如下所述的载体miller,human gene therapy 15-14,1990；friedman,science244:1275-1281,1989；eglitis等人,biotechniques 6:608-614,1988；tolstoshev等人,current opinion in biotechnology 1:55-61,1990；sharp,the lancet 337:1277-1278,1991；cornetta等人,nucleic acid research and molecular biology 36:311-322,1987；anderson,science 226:401-409,1984；moen,blood cells 17:407-416,1991；miller等人,biotechnology7:980-990,1989；le gal la salle等人,science 259:988-990,1993；和johnson,chest 107:77s-83s,1995)。逆转录病毒载体得以特别充分的开发，已用于临床环境(rosenberg等人,n.engl.j.med.323:370,1990；anderson等人,u.s.pat.no.5,399,346)。
[0289]
非病毒方法也可用于细胞的遗传修饰。例如，可以通过在在存在脂质体转染(feigner等人,proc.nat’l.acad.sci.u.s.a.84:7413,1987；ono等人,neuroscience letters 17:259,1990；brigham等人,am.j.med.sci.298:278,1989；staubinger等人,methods in enzymology 101:512,1983)、无唾液酸血清类黏蛋白-聚赖氨酸接合(wu等人,journal of biological chemistry 263:14621,1988；wu等人,journal of biological chemistry 264:16985,1989)或在外科条件下通过微量注射(wolff等人，science 247:1465,1990)的情况下通过施用核酸将核酸分子引入细胞。其他非病毒基因转移方法包括使用磷酸钙、deae-葡聚糖、电穿孔和原生质体融合进行体外转染。脂质体也可能有利于将dna递送到细胞中。将正常基因移植到受试者的受影响组织中也可以通过将正常核酸转移到离体可培养的细胞类型(例如，自体或异种原代细胞或其后代)中来实现，然后将细胞(或其后代)注射到靶向组织中或系统注射。还可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶、巨核酸酶(meganucleases)或tale核酸酶、crispr)衍生或获得重组受体。可通过rna电穿孔获得瞬时表达。
[0290]
任何靶向基因组编辑方法也可用于将本文公开的显性负性fas多肽和/或抗原识别受体递送至细胞或受试者。在某些实施方式中，使用crispr系统递送本文公开的显性负
性fas多肽和/或抗原识别受体。在某些实施方式中，使用锌指核酸酶递送本文公开的显性负性fas多肽和/或抗原识别受体。在某些实施方式中，使用talen系统递送本文公开的显性负性fas多肽和/或抗原识别受体。
[0291]
规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)系统是在原核细胞中发现的一种基因组编辑工具。当用于基因组编辑时，该系统包括cas9(一种能够利用crrna作为其向导来修饰dna的蛋白质)、crispr rna(crrna，包含cas9用于将其引导到宿主dna的正确部分的rna，以及与tracrrna结合的区域(通常以发夹环形式)，与cas9形成活性复合物)、反式激活crrna(tracrrna，与crrna结合并与cas9形成活性复合物)和dna修复模板的可选部分(引导细胞修复过程的dna，允许插入特定的dna序列)。crispr/cas9通常使用质粒转染靶细胞。crrna需要针对每项应用进行设计，因为这是cas9用于识别并直接与细胞中的目标dna结合的序列。携带car表达盒的修复模板也需要针对每项应用进行设计，因为它必须与切口任一侧的序列重叠，并为插入序列编码。多个crrna和tracrrna可以包装在一起，形成单一的向导rna(sgrna)。这种sgrna可以与cas9基因结合在一起，制成质粒，以便转染到细胞中。
[0292]
锌指核酸酶(zfn)是一种人工限制性内切酶，由锌指dna结合结构域与dna切割结构结构域结合产生。锌指结构域可以被工程化为靶向特定dna序列，从而使锌指核酸酶能够靶向基因组内所需的序列。单个zfn的dna结合结构域通常包含多个单独的锌指重复序列，并且每个锌指重复序列可以识别多个碱基对。生成新锌指结构域的最常见方法是结合具有已知特异性的较小锌指“模块”。zfn中最常见的切割结构域是来自ii型限制性核酸内切酶foki的非特异性切割结构域。利用内源性同源重组(hr)机制和携带car表达盒的同源dna模板，zfn可用于将car表达盒插入基因组。当目标序列被zfn切割时，hr机制搜索受损染色体和同源dna模板之间的同源性，然后在染色体的两个断裂端之间复制模板序列，从而将同源dna模板整合到基因组中。
[0293]
转录激活因子样效应子核酸酶(talen)是一种限制性内切酶，可以通过工程化切割特定的dna序列。talen系统的工作原理与zfn几乎相同。它们是通过结合转录激活因子样效应子dna结合结构域和dna切割结构域生成的。转录激活因子样效应子(tale)由33-34个氨基酸重复基序组成，具有两个可变位置，对特定核苷酸有很强的识别能力。通过组装这些tale的阵列，tale dna结合结构域可以工程化以结合所需的dna序列，从而引导核酸酶在基因组dna序列中的特定位置切割。
[0294]
多核苷酸治疗方法可以由任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)或金属硫蛋白启动子)指导，并由任何合适的哺乳动物调节元件或内含子(例如延长因子1a增强子/启动子/内含子结构)调控。例如，如果需要，可以使用已知优先指导特定细胞类型中基因表达的增强子来指导核酸的表达。所使用的增强子可以包括但不限于那些表征为组织或细胞特异性增强子的增强子。或者，如果将基因组克隆用作治疗构建体，则可通过同源调控序列或(如果需要)通过源自异源的调控序列(包括上述任何启动子或调控元件)来介导调控。
[0295]
根据需要，递送基因组编辑试剂/系统的方法可有所不同。在某些实施方式中，所选基因组编辑方法的组分作为一个或多个质粒中的dna构建体递送。在某些实施方式中，组分通过病毒载体递送。常见的递送方法包括但不限于电穿孔、微量注射、基因枪、穿刺感染、静水压、连续输注、超声、磁转染、腺相关病毒、病毒载体的包膜蛋白假型、复制活性载体顺
式和反式作用元件、单纯疱疹病毒、和化学载体(例如寡核苷酸、脂复合物、聚合物囊泡、多聚物、树状聚合物、无机纳米粒子和细胞穿透肽)。
[0296]
所得细胞可以在与未修饰细胞类似的条件下生长，由此经修饰的细胞可以扩增并用于各种目的。
[0297]
6、多肽和类似物
[0298]
