反应性偶联物的制作方法

1.本发明涉及用于治疗性抗体的化学修饰的化合物(下文有时称为“反应性偶联物”)。这些化合物能够在一个单一步骤中将有效负载区域选择性附接至抗体或抗体片段，从而产生修饰抗体或修饰抗体片段，该修饰抗体或修饰抗体片段可以用于诊断、监测、成像或治疗疾病。


背景技术：

2.传统的癌症治疗(例如，化学疗法)不仅是非常艰辛的(因为它们的毒性会引起严重的副作用)，而且也可能是非常偶然的，治疗对一个患者有效，而对另一个患者完全无效。因此，开发新的毒性更小和/或更有效的治疗是始终存在的需求，监测治疗效果的能力也是始终存在的需求，例如能够区分“应答者”和“非应答者”患者。
3.为了对这些需求进行应答，出现了称为抗体-药物偶联物(antibody-drug-conjugates，adc)的新型治疗剂。adc利用抗体(例如，单克隆抗体(monoclonal antibodies，mab))的靶向能力，将有效负载(例如，细胞毒素剂或标记剂)直接递送至癌细胞。癌细胞的靶向性能够使有效负载的治疗效果最大化，而使对健康细胞的毒性作用最小化。根据有效负载，adc可以实现各种作用，例如诊断、监测和/或治疗。
4.adc可以通过多种方法来制备。然而，大多数所述方法导致化学性质不同adc的异质混合物，该异质混合物具有不同有效负载(药物)抗体比率(payload(drug)antibody ratios，dar)和偶联位点。这种异质性会使制造复杂化，从而导致批次间(batch to batch)的高度变化性，并且有时会导致不可预测的安全性和功效。因此，可以制备得到均质混合物的方法(例如，区域选择性或位点特异性偶联方法)越来越受到关注。此类方法可以显着提高dar和有效负载(药物)结合位点的可预测性，并且可以用于简化具有更可预测的安全性或功效的、更明确的adc产品的开发和制造。
5.已经开发了几种方法来用于有效负载与抗体的区域特异性和位点特异性偶联。然而，通常已知的方法需要抗体的修饰/工程改造，例如通过掺入非天然氨基酸或通过修饰碳水化合物部分来进行修饰/工程改造。这种修饰可能负面地影响相应adc的治疗功效/安全性，例如，因为与抗体的活性、靶向、代谢和/或排泄、以及对抗体的免疫应答相关的不期望的影响。其他方法涉及多个步骤，例如wo2018/199337中列出的方法。这种多步骤方法可能成本高昂和/或费力，使其不太有吸引力，甚至不适合期望快速且简单的抗体修饰过程的应用(例如，用于护理点诊断应用)。
6.因此，仍然需要寻找用于有效负载与抗体或抗体片段的区域或位点特异性偶联的替代方法，特别是需要在此之前无需对抗体或抗体片段进行工程改造的方法。此外，需要寻找以尽可能少的步骤(优选在一个单一步骤)中制备抗体药物偶联物的方法。
7.鉴于上述情况，本发明的一个目的是提供化合物(反应性偶联物)，使得能够在一个单一步骤中将有效负载区域选择性偶联至抗体或抗体片段，而在此之前无需工程改造和/或修饰抗体或抗体片段。另一个目的是提供包含这种化合物的试剂盒。
8.本发明的又一个目的是提供一种用于制备修饰抗体或修饰抗体片段(例如，adc)的方法，该修饰抗体或修饰抗体片段可以在诊断、监测、成像或治疗疾病的方法中使用。


技术实现要素：

9.本发明提供了一种化合物，该化合物能够将有效负载区域选择性附接至抗体(例如，治疗性抗体)或任选掺入fc-融合蛋白中的抗体片段。这种区域选择性附接可以在一个单一步骤中完成。得到的修饰抗体或修饰抗体片段(例如，adc或抗体-放射性核素偶联物)可以在诊断、监测、成像或治疗疾病(特别是癌症)的方法中使用。
10.本发明的化合物(反应性偶联物)可以由下式(1)表示：
11.p-y-s-v
ꢀꢀ
(1)
12.其中，
13.p为有效负载；
14.y为能够与氨基酸(例如，赖氨酸或半胱氨酸)的侧链反应的反应性部分，优选为能够与赖氨酸的侧链反应的部分；
15.v为载体，该载体能够与抗体或其片段的可结晶片段(fragment crystallizable，fc)区域相互作用，该抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中；
16.s为具有长度z的间隔子，其中z为使得当载体v与抗体或其片段的fc区域相互作用时、反应性部分y能够在所述抗体或抗体片段上与氨基酸残基的侧链反应的长度。
17.本发明还涉及用于对抗体或抗体片段进行区域选择性修饰的试剂盒，该抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中，其中，所述试剂盒包含如上文所述的化合物和缓冲液，该化合物任选地固定至固相基质上(例如，珠)。
18.此外，本发明涉及一种用于对抗体或抗体片段进行区域选择性修饰的方法，该抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中，其中所述方法使用上文所述的化合物。
19.此外，本发明涉及一种修饰抗体或修饰抗体片段(例如，由上文所述的方法可获得或获得)，该抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中，该修饰抗体或修饰抗体片段用于在诊断、监测、成像和/或治疗疾病(尤其是癌症)的方法中使用，。
20.本发明特别包括以下实施方案(“项目”)：
21.1.一种由下式(1)表示的化合物：
22.p-y-s-v
ꢀꢀ
(1)
23.其中，
24.p为有效负载；
25.y为能够与氨基酸的侧链反应的反应性部分，优选为能够与赖氨酸的侧链反应的部分；
26.v为载体，该载体能够与抗体或其片段的可结晶片段(fc)区域相互作用，所述抗体片段任选地掺入fc-融合蛋白中；
27.s为具有长度z的间隔子，其中z为使得当载体v与抗体或其片段的fc区域相互作用时、反应性部分y能够在所述抗体或抗体片段上与氨基酸残基的侧链反应的长度。
28.2.根据项目1的化合物，其中所述有效负载包含选自以下的部分、以及所述部分的放射性同位素和/或所述部分的药学上可接受的盐：
29.(i)选自以下的部分：
30.·
标记部分，该标记部分可以包括放射性核素，优选为螯合剂，该螯合剂诸如为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-tetraatacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，dota)、二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriamine pentaacetic acid，dtpa)、环己基二亚乙基三胺五乙酸(cyclohexyl diethylenetriamine pentaacetic acid，ch-x-dtpa)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1(15),11,13-triene-3,6,9-triacetic acid，pcta)或去铁胺(desferrioxamine，dfo)，其中所述螯合剂任选地螯合放射性核素；