在本公开的主题中还包括，在免疫应答细胞中表达时以增强其抗赘生物活性的方式修饰的cd19、cd28、4-1bb、cd8、cd3ζ以及fas多肽或其片段。本公开主题提供通过在序列中产生改变来优化氨基酸序列或核酸序列的方法。这种改变可包括某些突变、缺失、插入或翻译后修饰。本公开主题还包括本文公开的任何天然存在的多肽(包括但不限于cd19、cd8、4-1bb、cd28、cd3ζ和fas)的类似物。类似物可以通过氨基酸序列差异、翻译后修饰或两者均有而不同于本文公开的天然存在的多肽。类似物可表现出与本公开主题的全部或部分天然存在的氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的同源性或同一性。序列比较的长度为至少5、10、15或20个氨基酸残基，例如，至少25、50或75个氨基酸残基，或超过100个氨基酸残基。同样，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，概率分数在e-3
和e-100
之间，表示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如乙酰化、羧基化、磷酸化或糖基化；这种修饰可发生在多肽合成或加工过程中，或用分离的修饰酶处理后。类似物也可以通过一级序列的改变而不同于天然存在的多肽。这些包括天然和诱导的遗传变异(例如，由辐射或暴露于乙甲基硫酸盐的随机突变或由sambrook,fritsch和maniatis,molecular cloning:a laboratory manual(2d ed.),csh press,1989或ausubel等人,上文所述的位点特异性突变引起)。还包括环化肽、分子和类似物，其包含l-氨基酸以外的残基，例如d-氨基酸或非天然存在或合成氨基酸，例如β或γ氨基酸。
[0299]
除了全长多肽外，本公开主题还提供本文公开的任何一种多肽或肽结构域的片段。如本文所用，术语“片段”是指至少5、10、13或15个氨基酸。在某些实施方式中，片段包含至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸或至少50个连续氨基酸。在某些实施方式中，片段包含至少60至80、100、200、300或更多连续氨基酸。片段可以通过本领域技术人员已知的方法产生，或者可以通过正常蛋白质处理产生(例如，从新生多肽中去除生物活性不需要的氨基酸，或者通过选择性mrna剪接或选择性蛋白质处理事件去除氨基酸)。
[0300]
非蛋白质类似物具有设计用于模拟本文所公开蛋白质(例如显性负性fas多肽)的功能活性的化学结构。这种类似物可超过原始多肽的生理活性。类似物设计的方法在本领域是众所周知的，并且可以根据这些方法通过修饰化学结构来进行类似物的合成，使得所得类似物在免疫应答细胞中表达时增加原始多肽的抗赘生物活性。这些化学修饰包括但不限于取代可替代的r基团和改变参考多肽特定碳原子的饱和度。在某些实施方式中，蛋白质类似物对体内降解具有抗性，施用后产生更持久的治疗效果。用于测量功能活性的测定包括但不限于以下实施例中所述的那些。
[0301]
7、给药
[0302]
本公开的细胞或包含其的组合物可以系统地或直接提供给受试者，用于诱导和/或增强对抗原的免疫应答和/或治疗和/或预防赘生物和/或病原体感染。在某些实施方式中，将本公开的细胞或包含其的组合物直接注射到目的器官(例如，受赘生物影响的器官)
中。或者，将本公开的细胞或包含其的组合物间接提供给目的器官，例如通过给药进入循环系统(例如，肿瘤脉管系统)。可在施用细胞或组合物之前、期间或之后提供扩增剂和分化剂，以在体外或体内增加t细胞或nk细胞的产生。
[0303]
本公开的细胞可以在任何生理上可接受的载体中施用，通常是血管内施用，尽管它们也可以被引入骨骼或其他方便的部位，在这些部位细胞可以找到合适的再生和分化部位(例如胸腺)。通常，至少施用约1
×
105个细胞，最终达到约1
×
10
10
个或更多。本公开的细胞可以包含纯化的细胞群体。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法，例如荧光激活细胞分选(facs)，轻松确定本公开的细胞在群体中的百分比。包含本公开细胞的群体中的适当纯度范围为约50％至约55％、约5％至约60％和约65％至约70％。在某些实施方式中，纯度为约70％至约75％、约75％至约80％或约80％至约85％。在某些实施方式中，纯度为约85％至约90％、约90％至约95％和约95％至约100％。本领域技术人员可以容易地调整剂量(例如，纯度降低可能需要增加剂量)。可以通过注射、导管等引入细胞。
[0304]
本公开的组合物可以是包含本公开的细胞或其祖细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。给药可以是自体或异体。例如，可以从一个受试者获得细胞或祖细胞，并将其施用到同一受试者或不同的兼容受试者。外周血源性细胞或其子代(例如，体内、离体或体外衍生)可通过局部注射进行给药，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉注射或肠外给药。当施用本公开的治疗组合物时，可以将其配制成单位剂量的可注射形式(溶剂、悬浮剂、乳剂)。
[0305]
8、剂型
[0306]
包含本公开细胞的组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮剂、乳剂、分散剂或粘性组合物，其可以缓冲到选定的ph值。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物在某种程度上更便于施用，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供更长的与特定组织的接触时间。液体或粘性组合物可以包括载体，其可为包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、及其适当混合物的溶剂或分散介质。
[0307]
根据需要，将经遗传修饰的免疫应答细胞加入含有不同量的其他成分的所需量的适当溶剂中，即可制备无菌注射溶液。这种组合物可与适当的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物也可以冻干。组合物可包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、矫味剂、着色剂等，这取决于给药途径和所需制剂。可参考标准教科书，如1985年第17版“remington’spharmaceutical science”，并入本文以供参考，以制备合适的制剂，而无需过度实验。
[0308]
可以添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物的作用。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本公开主题，所使用的任何载体、稀释剂或添加剂必须与经遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞相容。
[0309]
组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。可使用氯化钠或其他医药上可接受的试剂(例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶
质)实现组合物所需的等渗性。氯化钠尤其适用于含有钠离子的缓冲液。
[0310]
如果需要，可以使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度保持在所选水平。例如，甲基纤维素易于获得且经济，且易于使用。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度取决于所选的试剂。重要的一点是使用能够达到所选粘度的量。显然，合适载体和其他添加剂的选择将取决于具体的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液、悬浮剂、胶凝剂或其他液体形式，例如延时释放形式或液体填充形式)。
[0311]
待给药的细胞数量因待治疗的受试者而异。在一个实施方式中，向人类受试者施用约104个至约10
10
个之间、约105个至约109个之间、或约106个至约108个之间的本公开的细胞。更有效的细胞可以以更小的数量施用。在某些实施方式中，向人类受试者施用约1
×
108个、约2
×
108个、约3
×
108个、约4
×
108个、或约5
×
108个本公开的细胞。有效剂量的精确确定可以基于每个受试者的个体因素，包括他们的大小、年龄、性别、体重和特定受试者的状况。本领域技术人员可以根据本公开和本领域知识容易地确定剂量。
[0312]
本领域技术人员可以容易地确定组合物中并以方法施用的细胞和可选添加剂、载体和/或载体的数量。通常，任何添加剂(除活性细胞和/或试剂外)以0.001至50％(重量)的磷酸盐缓冲盐水溶液的量存在，并且活性成分以微克至毫克的数量级存在，例如约0.0001至约5wt％、约0.0001至约1wt％、约0.0001至约0.05wt％、或约0.001至约20wt％、约0.01至约10wt％、或约0.05至约5wt％。对于要给动物或人施用的任何组合物，可以确定以下内容：毒性，例如通过在适当的动物模型(例如啮齿动物，例如小鼠)中测定致死剂量(ld)和ld50；引发适当响应的组合物的剂量、其中成分的浓度和施用组合物的时间。这种测定不需要根据本领域技术人员、本公开和本文引用的文件的知识进行过度实验。而且，连续给药的时间可以在没有过度实验的情况下确定。
[0313]
9、治疗方法
[0314]
本公开主题提供了用于诱导和/或增加需要免疫应答的受试者的免疫应答的方法。本公开的细胞及包含其的组合物可用于治疗和/或预防受试者的赘生物。本公开的细胞及包含其的组合物可用于延长患有赘生物的受试者的生存期。本公开的细胞及包含其的组合物也可用于治疗和/或预防受试者的赘生物。本公开的细胞及包含其的组合物也可用于减轻受试者的肿瘤负荷。本公开的细胞及包含其的组合物还可用于治疗和/或预防受试者(例如免疫低下的人受试者)中的病原体感染或其他感染性疾病。这种方法包括以有效量施用本公开的细胞或包含其的组合物(例如，药物组合物)以实现预期效果，无论是缓解现有状况还是防止复发。对于治疗，给药量是有效产生预期效果的量。有效量可以在一次或一系列施用中提供。有效量可通过推注或持续灌注提供。
[0315]
对于使用抗原特异性t细胞的过继免疫治疗，通常输注约10
6-10
11
(例如约109)范围内的细胞剂量。在向宿主施用本公开的细胞并随后分化后，诱导特异性针对特定抗原的t细胞。经修饰的细胞可通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉注射、皮下注射、节内注射、肿瘤内注射、鞘内注射、胸膜内注射、腹腔注射、髓内注射以及直接施用到胸腺。
[0316]
本公开主题提供了治疗和/或预防受试者赘生物的方法。在某些实施方式中，该方法包括向患有赘生物的受试者施用有效量的本公开的细胞或包含其的组合物。
[0317]
在某些实施方式中，赘生物是恶性赘生物。在某些实施方式中，赘生物或肿瘤是相对于匹配的正常来源组织具有增加的faslg rna表达的癌症。见yamamoto等人,j clin invest.(2019)；129(4):1551-1565，其并入本文以供参考。
[0318]
赘生物(例如恶性赘生物)的非限制性实例包括血癌(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤、喉癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和各种癌(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。合适的癌还包括肿瘤学领域的任何已知癌，包括但不限于星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(pnet)、软骨肉瘤、成骨肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌及其肝转移瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝癌、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺癌、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、睾丸肿瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、waldenstrom巨球蛋白血症和重链疾病、乳腺肿瘤(如导管腺癌和小叶腺癌)、宫颈鳞癌和腺癌、子宫和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱移行性鳞状细胞癌、b和t细胞淋巴瘤(结节性和弥漫性)浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑色素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。在某些实施方式中，赘生物(例如恶性赘生物)选自血癌(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤和喉癌。在某些实施方式中，本公开的免疫应答细胞及包含其的组合物可用于治疗和/或预防血癌(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)或卵巢癌，这些肿瘤不适合常规治疗干预。
[0319]
在某些实施方式中，赘生物是实体癌或实体瘤。在某些实施方式中，实体瘤或实体癌选自胶质母细胞瘤、前列腺腺癌、肾乳头状细胞癌、肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、直肠腺癌、结肠癌、食管癌、子宫体子宫内膜样癌、乳腺癌、皮肤黑色素瘤、肺腺癌、胃腺癌、宫颈癌和子宫内膜癌、肾透明细胞癌、睾丸生殖细胞瘤和侵袭性b细胞淋巴瘤。
[0320]
受试者可能患有晚期疾病，在这种情况下，治疗目标可以包括缓解或逆转疾病进展和/或减轻副作用。受试者可以具有已经对其进行过治疗的病史，在这种情况下，治疗目标通常包括降低或延迟复发风险。