[0031]
·
发色团；
[0032]
·
荧光团，诸如为荧光素或罗丹明；以及
[0033]
·
含有诸如
125
i、
123
i、
131
i、
18
f、
11
c、
15
o、
18
f的放射性核素的标记部分，例如，衍生自含有诸如
125
i、
123
i或
131
i的放射性核素的4-羟基苯丙酸酯的部分；
[0034]
(ii)选自包含偶联基团的部分的部分，所述包含偶联基团的部分包括任选取代的共轭二烯、任选取代的四嗪、任选取代的炔烃或叠氮化物、任选取代的二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，dbco)、任选取代的反式-环辛烯(trans-cyclooctene，tco)、任选取代的双环[6.1.0]壬炔(bicyclo[6.1.0]nonyne，bcn)、任选取代的醛、任选取代的酮、和任选取代的肼；
[0035]
(iii)衍生自选自以下的药物的部分
[0036]
·
抗肿瘤剂，诸如dna-烷化剂，该dna-烷化剂例如为多卡霉素(duocarmycin)；
[0037]
·
拓扑异构酶抑制剂，例如多柔比星；
[0038]
·
rna-聚合酶ii抑制剂，例如α-鹅膏蕈碱；
[0039]
·
dna裂解剂，例如卡利奇霉素(calicheamicin)；
[0040]
·
抗有丝分裂剂或微管干扰剂，例如紫杉烷、澳瑞他汀或美登醇(maytansinoid)；
[0041]
·
抗代谢物；
[0042]
·
激酶抑制剂，诸如帕他色替(ipatasertib)；
[0043]
·
免疫调节剂；
[0044]
·
抗感染性疾病剂。
[0045]
3.根据项目1或2的化合物，其中有效负载是任选螯合放射性核素的螯合剂，该螯合剂优选是衍生自以下的部分：dtpa、ch-x-dtpa、dfo、1-(1,3-羧基丙基)-4,7-羧基甲基-1,4,7-四乙酸(1-(1,3-carboxypropyl)-4,7-carboxymethyl-1,4,7-tetraacetic acid，nodaga)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-戊二酸-4,7,10-三乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1-glutaric acid-4,7,10-triacetic acid，dotaga)、2,2'-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸盐(酯)(2,2'-(1,4,7-triazacyclononane-1,4-diyl)diacetate，no2a)、dota、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，nota)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，edta)、乙二胺二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸(triethylenetetraminehexaacetic acid，ttha)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane，cyclam)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(1,4,
benzodiazepine dimers)。
[0048]
6.根据项目1至5中任一项的化合物，其中，p由下式(2)表示：
[0049]
p1-l
‑‑
*'
ꢀꢀ
(2)
[0050]
其中，
[0051]
p1为项目2至5中任一项定义的有效负载；
[0052]
l为接头，优选包含选自碳、氮、氧和硫的一个或多个原子的接头，该接头任选地为可裂解的；
[0053]
*'指代共价附接至反应性部分(y)。
[0054]
7.项目6的化合物，其中该接头选自：
[0055]
(a1)具有1至12个碳原子的亚烷基，优选具有2至6个碳原子的亚烷基，诸如为亚丙基；
[0056]
(b1)具有2或3个碳原子、且具有1至36个重复单元的聚环氧烷基(polyalkylene oxide group)；优选由式-nh-(ch2ch2o)
n1-ch2ch2–
，其中n1是0至35的整数，例如，1至20的整数；
[0057]
(c1)具有2至12个氨基酸的肽基团。
[0058]
8.根据项目1至7中任一项的化合物，其中反应性部分由下式(3a)表示：
[0059]
**
‑‑
(f1-rc-f2)
‑‑
*
ꢀꢀ
(3a)
[0060]
其中，
[0061]
rc为反应中心，优选为亲电反应中心，并且更优选为选自c＝o和c＝s的基团；
[0062]
f1是单个共价键、原子或原子基团；优选为选自o和s的原子，或包含选自c、n、o和s的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自o和s的原子；
[0063]
f2表示原子，或原子基团；优选为选自o和s的原子，或包含选自c、n、o和s的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自o和s的原子；
[0064]
*指代共价附接至间隔物(s)；并且
[0065]
**指代共价附接至有效负载(p)。
[0066]
9.根据项目8的化合物，其中，所述反应性部分由下式(4a)至(4m)中的一者表示：
[0067][0068]
其中*指代共价附接至间隔物(s)，**指代共价附接至有效负载(p)。
[0069]
10.根据项目1至7中任一项的化合物，其中反应性部分由下式(3b)表示：
[0070]
**
‑‑
(f1-rc-f2)-(m)
‑‑
*
ꢀꢀ
(3b)
[0071]
其中，
[0072]
rc为反应中心，优选为亲电反应中心，并且更优选为选自c＝o和c＝s的基团；
[0073]
f1是单个共价键、原子或原子基团；优选为选自o和s的原子，或包含选自c、n、o和s的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自o和s的原子；