[0321]
用于治疗的合适的人受试者通常包括可以通过临床标准区分的两个治疗组。患有“晚期疾病”或“高肿瘤负荷”的受试者是携带临床上可测量肿瘤的受试者。临床上可测量的肿瘤是可以根据肿瘤肿块检测的肿瘤(例如，通过触诊、cat扫描、超声检查、乳房x线影像或x射线；单独的阳性生化或组织病理学标志物不足以识别该人群)。向这些受试者施用药物组合物，以引发抗肿瘤反应，目的在于减轻其状况。理想地，结果是减小了肿瘤块，但任何临床改善均可构成获益。临床改善包括降低风险或进展速度或减少肿瘤病理后果。
[0322]
第二组合适的受试者在本领域中被称为“佐剂组”这些个体有赘生物病史，但对另一种治疗方式有反应。先前的疗法可以包括，但不限于，手术切除、放疗和传统化疗。结果，这些个体没有临床上可测量的肿瘤。然而，他们被怀疑有在原发肿瘤部位附近的或转移的疾病进展风险。该组可以进一步细分成高风险和低风险的个体。根据在初始治疗之前或之
后观察到的特征进行细分。这些特征在临床技术中已知，并适合于每种不同的赘生物。高危亚组的典型特征是肿瘤侵犯邻近组织，或显示淋巴结受累。
[0323]
另一组具有赘生物的遗传易感性，但尚未证明赘生物的临床症状。例如，检测出与乳腺癌相关的基因突变呈阳性但仍处于育龄期的女性可以希望接受本文所述的一个或多个免疫应答细胞进行预防性治疗，以防止赘生物的发生，直到其适合进行预防性手术。
[0324]
由于与肿瘤抗原结合的抗原识别受体和显性负性fas多肽(例如外源性fas多肽)表面表达的结果，增强了包括抗原识别受体和显性负性fas多肽的细胞的抗肿瘤效果，过继转移的t或nk细胞在肿瘤部位被赋予增强的和选择性的溶细胞活性。此外，在其定位于肿瘤或病毒感染及其增殖之后，t细胞将肿瘤或病毒感染位点转变成高传导性环境，以用于范围广泛的参与生理抗肿瘤或抗病毒应答的多种免疫细胞(肿瘤浸润淋巴细胞、nk细胞、nkt细胞、树突状细胞和巨噬细胞)。
[0325]
此外，本公开主题提供了用于治疗和/或预防受试者(例如免疫受损受试者)中的病原体感染(例如，病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染或原生动物感染)的方法。该方法可包括向患有病原体感染的受试者施用有效量的本公开的细胞或包含其的组合物。易受治疗的典型病毒感染包括但不限于巨细胞病毒(cmv)、epstein-barr病毒(ebv)、人免疫缺陷病毒(hiv)和流感病毒感染。
[0326]
可以对本公开的细胞(例如t细胞)进行进一步修饰，以避免或最小化免疫并发症(称为“恶性t细胞转化”)的风险，例如移植物抗宿主病(gvhd)，或者当健康组织表达与肿瘤细胞相同的靶抗原时，导致类似于gvhd的结果。这个问题的一个潜在解决方案是将自杀基因工程到本公开的细胞中。合适的自杀基因包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、诱导型半胱天冬酶9自杀基因(icasp-9)和截断型人表皮生长因子受体(egfrt)多肽。在某些实施方式中，自杀基因是egfrt多肽。egfrt多肽可通过施用抗egfr单克隆抗体(例如西妥昔单抗)实现t细胞消除。egfrt可以共价连接到抗原识别受体的上游。自杀基因可以包含在包含编码本公开的car的核酸的载体中。这样，在恶性t细胞转化(例如gvhd)期间施用旨在激活自杀基因的前药(例如，可激活icasp-9的前药(例如，ap1903)可触发表达自杀基因激活受体(例如，表达car)的t细胞中的凋亡。将自杀基因掺入本公开的抗原识别受体(例如car)中可提高安全性，能够在很短的时间内消除大多数表达受体(例如表达car)的t细胞。本公开的与自杀基因结合的细胞(例如，t细胞)可以在t细胞输注后的给定时间点预先消除，或在最早的毒性迹象时消除。
[0327]
10、试剂盒
[0328]
本公开主题提供用于诱导和/或增强免疫应答和/或治疗和/或预防受试者中的赘生物或病原体感染的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包含有效量的本公开的细胞或包含其的药物组合物。在某些实施方式中，试剂盒包括无菌容器；这种容器可以是盒、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合容纳药物的材料制成。在某些实施方式中，试剂盒包括编码针对感兴趣抗原的抗原识别受体(例如，car或tcr)的核酸分子和编码显性负性fas多肽的可表达形式的核酸分子，其可选择性地存在于一个或多个载体上。
[0329]
如果需要，将细胞和/或核酸分子与用于向患有或有可能发展赘生物、病原体或免疫障碍的受试者施用细胞或核酸分子的说明书一起提供。说明书通常包括有关使用该组合
物治疗和/或预防赘生物或病原体感染的信息。在某些实施方式中，说明书包括以下至少一项：治疗剂的描述；治疗或预防肿瘤、病原体感染或免疫疾病或其症状的剂量表和给药；注意事项；警告；适应症；禁忌症；过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文件。说明书可以直接打印在容器上(如有)，或作为标签应用于容器，或作为容器内或随容器提供的单独纸张、小册子、卡片或文件夹。
[0330]
实施例
[0331]
除非另有说明，否则本公开的实践采用了分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术完全在本领域技术人员的能力范围内。这些技术在文献中得到了充分解释，如“molecular cloning:a laboratory manual”,第二版(sambrook,1989)；“oligonucleotide synthesis”(gait,1984)；“animal cell culture”(freshney,1987)；“methods in enzymology”“handbook of experimental immunology”(weir,1996)；”gene transfer vectors for mammalian cells”(miller和calos,1987)；“current protocols in molecular biology”(ausubel,1987)；“pcr:the polymerase chain reaction”,(mullis,1994)；“current protocols in immunology”(coligan,1991)。这些技术适用于本文公开的多核苷酸和多肽的产生，因此，在制造和实施本公开主题时可以考虑这些技术。对于具体实施方式的具体可用的技术将在下面的部分中讨论。
[0332]
提出以下实施例是为了向本领域的普通技术人员提供关于如何制造和使用本公开的细胞和组合物的完整公开和描述，并且无意限制发明人认为其发明的范围。
[0333]
实施例1
–
用n端突变fas dnr工程化的t细胞
[0334]
方法和材料
[0335]
细胞培养.jurkat76和platinum-gp逆转录病毒包装细胞(cell biolabs)在补充有10％胎牛血清、10mm hepes(gibco)和25单位/ml penstrep(gibco)的rpmi中培养。原代t细胞在补充有10％热灭活人血清、25mm hepes(gibco)和50单位/ml penstrep(gibco)的rpmi中培养。fas crispr编辑的jurkat细胞的单克隆选择是通过在96孔板上接种100μl细胞/孔，密度为0.5细胞/孔来完成的。细胞培养3周，流式细胞术检测fas表面表达。