[0074]
f2表示原子或原子基团；优选为选自o和s的原子，或包含选自c、n、o和s的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自o和s的原子；
[0075]
m为能够调节f2的电子密度和稳定性的基团，优选为能够吸电子的基团；
[0076]
*指代共价附接至间隔物(s)；并且
[0077]
**指代共价附接至有效负载(p)。
[0078]
11.根据项目10的化合物，其中能够调节f2的电子密度和稳定性的基团由下式(3c)表示：
[0079]
***'
‑‑
m'—b—c
‑‑
*
ꢀꢀ
(3c)
[0080]
其中，
[0081]
m'为分别具有6元环、10元环或14元环和1个、2个或3个稠环的芳基，或具有5至20元环、1个、2个或3个稠环和独立地选自n、o和s的1至4个杂原子的杂芳基，该m'可以由一个或多个取代基取代；优选为可以由一个或多个取代基取代的苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基或苯并三唑基，各取代基优选选自-f、-br、-cl，-i、-no2、-cn、-c
1-6-烷基、-c
1-6-烷氧基、-c
1-6-氨基(诸如，-c(＝o)nh2)，以及它们的组合(诸如，-ccl3、-cf3或-ch2no2)；
[0082]
b为单个共价键、o、s、nr'，其中r'表示氢原子、oh、烷基或环烷基、c
2-6-亚烯基，c
2-6-亚炔基，具有以下通式的基团或它们的任何组合：
[0083]
–
(ch2)
n1-(h1)
x1-(ch2)
n2-(h2)
x2-(ch2)
n3-(h3)
x3-(ch2)
n4
‑ꢀꢀ
(3c')
[0084]
其中，
[0085]
n1、n2、n3和n4中的每个表示独立地选自0至10的整数，使得n1+n2+n3+n4为10或更小，
[0086]
x1、x2和x3中的每个独立地选自0和1，并且
[0087]
h1、h2和h3中的每个为独立地选自n、o和s的原子，
[0088]
条件是，如果x1+x2＝2，则n2≥1，如果x2+x3＝2，则n3≥0，如果x1+x3＝2，则n2≥1或n3≥1，如果x1+x2+x3为3，则n2≥1且n3≥1；
[0089]
b优选为单个共价键、nh或c
1-10-亚烷基；更优选为单个共价键；
[0090]
c为c＝o、c＝s、c(＝nr”)，其中r”表示氢原子、oh、烷基或环烷基、s＝o或s(＝o)2；优选为c＝o；
[0091]
*指代共价附接至间隔物(s)；并且
[0092]
***'指代共价附接至f2。
[0093]
12.根据项目10或11的化合物，其中部分(f1-rc-f2)由下式(4a')至(4m')中的一者表示，和/或m独立地由下式(5a)至(5j')中的一者表示：
[0094]
[0095]
[0096]
[0097][0098]
其中*指代共价附接至间隔物(s)，**指代共价附接至有效负载(p)，***指代共价附接至m，***’指代共价附接至f2。
[0099]
13.根据项目10至12中任一项的化合物，其中所述反应性部分由下式(6a)至(6l')中的一个表示：
[0100]
[0101]
[0102]
[0103][0104]
其中*指代共价附接至间隔物(s)，**指代共价附接至有效负载(p)。
[0105]
14.根据项目1至13中任一项的化合物，其中，该间隔物的长度为10至并且优选为主链中具有12至120个原子(例如，16至80个原子)的基团，该原子选自碳、氮、氧和硫；更优选地选自以下的基团：
[0106]
(a2)具有6至36个重复单元、例如为8至24个重复单元的聚环氧烷基团；优选为由下式(7)表示的基团：
[0107]
–
x1–
(ch2ch2o)
n2
–
ch2ch2–
x2–
(7)
[0108]
其中，
[0109]
x1为nh、o或s；优选nh；
[0110]
x2为nh或c＝o，如果x2共价结合至载体，则x2优选为c＝o；并且
[0111]
n2为4至28的整数，优选为6至20的整数、例如10；
[0112]
(b2)肽基团，该肽基团在主链中具有6至25个氨基酸、例如在主链中具有9个氨基酸，各氨基酸优选选自pro、gly、ala、asn、asp、thr、glu、gln和ser；更优选为pro、gly或ser。
[0113]
15.根据项目1至13中任一项的化合物，其中，该间隔物包含具有4至36个重复单元、优选6至28个重复单元、更优选7至24个重复单元的聚氧化乙烯基。
[0114]
16.根据项目1至15中任一项的化合物，其中该载体是包含11至17个氨基酸、例如13至17个氨基酸的序列的肽，优选由下式(8a)和(8b)中的一个表示的肽：
[0115][0116]
其中，
[0117]
bxx、cxx、dxx、exx、fxx中的每一个独立地表示氨基酸；
[0118]
axx表示氨基酸、二羧酸或由下式(9a)表示的肽部分：
[0119]
‑‑‑
axx1
–
axx2
–
axx3
‑‑‑ꢀꢀ
(9a)
[0120]
其中，在式(9a)中，
[0121]
axx1表示单个共价键或氨基酸，诸如arg；
[0122]
axx2表示氨基酸，诸如gly或cys；并且
[0123]
axx3表示氨基酸，诸如asp或asn；
[0124]
gxx表示氨基酸，或由下式(9b)表示的肽部分：
[0125]
‑‑‑
gxx1
–
gxx2
–
gxx3
‑‑‑ꢀꢀ
(9b)
[0126]
其中，在式(9b)中，
[0127]
gxx1表示氨基酸，诸如thr；
[0128]
gxx2表示氨基酸，诸如tyr或cys；和
[0129]
gxx3表示单个共价键或氨基酸，诸如his；并且
[0130]
axx2的侧链可以共价结合至gxx2的侧链、以形成环；
[0131]
如果axx2为cys，并且gxx2为cys，则优选将axx2和gxx2的侧链连接在一起、以形成式-(s-x
4-s)-的基团，其中x4表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或更多原子的二价基团，该二价基团诸如为二价马来酰亚胺基、二价丙酮基或二价亚芳基，优选单个共价键；
[0132]
hxx表示单个共价键，或三官能氨基酸，诸如二氨基羧酸；
[0133]
z1表示
[0134]
·
如果hxx为单个共价键，则z1表示共价结合至gxx的c端的基团，该基团选自：-n(h)(r)，其中r表示氢原子、烷基或环烷基，以及衍生自含有偶联基团的化合物的部分，该偶联基团选自生物素、dbco、tco、bcn、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇；