[0336]
人t细胞的分离和扩增.纽约血液中心的健康捐赠者提供了血沉棕黄层。采用淋巴细胞分离培养基(corning)通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(pbmc)。使用easysep人cd8+t细胞分离试剂盒(stemcell)分离cd8+t细胞。在5μg/ml抗-cd3(miltenyi biotec)抗体涂层板和1μg/ml可溶性抗-cd28(miltenyi biotec)上激活cd8+t细胞。对于病毒转导，t细胞在转导前用50iu/ml的il-2(peprotech)处理2天。
[0337]
质粒设计和病毒转导.所有用于病毒包装的质粒均基于sfgγ逆转录病毒载体设计。使用猫科动物内源性逆转录病毒包膜rd114与sfgγ载体共转染到platinum-gp细胞中。lipofectamine(脂质体)3000(thermofisher)用于platinum-gp细胞共转染。在retronectin(纤维连接蛋白)(takara)涂层板上，用病毒上清液转导jurkat细胞和原代t细胞。简言之，在4℃下用20ug/ml的retronectin包被平板过夜，然后在室温下用含2％fbs的pbs封闭30分钟。用pbs洗涤平板并装载病毒上清液。在2000g、32℃下离心2小时。吸取上清液，将细胞装入每个孔中。在1200rpm、32℃下再次将板离心5分钟，并在37℃下孵育2天。
[0338]
crispr编辑.靶向fas第2外显子的单一的向导rna(sgrna)由synthego合成，20nt
靶向序列为：gugacugacaucaacuccaa(seq id no：66)(化学修饰)。简言之，在室温下将2μl 50μm sgrna与1μl 20μm重组cas9蛋白(synthego)混合10分钟。将100万jurkat细胞重新悬浮在17μl nucleofector solution(核酸转染溶液)p3(lonza)中，然后与sgrna/cas9复合物混合。电穿孔是使用带有axp-1004 16孔条的lonza 4d核酸转染仪(lonza)完成的。电穿孔程序设置如下：细胞类型：t细胞人stim，使用代码ec 115。在电穿孔后第4天，通过流式细胞术测量crispr编辑后fas的表达。
[0339]
sanger测序和序列分析.通过使用pcr引物：5
’‑
tctatcattcatggtgctgtttc-3’(seq id no：67)和5
’‑
aggggaaccaaaaactgtaaaa-3’(seq id no：68)分析pcr扩增物的测序数据，确认crispr编辑效率。pcr产物使用kod热启动master mix(emd millipore)。pcr扩增纯化和测序服务由genwiz完成。使用ice测序软件(synthego)将crispr编辑的序列与野生型对照序列进行比较。
[0340]
流式细胞术和细胞内染色.用于流式细胞术的共轭抗体包括brilliant violet 421
tm
抗-人egfr(ay13，biolegend)、pe/cy5抗-人cd95 fas(dx2，biolegend)、apc/cyanine7抗-人cd95 fas(dx2，biolegend)、percp/cyanine5.5抗-人tnf-α(mab11，biolegend)。对于靶向ny-eso的tcr，使用pe抗-tcr vβ13.1(immu 222，beckman coulter)。对于car染色，使用alexa fluor 647affinipure f(ab
′
)2片段山羊抗-小鼠igg，f(ab
′
)2抗体(jackson immunoresearch)。对于细胞活力，使用live/dead
tm
可固定的aqua死细胞染色试剂盒(thermofisher)。对于细胞内染色，按照商业标准方案使用cytofix/cytoperm
tm
固定/渗透溶液试剂盒(bd biosciences)。
[0341]
fasl凋亡测定.通过亮氨酸拉链基序寡聚的可溶性fasl形式(fasl-lz)以100ng/ml用于所有凋亡测定。在37℃的指定时间点用fasl-lz处理细胞。清洗细胞并对其表面抗体进行染色。在37℃将细胞用cellevent
tm
半胱天冬酶-3/7绿色检测试剂(thermofisher)在facs缓冲液中染色25分钟，并洗涤两次。然后在室温下将细胞用apc膜联蛋白v(biolegend)在膜联蛋白v结合缓冲液(biolegend)中染色25分钟。将细胞洗涤两次并重新悬浮在膜联蛋白v结合缓冲液中进行流式细胞术。
[0342]
统计分析.所有统计分析均使用prism 7(graphpad)软件进行。没有使用统计方法来预先确定样品量。所有分析均在三份样品上进行。通过配对样品的配对student t检验计算两组之间的统计比较。p《0.05被认为是统计学上(statically)重要的。
[0343]
结果
[0344]
评估了同时使用fas-dnr和car工程化的t细胞的功能性。生成了人fas dnr构建体的两个版本(见图1a)：模块版本和连接版本。图1b证明包含fasdnr构建体的t细胞的活性。如图1b所示，1928ζ1xxcar靶向cd19
+
恶性细胞。fasdnr可以保护包含car和fasdnr的t细胞免受fasl诱导的凋亡。当与西妥昔单抗施用时，egfrt可以被靶向，诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性。
[0345]
人源性jurkat细胞单独用egfrt或egfrt/fasdnr经逆转录病毒转导。在转导后第2天对细胞进行染色。如图1c所示，fasdnr和egfrt在转导细胞中的表达比例约为1:1。
[0346]
原代人cd8
+
t细胞用靶向ny-eso抗原的tcr共转导。在细胞内细胞因子染色之前，将带有或不带有fasdnr的细胞暴露于抗原6小时。tnfα的细胞内染色结果在图1d中显示。如图1d所示，fasdnr转导的cd8
+
t细胞中抗原特异性tnfα的表达并不低于未经fasdnr修饰的
对照细胞。这一发现表明fasdnr不会减少抗原激活的t细胞中tnfα的分泌。
[0347]
原代人cd8
+
t细胞在指定时间点暴露于100ng/ml的fasl-亮氨酸拉链(fasl-lz)。活化的半胱天冬酶3/7和膜联蛋白v被用作早期凋亡标志物。结果在图1e中显示。如图1e所示，在没有fasdnr的细胞中，fasl刺激诱导70％的细胞凋亡，而在fasdnr阳性细胞中，发生凋亡的细胞少于20％。这一结果证实fasdnr保护人cd8
+
t细胞免受fasl诱导的凋亡信号传导。
[0348]
总之，fasdnr保护细胞免受fasl诱导的凋亡，并且不影响t细胞靶向肿瘤的功能。
[0349]
使用crispr/cas9方法，在fas的n端区域进行一系列突变，并鉴定出三个主要的不同t细胞克隆：克隆15，具有野生型fas第2外显子序列(具有seq id no:10所示氨基酸序列)；克隆17，与野生型fas(例如克隆15)相比，在n端区域缺失n31和s32；和克隆19，具有双等位基因19个碱基移码缺失。见图2c。