[0135]
·
如果hxx为三官能氨基酸、且y'结合至hxx的侧链，则z1表示共价结合至hxx的c端的基团，该基团优选为n(h)(r)，其中如果z1共价结合至hxx的c端，则r表示氢原子、烷基或环烷基；或者
[0136]
·
如果hxx为三官能氨基酸、且y'结合至hxx的c端，则z1表示结合至hxx的侧链的氢原子。
[0137]
z2表示
[0138]
·
如果hxx为单个共价键，则z2表示共价结合至axx的n端的基团，该基团选自氢原子、诸如乙酰基的含羰基基团和诸如生物素的含有偶联部分的基团；
[0139]
·
如果hxx是三官能氨基酸、且y'结合至hxx的侧链，则z2表示共价结合至hxx的n端的基团，该基团选自氢原子和诸如乙酰基的含羰基基团；或者
[0140]
·
如果hxx为三官能氨基酸、且y'结合至hxx的n端，则z2表示结合至hxx的侧链的氢原子。
[0141]
如果hxx为三官能氨基酸，则仅存在y'；且
[0142]
·
如果z1结合至hxx的c端、或如果z2结合至hxx的n端，则y'表示共价结合至hxx的侧链的部分，
[0143]
·
如果z1结合至hxx的侧链，则y'表示共价结合至hxx的c端的部分，或者
[0144]
·
如果z2结合至hxx的侧链，则y'表示共价结合至hxx的n端的部分；
[0145]
y'衍生自含有偶联基团的化合物，该偶联基团优选选自生物素、dbco、tco、bcn、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇；
[0146]
x3表示单个共价键或包含一个或更多个选自碳、氮和氧的原子的二价基团，该二价基团诸如二价马来酰亚胺基、二价丙酮基或二价亚芳基，优选地，x3为单个共价键；
[0147]
****指代共价附接至间隔物(s)。
[0148]
17.根据项目16的化合物，其中axx、bxx、cxx、dxx、exx、fxx、gxx和hxx中的至少一种定义如下：
[0149]
axx表示选自ala、2,3-二氨基-丙酸(2,3-diamino-propionic acid，dap)、asp、glu、2-氨基辛二酸、α-氨基丁酸、asn和gln的氨基酸，选自琥珀酸、戊二酸的二羧酸酸和己二酸的二羧酸，或者式(9a)的肽部分；axx优选为ala、asp或asn、更优选为asp；其中axx1为单个共价键，axx2为cys，并且axx3为asp；
[0150]
bxx表示选自trp、phe、tyr、苯基甘氨酸(phg)、3-苯并噻吩-2-基-l-丙氨酸、3-萘-2-基-l-丙氨酸、3-联苯-4-基-l-丙氨酸和3-萘-1-基-l-丙氨酸的氨基酸；优选为trp；
[0151]
cxx表示选自his、ala、3-吡啶-2-基-l-丙氨酸、间位-酪氨酸(meta-tyrosine，mtyr)和phe的氨基酸；优选为his、ala或mtyr；更优选为his；
[0152]
dxx表示选自ala、abu、gly、leu、ile、val、met、环己基丙氨酸(cyclohexyl alanine，cha)、phe、thr、cys、tyr和正亮氨酸(norleucine，nle)的氨基酸；优选为ala、nle或leu；更优选为leu；
[0153]
exx表示选自ala、gly、asn、ser、abu和asp的氨基酸；优选为ala或gly；更优选为gly；
[0154]
fxx表示选自ala、glu、asp、gln、his、arg、ser和asn的氨基酸；优选为asp或glu；更优选为glu；
[0155]
gxx表示选自thr、ser、ala、asn、val、2-氨基丁酸(2-amino-butyric acid，abu)、ile、met、leu、pro、gln和cys的氨基酸，或者式(9b)的肽部分；gxx优选为thr或ser、更优选为thr；其中gxx1为thr，gxx2为cys，并且gxx3为单个共价键；以及
[0156]
hxx表示选自dap、dab、lys、orn和高赖氨酸(homo-lysine，homo-lys)的氨基酸，优选选自dap、dab、lys、orn和homo-lys的氨基酸。
[0157]
18.根据项目1至17中任一项的化合物，其中该载体是由下式(8a')至(8d')中的一者表示的肽：
[0158][0159]
其中，
[0160]
z1、z2、x3、x4和****如项目16中所定义；
[0161]
优选为由式(8a')或(8b')表示的肽。
[0162]
19.根据项目1至18中任一项的化合物，该化合物选自
[0163][0164]
以及，
[0165][0166]
其中，p如项目1至5中的任一项所定义，并且y'如项目16中所定义。
[0167]
20.根据项目1至19中任一项的化合物，该化合物选自
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173][0174]
21.一种用于位点特异性修饰抗体或其片段的试剂盒，该抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中，该试剂盒包含项目1至20中任一项的化合物和缓冲液；其中，该缓冲液的ph优选为5.5至11、更优选为7.5至9.5。
[0175]
22.根据项目21的用于区域选择性修饰抗体或其片段的试剂盒，其中所述化合物被固定在固相基质上，该固相基质例如为珠。
[0176]
23.一种用于区域选择性修饰抗体或其片段的方法，该方法包括使抗体或其片段与根据项目1至20中任一项的化合物反应，该抗体片段任选地掺入fc-融合蛋白中。
[0177]
24.根据项目23的方法，其中，
[0178]
·
该抗体是单克隆抗体，优选选自以下组成的组的抗体：阿达木单抗(adalimumab)、阿杜那单抗(aducanumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿奈妥单抗(anetumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴匹组单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝迈奇单抗(bermekimab)、贝西索单抗(besilesomab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、本妥昔单抗(brentuximab)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、辛帕奈单抗(cinpanemab)、克利妥珠单抗(clivatuzumab)、泰坦-克利妥珠单抗(clivatuzumab tetraxetan)、泰坦-克雷内治单抗(crenezumab tetraxetan)、达珠单抗(daclizumab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、地诺单抗(denosumab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、依帕伐单抗(emapalumab)、恩弗妥单抗(enfortumab)、维汀-恩弗妥单抗(enfortumab vedotin)、依帕珠单抗(epratuzumab)、依帕珠单抗-sn-38(epratuzumab-sn-38)、埃达组单抗(etaracizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamycin)、吉妥昔单抗(girentuximab)、戈奈单抗(gosuranemab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、英比利珠单抗(inebilizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、英妥珠单抗(inotuzumab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)、艾萨妥昔单抗(isatuximab)、伊西贝单抗(ixekizumab)、j591psma-抗体、拉贝珠单抗(labetuzumab)、莱卡单抗(lecanemab)、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、奈昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗
(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、泊洛妥珠单抗(polatuzumab)、维博妥珠单抗(polatuzumab vedotin)、普尼珠单抗(prasinezumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、利妥昔单抗(rituximab)、司妥昔单抗(siltuximab)、沙西妥珠单抗(sacituzumab)、戈沙妥组单抗(sacituzumab govitecan)、西瑞奈单抗(semorinemab)、司妥昔单抗(siltuximab)、茄尼醇单抗(solanezumab)、他珠单抗(tacatuzumab)、替妥木单抗(teprotumumab)、替拉奈单抗(tilavonemab)、托珠单抗(tocilizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、德喜曲妥珠单抗(trastuzumab deruxtecan)、恩美曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)、ts23、乌司奴单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、泽格特奈单抗(zagotenemab)、扎芦木单抗(zalutumumab)、扎木单抗(zalutumumab)、其片段及衍生物；
[0179]
·
将抗体片段掺入fc-融合蛋白，该fc-融合蛋白优选选自贝拉西普(belatacept)、阿柏西普(aflibercept)、ziv-阿柏西普、度拉糖肽(dulaglutide)、利钠西普(rilonacept)、罗米司亭(romiplostim)、阿巴西普(abatacept)和阿法西普(alefacept)。
[0180]
25.一种修饰抗体或修饰抗体片段，该修饰抗体或修饰抗体片段通过抗体或抗体片段与根据项目1至20中任一项的化合物反应而获得，该抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中，其中该抗体或抗体片段优选具有与项目24相同的定义。
[0181]
26.根据项目25中定义的修饰抗体或修饰抗体片段，该修饰抗体或修饰抗体片段用于诊断、监测、成像或治疗疾病的方法中，该方法包括向受试者施用修饰抗体或修饰抗体片段。
[0182]
27.一种用于诊断、监测、成像或治疗疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用根据项目25的修饰抗体或修饰抗体片段。
[0183]
28.根据项目26所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据项目27的方法，其中所述疾病是神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫疾病或癌症。
[0184]
29.用于根据项目26或28所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据项目27或28的方法，其中所述疾病或其治疗选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、脑动脉硬化症、脑病、亨廷顿氏病、多发性硬化症、帕金森氏病、进行性多灶性白质脑病、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、包括不稳定型心绞痛的心绞痛、主动脉瘤、动脉粥样硬化症、心脏移植、心脏毒性诊断、冠状动脉旁路移植术、包括心房颤动终止收缩性心力衰竭的心脏衰竭、高胆固醇血症、局部缺血、心肌梗塞、血栓栓塞、血栓症、强直性脊柱炎、自身免疫性血细胞减少症、自身免疫性心肌炎、克罗恩氏病、移植物抗宿主病、肉芽肿性多血管炎、特发性血小板减少性紫癜、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、狼疮、显微镜下多血管炎、多发性硬化症、斑块状银屑病、银屑病、银屑病性关节炎、风湿性关节炎、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)、葡萄膜炎、以及血管炎。
[0185]