[0350]
用重组cas9蛋白电穿孔jurkat细胞，该cas9蛋白负载有靶向第2外显子中人fas基因的合成向导(sg)rna。在电穿孔后单细胞克隆约3周后，在编辑的t细胞上测量fas表面表达。结果在图2a中显示。如图2a所示，克隆#15(灰色)代表未编辑的野生型fas细胞表面表达。克隆#17(透明)显示fas表达水平高于野生型，而克隆#19(黑色)显示fas表达水平最低。图2b显示图2a的三份样品中平均fas表达水平。克隆#17显示fas表达显著高于克隆#15。
[0351]
综上所述，克隆15、17和19显示不同的fas表达水平，例如克隆17的fas表达水平高于克隆15和克隆19的fas表达水平。
[0352]
接着，评估包含克隆15、17或19的jurket细胞对fasl刺激的应答性。结果在图3a和3b中显示。如图3a和3b所示，克隆17显示对fasl刺激的敏感应答。
[0353]
将jurkat细胞在指定的时间点暴露于100ng/ml的fasl-lz。评估细胞凋亡。结果在图4a和4b中显示。如图4a和4b所示，具有未编辑野生型fas的克隆#15在fasl刺激后发生凋亡。敲除fas的克隆#19对凋亡具有抗性。此外，fasdnr转导的克隆#19细胞也能保护免受fasl诱导的凋亡。
[0354]
总之，用敲除fas的克隆#19和fasdnr转导的细胞被保护免受fasl诱导的凋亡。
[0355]
如图5所示，制备许多n端突变体。fas del32 dnr由第32位氨基酸的缺失和第230-314位氨基酸的缺失组成，并由seq id no:16所示氨基酸序列组成。fas del31-32 dnr由第31和32位氨基酸的缺失和第230-314位氨基酸的缺失组成，并由seq id no:18所示氨基酸序列组成。fas del32-33 dnr由第32-33位氨基酸的缺失和第230-314位氨基酸的缺失组成，并由seq id no:20所示氨基酸序列组成。fas s32a dnr由第32位氨基酸的缺失和第230-314位氨基酸的缺失组成，并由seq id no:24所示氨基酸序列组成。
[0356]
fas del32由下文提供的seq id no:56所示氨基酸序列组成。
[0357][0358]
编码seq id no:56的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:57中。
[0359][0360]
fas del31-32由下文提供的seq id no:58所示氨基酸序列组成。
[0361][0362]
编码seq id no:58的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:59中。
[0363][0364]
fas del32-33由下文提供的seq id no:60所示氨基酸序列组成。
[0365][0366]
编码seq id no:60的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:61中。
[0367][0368]
fas s32a由下文提供的seq id no:62所示氨基酸序列组成。
[0369][0370]
编码seq id no:62的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:63中。
[0371][0372]
还制备了fas del33-34(图5中未显示)。fas del33-34由下文提供的seq id no:64所示氨基酸序列组成。
[0373][0374]
编码seq id no:64的氨基酸序列的示例性核苷酸序列示于下文提供的seq id no:65中。
[0375][0376]
评估了具有各种fas构建体的克隆#19敲除fas的jurkat细胞的转导效率。用含有不同n端突变体的fas或fasdnr转导克隆#19敲除fas的jurkat细胞，并在试验转导后第3天进行fas表达染色。结果在图6a和6b中显示。如图6a和6b所示，fas n端突变体提高了fas转导效率。
[0377]
实施例2
–
表达具有s32或n31s32缺失的fasdnr的细胞对fasl诱导的凋亡的敏感性
[0378]
方法和材料
[0379]
人源性jurkat细胞用具有或不具有fas突变的egfrt/1928z经逆转录病毒转导。在转导后第2天，使用干细胞easysep人pe阳性选择试剂盒ii和pe抗-人egfr抗体(biolegend，克隆ay13)对细胞分离egfrt阳性群体。在转导后第8天，在37℃下在设计时间点使用fasl-lz(100ng/ml)进行凋亡测定。用facs缓冲液洗涤细胞两次，并对表面抗体进行染色。在37℃将细胞用celleventtm半胱天冬酶-3/7绿色检测试剂(thermofisher)在facs缓冲液中染色25分钟，并洗涤两次。然后在室温下将细胞用apc膜联蛋白v(biolegend)在膜联蛋白v结合缓冲液(biolegend)中染色25分钟。将细胞洗涤两次并重新悬浮在膜联蛋白v结合缓冲液中进行流式细胞术。
[0380]
结果
[0381]
在转导后第8天用fasl处理jurkat细胞。如图7a和7b所示，表达fasd31dnr的细胞和表达fasd3132dnr的细胞比表达fasdnr且无n端突变的细胞更好地被保护免受fasl诱导的凋亡(通过活性半胱天冬酶3/7和膜联蛋白v双阳性细胞百分比表示)。p值由未配对的student t检验确定(**p《0.01，***p《0.001)。
[0382]
实施例3
–
用n端突变的fas-dnr工程化的人自然杀伤细胞
[0383]
检查在人nk细胞中表达n端突变fas dnr的效用和应用。通过磁珠从人脐血中负性分离人nk细胞。将nk细胞与辐照k562(克隆9)饲养细胞以1:2的比例(nk细胞与饲养细胞)共培养。激活后添加补充有200iu/ml重组人il-2的培养基，每隔一天更换一次。在激活后第5天，通过流式细胞术测定fas表达。激活后，fas在人nk细胞中表达上调(见图8)。静息和激活后三种独立培养物的结果显示为柱状图+/-sem。***＝p《0.001。
[0384]
检查用car、car-fas dnr或car-n端突变体fas dnr转导的人nk细胞中的fas表达水平。n端突变体fas dnr(设计为“fasdnr del31-32”或“fas del31-32 dnr”)由第31和32位氨基酸的缺失和第230-314位氨基酸的缺失组成，并由seq id no:18所示氨基酸序列组成。5天活化的人nk细胞用dmem培养基(未转化对照)或病毒上清液在20ug/ml的
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本公开的主题的实施方式
[0467]
从前文描述中将显而易见的是，可以对本公开的主题进行变化和修改以将其应用于各种用途和条件。这样的实施方式也在所附权利要求的范围内。
[0468]
本文所述任意变量定义中的要素列表包括将变量定义成列出的要素的任何单个要素或组合(或子组合)。本文所述实施方式包括将该实施方式作为任何单一实施方式或与任何其他实施方式或其部分相结合。
[0469]