30.用于根据项目26或28所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据项目27或28的方法，其中所述疾病涉及选自淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、肾癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状癌细胞、小细胞肺癌细胞、睾丸癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、黑色素瘤、头颈癌细胞的细胞；以及以不受调节和加快速度生长和分裂而导致癌症的任何细胞；优选选自乳腺癌细胞、小细胞肺癌细胞、淋巴瘤细胞、
结肠直肠癌细胞和头颈癌细胞。
附图说明
[0186]
图1
–
使用本发明化合物的抗体偶联方法的示意图。能够与抗体的fc区域相互作用的载体与fc区域结合，从而使反应性部分靠近暴露在抗体表面的赖氨酸残基的侧链。赖氨酸残基的侧链与反应性部分之间的反应引起有效负载(通过接头)共价附接至抗体，并且引起载体的伴随释放。
[0187]
图2
–
化合物29的合成，即包含作为有效负载的标记部分(dota)和peg
10
间隔物的化合物：a)1.hatu、dmf、diea(预活化3-5分钟)，2.化合物1，3.20％哌啶的dmf(2个步骤后产率：42％)；b)1.hatu、dmf、diea(预活化3-5分钟)，2.化合物7，3.tfa(+hplc纯化)。
[0188]
图3
–
荧光偏振(fluorescence polarization，fp)结合测定。5nm浓度处配体fc-iii(fc-iii-fam)的荧光素衍生物与治疗性单克隆抗体曲妥珠单抗、阿仑单抗、贝伐单抗和利妥昔单抗的结合等温线。这些线是使用希尔(hill)方程拟合的数据，得到半最大效应浓度(ec
50
)。证实了fc-结合配体fc-iii-fam以高亲和力结合各个抗体(曲妥珠单抗：14nm，阿仑单抗：13nm，贝伐单抗：7nm，利妥昔单抗：11nm)。
[0189]
图4
–
竞争性fp结合试验。评估了实施例1的fc-结合载体(化合物1(fc iii)、2、9-11、15和16)抗fc-iii-fam、以结合曲妥珠单抗的fc区域的倾向性。这些线是使用希尔方程拟合的数据，得到半最大抑制浓度(ic
50
)。结果也在表3中给出。
[0190]
图5
–
化合物17和19的合成，即荧光素-和dota-碳酸盐(酯)衍生物：a)在40℃下、et3n的ch3cn，b)在25℃下、dmap的ch2cl2，c)tfa/ch2cl2(1/3，v/v)，d)在25℃下、dipea的ch3cn，e)在25℃下、dipea的ch3cn/dmf(1/1,v/v)。
[0191]
图6
–
曲妥珠单抗和用化合物31修饰的曲妥珠单抗的高分辨率质谱法(high-resolution mass spectrometry，hrms)，即曲妥珠单抗-dota偶联物。峰d0至d3对应于具有不同偶联程度的曲妥珠单抗片段。在hrms测量之前将样品去糖基化。
[0192]
图7
–
将曲妥珠单抗dota偶联物用酶消化为fab和fc区域的hrms。峰d0至d2对应于具有不同偶联水平的曲妥珠单抗。
[0193]
图8
–
曲妥珠单抗-dota偶联物和曲妥珠单抗对sk-br-3(her2+)和md-mb-231(her2-)细胞的亲和力。对于sk-br-3细胞，抗体或抗体偶联物的浓度范围为0.003至30μg/ml(进行1/10稀释)。对于md-mb-231细胞，仅使用3μg/ml和30μg/ml。曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-dota偶联物用与alexa488偶联的二级大鼠抗人igg fc抗体进行染色。用draq7排除死细胞。误差条：sd(n＝2)。
[0194]
图9
–
化合物38的合成，即包含peg
20
间隔物和作为有效负载的标记部分(荧光素(fluorescein，fl))的反应性偶联物：a)1.hatu、dmf、diea(预活化3-5分钟)，2.化合物1，3.3.20％哌啶的dmf(2个步骤后产率：50％)，b)1.hatu、dmf、diea(预活化3-5分钟)，2.化合物10，3.tfa(+hplc纯化；产率：19％)。
[0195]
图10
–
通过化合物35-41与曲妥珠单抗(iggt)的反应制备的曲妥珠单抗-fl偶联物的非还原性sds-page分析。使用考马斯蓝(coomassie blue)染色和荧光分析还原(a)或ides蛋白酶消化(b)后的偶联物。
[0196]
图11
–
与10μg/ml的fitc-曲妥珠单抗(偶联物12，随机偶联，虚线)和fl-曲妥珠单
抗(偶联物11，纯色)以及浓度增加的未标记曲妥珠单抗温育的bt-474细胞。绘制的数据代表两个独立实验的mfi分数的平均值。每种抗体的最大mfi归一化为1。
[0197]
图12
–
通过化合物38和40与曲妥珠单抗(iggt)、商业曲妥珠单抗(赫塞汀)(iggh)、阿仑单抗(igga)、贝伐单抗(iggb)和利妥昔单抗(iggr)进行反应制备的曲妥珠单抗-fl偶联物的非还原性sds-page分析。使用荧光和考马斯蓝染色分析ides蛋白酶消化后的偶联物。
[0198]
图13
–
反应性偶联物固定在固体支承物上的示意图。
[0199]
图14
–
使用含有dbco基团(化合物43)的肽偶联物和含有叠氮基的任何有效负载的抗体偶联方法示意图。
具体实施方式
[0200]
1.定义
[0201]
如本文所使用的术语“有效负载”表征以下物质(例如，天然存在的或合成的物质)：当该物质附接(偶联)至抗体或抗体片段时可以赋予新的功能。在一些实施方案中，如本文所使用的术语“有效负载”应理解为能够和/或促进其所附接的互补部分(例如，抗体)的检测和/或可视化的标记部分(例如，生色团、荧光团、放射性标记的部分)。例如，标记部分可以通过本领域已知的功能化(生理)成像技术来检测和/或可视化，该功能化(生理)成像技术例如为计算机断层扫描(computed tomography，ct)、正电子发射断层扫描(positron emission tomography，pet)等。在一些实施方案中，如本文所使用的术语“有效负载”应理解为可以抑制或防止细胞的功能和/或杀死细胞的药理活性物质。在一些实施方案中，术语“有效负载”应理解为与本领域常用的其他术语同义，例如癌症治疗领域中使用的“细胞毒素剂”、“毒素”或“药物”。替代地，有效负载是选自包含偶联基团部分的部分。有效负载可以包括衍生自官能团的基团，该官能团允许有效负载共价附接至化合物的其余部分(例如，附接至式(1)中的反应性部分y)，该化合物的其余部分诸如为羧酸、伯胺、仲胺、羟基、硫醇基等。
[0202]