本说明书中提到的所有专利和出版物都以相同的程度并入本文以供参考，就如同每个独立的专利和出版物都被具体地和单独地指出以并入而供参考一样。

技术特征：
id no:18所示氨基酸序列或由其组成。20.根据权利要求1-11中任一项所述的显性负性fas多肽，其中所述第二修饰包含人fas的氨基酸32和33的缺失或由其组成。21.根据权利要求20所述的显性负性fas多肽，其中所述第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成。22.根据权利要求21所述的显性负性fas多肽，其中所述显性负性fas多肽包含与seq id no:20所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的氨基酸序列或由其组成。23.根据权利要求21或22所述的显性负性fas多肽，其中所述显性负性fas多肽包含seq id no:20所示氨基酸序列或由其组成。24.根据权利要求1-9中任一项所述的显性负性fas多肽，其中所述第二修饰包含人fas的第33位的修饰或由其组成。25.根据权利要求24所述的显性负性fas多肽，其中所述第二修饰包含人fas的氨基酸33和34的缺失或由其组成。26.根据权利要求25所述的显性负性fas多肽，其中所述第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成。27.根据权利要求26所述的显性负性fas多肽，其中所述显性负性fas多肽包含与seq id no:22所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的氨基酸序列或由其组成。28.根据权利要求26或27所述的显性负性fas多肽，其中所述显性负性fas多肽包含seq id no:22所示氨基酸序列或由其组成。29.根据权利要求1-10中任一项所述的显性负性fas多肽，其中所述第二修饰包含人fas的第32位的点突变或由其组成。30.根据权利要求1-10中任一项所述的显性负性fas多肽，其中所述第二修饰包含人fas的点突变s32a或由其组成。31.根据权利要求30所述的显性负性fas多肽，其中所述第一修饰由人fas的氨基酸230-314的缺失组成。32.根据权利要求31所述的显性负性fas多肽，其中所述显性负性fas多肽包含与seq id no:24所示氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的氨基酸序列或由其组成。33.根据权利要求31或32所述的显性负性fas多肽，其中所述显性负性fas多肽包含seq id no:24所示氨基酸序列或由其组成。34.根据权利要求1-33中任一项所述的显性负性fas多肽，其中所述人fas包含seq id no:10所示氨基酸序列或由其组成。35.根据权利要求1-34中任一项所述的显性负性fas多肽，其中所述第一修饰防止所述显性负性fas多肽与fadd多肽之间的结合。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的显性负性fas多肽，其中所述第二修饰增加(a)所述显性负性fas多肽由细胞的表面表达，和/或(b)所述显性负性fas多肽向细胞内的转导效率，和/或(c)使所述显性负性fas多肽免受fasl诱导的凋亡的保护作用。37.一种细胞，其包含a)与抗原结合的抗原识别受体，以及b)根据权利要求1-36中任一项所述的显性负性fas多肽。38.根据权利要求37所述的细胞，其中所述显性负性fas多肽增强细胞持久性。39.根据权利要求37或38所述的细胞，其中所述显性负性fas多肽减少所述细胞的凋亡或无反应力。40.根据权利要求37-39中任一项所述的细胞，其中所述抗原识别受体为外源性或内源性。41.根据权利要求37-40中任一项所述的细胞，其中所述抗原识别受体从载体中表达。42.根据权利要求37-41中任一项所述的细胞，其中所述显性负性fas多肽从载体中表达。43.根据权利要求37-42中任一项所述的细胞，其中所述细胞为免疫应答细胞。44.根据权利要求37-43中任一项所述的细胞，其中所述细胞为淋巴谱系的细胞或骨髓谱系的细胞。45.根据权利要求37-44中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自t细胞、自然杀伤(nk)细胞、b细胞、单核细胞和巨噬细胞。46.根据权利要求37-45中任一项所述的细胞，其中所述细胞为nk细胞。47.根据权利要求37-45中任一项所述的细胞，其中所述细胞为t细胞。48.根据权利要求47所述的细胞，其中所述t细胞为细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞(t
reg
)或自然杀伤t(nkt)细胞。49.根据权利要求37-48中任一项所述的细胞，其中所述细胞对预期受体是自体或同种异体的。50.根据权利要求37-49中任一项所述的细胞，其中所述抗原为肿瘤抗原或病原体抗原。51.根据权利要求37-50中任一项所述的细胞，其中所述抗原为肿瘤抗原。52.根据权利要求50或51所述的细胞，其中所述肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关抗原(taa)。53.根据权利要求50-52中任一项所述的细胞，其中所述肿瘤抗原选自：cd19、muc16、muc1、caix、cea、cd8、cd7、cd10、cd20、cd22、cd30、cll1、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd74、cd133、cd138、egp-2、egp-40、epcam、erb-b2、erb-b3、erb-b4、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-α、gd2、gd3、her-2、htert、il-13r-α2、κ-轻链、kdr、突变体kras、突变体hras、突变体pik3ca、突变体idh、突变体p53、突变体nras、ley、l1细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、magea3、ct83、p53、mart1、gp100、蛋白酶3(pr1)、酪氨酸酶、生存素、htert、epha2、nkg2d配体、ny-eso-1、癌胚抗原(h5t4)、psca、psma、ror1、tag-72、vegf-r2、wt-1、bcma、cd123、cd44v6、nkcs1、egf1r、egfr-viii、cd99、cd70、adgre2、ccr1、lilrb2、prame、hpv e6癌蛋白、hpv e7癌蛋白和erbb。54.根据权利要求53所述的细胞，其中所述抗原为cd19。
55.根据权利要求37-50中任一项所述的细胞，其中所述抗原为病原体相关抗原。56.根据权利要求55所述的细胞，其中所述病原体相关抗原是巨细胞病毒(cmv)中存在的病毒抗原、epstein-barr病毒(ebv)中存在的病毒抗原、人免疫缺陷病毒(hiv)中存在的病毒抗原或流感病毒中存在的病毒抗原。57.根据权利要求37-56中任一项所述的细胞，其中所述抗原识别受体为t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。58.根据权利要求37-57中任一项所述的细胞，其中所述抗原识别受体为识别病原体相关抗原的tcr，且所述细胞为病原体特异性t细胞。59.根据权利要求37-58中任一项所述的细胞，其中所述抗原识别受体是识别肿瘤抗原的tcr，且所述细胞是肿瘤特异性t细胞。60.根据权利要求56-59中任一项所述的细胞，其中所述tcr为内源性tcr或重组tcr。61.根据权利要求37-57中任一项所述的细胞，其中所述抗原识别受体为car。62.根据权利要求61所述的细胞，其中所述car包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域及细胞内信号传导结构域。63.根据权利要求62所述的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含天然cd3ζ多肽。64.根据权利要求62所述的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含经修饰的cd3ζ多肽。65.根据权利要求64所述的细胞，其中所述经修饰的cd3ζ多肽包含天然itam1、由两个功能失去突变组成的itam2变体及由两个功能失去突变组成的itam3。66.根据权利要求62-65中任一项所述的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域还包含至少一个共刺激信号传导区。67.根据权利要求66所述的细胞，其中所述至少一个共刺激信号传导区包含cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、或其组合。68.根据权利要求66或67所述的细胞，其中所述至少一个共刺激信号传导区包含cd28多肽。69.根据权利要求37-68中任一项所述的细胞，其还包含自杀基因。70.根据权利要求69所述的细胞，其中所述自杀基因为单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、诱导型半胱天冬酶9自杀基因(icasp-9)或截断型人表皮生长因子受体(egfrt)多肽。71.一种核酸组合物，其包含(a)编码与抗原结合的抗原识别受体的第一核酸序列，和(b)编码根据权利要求1-36中任一项所述的显性负性fas多肽的第二核酸序列。72.根据权利要求71所述的核酸组合物，其中所述第一和第二核酸序列中的一个或两个可操作地连接到启动子元件。73.根据权利要求71或72所述的核酸组合物，其中所述第一和第二核酸序列中的一个或两个存在于载体上。74.根据权利要求73所述的核酸组合物，其中所述载体为逆转录病毒载体。75.根据权利要求73所述的核酸组合物，其中所述载体为慢病毒载体。76.一种细胞，其包含根据权利要求71-75中任一项所述的核酸组合物。77.一种载体，其包含根据权利要求71-75中任一项所述的核酸组合物。78.一种细胞，其包含根据权利要求77所述的载体。
79.一种药物组合物，其包含有效量的根据权利要求37-70、76和78中任一项所述的细胞和药学上可接受的赋形剂。80.根据权利要求79所述的药物组合物，其用于治疗和/或预防赘生物或病原体感染。81.一种诱导和/或增强对靶抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求37-70、76和78中任一项所述的细胞或根据权利要求79或80所述的药物组合物。82.一种降低受试者肿瘤负荷的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求37-70、76和78中任一项所述的细胞或根据权利要求79或80所述的药物组合物。83.根据权利要求82所述的方法，其中所述方法减少所述受试者中的肿瘤细胞数量、减小肿瘤大小和/或根除所述肿瘤。84.一种治疗和/或预防赘生物的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求37-70、76和78中任一项所述的细胞或根据权利要求79或80所述的药物组合物。85.一种延长患有赘生物的受试者生存期的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求37-70、76和78中任一项所述的细胞或根据权利要求79或80所述的药物组合物。86.根据权利要求84或85所述的方法，其中所述赘生物是恶性赘生物。87.根据权利要求82-86中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或赘生物选自b细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、非霍奇金淋巴瘤、髓系白血病和骨髓增生异常综合征(mds)。88.根据权利要求82-87中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或赘生物为实体瘤。89.根据权利要求88所述的方法，其中所述实体瘤是源自大脑、乳腺、肺、胃肠道(包含食道、胃、小肠、大肠和直肠)、胰腺、前列腺、软组织/骨、子宫、宫颈、卵巢、肾脏、皮肤、胸腺、睾丸、头颈或肝脏的肿瘤。90.一种预防和/或治疗受试者中病原体感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求37-70、76和78中任一项所述的细胞或根据权利要求79或80所述的药物组合物。91.根据权利要求90所述的方法，其中所述病原体选自能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原生动物。92.一种用于产生抗原特异性细胞的方法，所述方法包括将(a)编码与抗原结合的抗原识别受体的第一核酸序列；和(b)编码根据权利要求1-36中任一项所述的显性负性fas多肽的第二核酸序列引入细胞。93.根据权利要求92所述的方法，其中所述第一和第二核酸序列中的一个或两个可操作地连接到启动子元件。94.根据权利要求92或93所述的方法，其中所述第一和第二核酸序列中的一个或两个存在于载体上。95.根据权利要求94所述的方法，其中所述载体为逆转录病毒载体。96.一种试剂盒，其包含根据权利要求37-70、76和78中任一项所述的细胞、根据权利要求71-75中任一项所述的核酸组合物或根据权利要求77所述的载体。97.根据权利要求96所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于治疗和/或预防赘生物
或病原体感染的书面说明。

技术总结
本公开提供新型显性负性Fas多肽，其包含人Fas的细胞质结构域中的第一修饰和N端区域中的第二修饰。本公开还提供包含这种新型显性负性Fas多肽和抗原识别受体(例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR))的细胞。还提供该细胞用于治疗的用途，例如用于治疗肿瘤和病原体感染。感染。感染。


技术研发人员：C
受保护的技术使用者：斯隆-凯特琳癌症研究协会 癌症与相关疾病纪念医院
技术研发日：2021.01.06
技术公布日：2022/11/1