如本文所使用的术语“肽”可以理解为包含通过肽键相互连接的至少三个氨基酸的连续序列的化合物。在这方面，术语“肽键”是指涵盖(骨架)酰胺键以及修饰键，如果在肽序列中引入非天然氨基酸，则可以获得修饰键。在这种情况下，修饰键取代了(骨架)酰胺键，该(骨架)酰胺键形成在通过两个氨基酸残基的氨基和羧基反应(nh
2-cr
1-cooh+nh
2-cr
2-cooh
→
nh
2-cr
1-(c＝o)-nh-cr
2-cooh)的连续肽序列中。例如，修饰键可以是酯(nh
2-cr
1-(c＝o)-o-cr
2-cooh)、硫酯(nh
2-cr
1-(c＝o)-s-cr
2-cooh或nh
2-cr
1-(c＝s)-o-cr
2-cooh)、尿素(nh
2-cr
1-nh-(c＝o)-nh-cr
2-cooh)、硫脲(nh
2-cr
1-nh-(c＝s)-nh-cr
2-cooh)或三唑键(例如，nh
2-cr
1-c≡ch+n
3-cr
2-cooh
→
nh
2-cr
1-x-cr
2-cooh，其中x代表1,4-二取代-1,2,3-三唑部分)。优选地，形成连续肽序列的氨基酸通过骨架酰胺键彼此连接。肽可以是直链的或支链的。一方面，肽可以是例如由经修饰以形成环(例如，“头至尾”环化)的氨基酸的直链形成的环状，或者由具有彼此共价附接的侧链的氨基酸直链(例如，通过二硫键形成或任何其他修饰)形成的环状。本文，氨基酸包括天然存在的氨基酸以及非天然(合成)氨基酸，如下面所描述的。
[0203]
如本文所使用的表述“标记部分”(或同义词“标记”或“标记基团”)是指含有以下
基团的部分：该基团能够和/或促进通过视觉或仪器手段对其所附接的互补部分(例如，抗体)进行检测和/或可视化。标记部分的实施例包括放射性标记(例如，放射性核素)、用于磁共振成像(magnetic resonance imaging，mri)的造影剂、以及吸收或发射光的化学物质(例如，生色团和荧光团)。
[0204]
如本文所使用的表述“衍生自药物的部分”是指除了具有用于将天然药物结合至本发明化合物中包含的反应性基团或接头的结构性修饰之外、对应于天然药物的部分。根据天然药物中可用的官能团，可以使用天然药物中已经存在的官能团中的一个来影响结合，也可以通过掺入新的官能团来修饰天然药物以影响结合。因此，药物可以用于以其未修饰的形式来结合，或者药物可以被化学修饰，从而掺入一个允许共价附接至本发明化合物中包含的反应性部分或接头的官能团。如本文所使用的表述“衍生自药物的部分”是指涵盖这两种含义。
[0205]
以类似的方式，术语“衍生物”与其他部分结合使用来表征用于结合至相邻部分或其他部分所需的共价键的存在，该其他部分被化学修饰以掺入一个以允许共价附接至相邻部分的官能团。换而言之，术语“衍生物”可以表征结合至相邻部分的部分，这些部分与它们所衍生自的分子的区别仅在负责结合至相邻部分的结构性元件。这可能包括例如在去除一个氢原子以提供用于结合所需的自由价后、由现有官能团形成的共价键，或为此目的新引入的共价键和相邻官能团。
[0206]“天然药物”的表述表征一种已经通过体外和/或体内试验证实了治疗功效的化合物。在一个优选的实施方案中，天然药物是已经通过临床试验证实了治疗功效的化合物。最优选地，天然药物是已经可商购的药物。待证实的治疗功效的类型和待应用的合适试验当然取决于待治疗的医学适应症(medical indication)的类型。
[0207]
当提及特定类别的药物分子时，诸如抗肿瘤剂、拓扑异构酶抑制剂、rna-聚合酶ii抑制剂、dna裂解剂、抗有丝分裂剂或微管干扰剂、抗代谢物、激酶抑制剂、免疫调节剂或抗感染性疾病剂，这些术语旨在具有医学领域普遍接受的含义，例如，由在mosby’s medical dictionary,mosby,elsevier 10
th ed.(2016)，或者oxford textbook of oncology,david j.kerr,oup oxford 3
rd ed.(2016)中体现的。
[0208]
如本文所使用的表述“螯合剂”是指含有两个或多个电子给体原子的分子，该电子给体原子可以与单个中心金属离子(例如，放射性核素)形成配位键。通常，螯合剂通过氧或氮给体原子、或两者来配位金属离子。在形成第一配位键后，结合的各连续的给体原子产生含有金属离子的环。螯合剂可以是二齿、三齿、四齿等，这取决于螯合剂是否含有能够与金属离子结合的2、3、4或更多个给体原子。然而，螯合机制尚不是完全清楚的，并且取决于螯合剂和/或放射性核素。例如，认为dota可以通过羧酸盐和氨基(给体基团)来配位放射性核素，从而形成具有高稳定性的络合物(dai et al.nature com.2018，9，857)。“螯合剂”的表述应理解为包括螯合剂及其盐。例如，具有羧基的螯合剂(例如，dota、trita、heta、hexa、edta、dtpa等)例如可以被衍化以将一个或多个羧基转化为用于连接至化合物(连接至反应性部分或接头)的氨基，替代地，例如，所述化合物可以被衍化以能够通过螯合环中的ch2基团中的一个而附接至化合物。
[0209]
如本文所使用的术语“放射性核素”指具有不稳定原子核的原子，该不稳定原子核为一种特征在于可用于赋予原子核内新产生的辐射粒子或原子电子过量能量的原子核。放
射性核素天然存在或可以人工产生。在一些实施方案中，在本发明中使用的放射性核素是医学上有用的放射性核素，包括例如带正电的离子的放射性金属，诸如y、in、cu、lu、tc、re、co和fe。优选地，放射性核素选自
89
zr、
111
in、
64
cu、
177
lu、
68
ga、
99m
tc、
203
pb、
72
as、
55
co、
97
ru、
201
tl、
152
tb、
133
xe、
86
y和al
18
f，更优选选自
89
zr、
111
in、
64
cu、
177
lu、
68
ga和
99m
tc，特别是
111
in。
[0210]
如本文所使用的术语“发色团”是指有机或金属有机化合物，该有机或金属有机化合物能够吸收350nm-1100nm或其子范围内的电磁辐射，例如350-500nm或500-850nm、或350-850nm。
[0211]
如本文所使用的术语“荧光团”是指当通过暴露于特定波长的光来激发时、发射不同(更高)波长的光的化合物。荧光团通常根据其发射分布或“颜色”来描述。例如，诸如cy3或fitc的绿色荧光团通常发射515-540nm范围内的波长，而诸如cy5或四甲基罗丹明的红色荧光团通常发射590-690nm范围内的波长。如本文所使用的术语“荧光团”应理解为特别涵盖诸如荧光素、罗丹明、或amca、以及生物荧光团的有机荧光染料。
[0212]
如本文所使用的表述“药学上可接受的盐”是指所公开化合物(包括反应性偶联物)的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸盐或碱盐进行修饰。药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或碱、或无毒有机酸或碱形成的母体化合物的无毒盐或季铵盐。合适的盐的列表可以在以下中发现：remington's pharmaceutical sciences,17
th ed.,mack publishing company,easton,pa,1985,page 1418,s.m.berge,l.m.bighley,and d.c.monkhouse,“pharmaceutical salts,”j.pharm.sci.66(1),1
–
19(1977)；p.h.stahl and c.g.wermuth,editors,handbook of pharmaceutical salts:properties,selection and use,weinheim/z
ü
rich,wiley-vch,2008and in a.k.bansal et al.,pharmaceutical technology,3(32),2008。药学的盐可以通过常规化学方法由含碱性或酸性部分的母体化合物来合成。对于反应性偶联物，这可以在将药物部分掺入到本技术的化合物之前或之后进行。除非上下文另有说明，所有提及本发明的化合物(偶联物、修饰抗体等)也应理解为提及相应化合物的药学上可接受的盐。
[0213]
如本文所使用的表述“反应性部分”是指可以容易地与另一分子(例如，亲核试剂)上的结合配偶体反应的部分。这与需要添加催化剂或非常不切实际的反应条件才能反应的部分(即“非反应性”或“惰性”部分)形成对比。特别地，“反应性部分”的表述是指反应性偶联物的部分，该反应性偶联物的部分与抗体(优选为曲妥珠单抗(可以购自罗氏(roche)的))的lys的侧链在50mm的、ph为9.0的nahco3中、偶联物与曲妥珠单抗的摩尔比为2比1、以1000rpm在室温下搅拌2小时来反应，使得至少25％的偶联物反应、优选至少50％的偶联物反应、更优选至少70％的偶联物反应(例如，有效负载与曲妥珠单抗的附接)。根据下面第9.3.5节中描述的方法，可以通过高分辨率质谱法确定有效负载与曲妥珠单抗的附接。
[0214]
如本文所使用的表述“氨基酸的侧链”指附接至氨基酸的α-碳的部分。例如，ala的侧链是甲基，phe的侧链是苯甲基，cys的侧链是硫甲基，tyr的侧链是4-羟基苯甲基等。天然存在侧链和非天然存在侧链链两者都包含在此定义中。在非天然氨基酸的情况下，侧链也可以以不同的位置存在，例如附接至类肽结构中的骨架氮或附接至一些形式的β-氨基酸中的β-碳。
[0215]
如本文所使用的术语“氨基酸”是指含有或衍生自至少一个氨基和至少一个酸性基团(优选为羧基)的化合物。氨基与酸性基团之间的距离没有特别地限制，α-氨基酸、β-氨
基酸和γ-氨基酸是合适的，但是α-氨基酸、特别是α-氨基羧酸是特别优选的。该术语涵盖天然存在的氨基酸以及自然界中未发现的合成氨基酸。在下文中，可以通过3个字母的氨基酸代码(arg、phe、ala、cys、gly、gln等)或通过1个字母的氨基酸代码(r、f、a、c、g、q等)来引用氨基酸。在下文中，氨基酸序列从n-端书写至c-端(从左到右)。
[0216]
如本文所使用的术语“三官能团”是指具有三个官能团的化合物或部分，这些官能团可以形成或已经形成与相邻部分的三个共价键。因此，术语“三官能氨基酸”是指含有或衍生自至少含有氨基、酸基(例如，羧基)和另一官能团(诸如氨基或羧基)的化合物的化合物。
[0217]
如本文所使用的术语“c端”是指氨基酸(肽)链的c末端。与“c端”结合意味着在氨基酸残基的主链(骨架)中的酸基与结合配偶体之间形成共价键。例如，基团“x”与氨基酸残基axx的c端结合产生酯或酰胺型结构元素
–
c(o)
–
x，其中羰基衍生自axx的酸基。
[0218]
如本文所使用的术语“n端”是指氨基酸(肽)链的n末端。与“n-端”结合是指在氨基酸残基的主链(骨架)中的氨基与结合配偶体(该结合配偶体取代一个氢原子)之间形成共价键。例如，基团“x”与氨基酸残基axx的n端结合产生结构元素x-nh-，其中氨基衍生自axx。
[0219]
如本文所使用的表述“能够与抗体或其片段的可结晶片段(fc)区域相互作用”表示载体可以与上文定义的抗体或抗体片段的fc区域结合。所述相互作用/结合可以产生靶向作用，即，使抗体或抗体片段的氨基酸(例如，赖氨酸残基)侧链附近的反应性部分的浓度局部增加。载体、与抗体或抗体片段的fc区域的相互作用(结合)可以通过使用本领域已知的并且在下文进一步描述的荧光偏振技术来评估。在一些方面，“能够与抗体或其片段的fc区域相互作用的化合物”的表述是指保留至少20％、优选至少50％、更优选至少80％的配体“fc-iii”对igg的fc-区域的结合亲和力的化合物，该结合亲和力如由delano et al.(science 2000,287,1279-1283)描述、且通过荧光偏振测量。该化合物能够与抗体或其片段的fc区域相互作用，因此，与fc-iii相比，该化合物可以具有对fc区域优异的结合亲和力。
[0220]
如本文所使用的术语“抗体”(也同义地称为“免疫球蛋白”(immunoglobulin，ig))涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、贴面抗体(eneered antibody)和小免疫蛋白，前提是它包含至少一个可结晶片段(fc)区域。抗体是由免疫系统产生的、能够识别并结合至特定抗原的蛋白质。靶抗原通常具有由多个抗体上的互补决定区域(complementary-determining region)识别的许多结合位点，也称为表位。特异性结合至不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有超过一种相应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含抗原结合位点的分子，该抗原结合位点免疫特异性结合目标抗原或目标抗原的部分。抗体可以是igg，例如igg1、igg2、igg3、igg4。优选地，抗体是igg蛋白，更优选地是igg1、igg2或igg4蛋白。最优选地，抗体是igg1蛋白。该抗体可以是人类的或衍生自其他物种的。优选地，抗体是人类抗体。
[0221]
如本文所使用的表述“单克隆抗体”表征相同的抗体，因为它们由一种类型的免疫细胞产生并且都是单个母体细胞的克隆。
[0222]
如本文所使用的表述“抗体片段”是指包含衍生自抗体的至少一个多肽链的分子，该抗体是非全长的且具有能够与配体相互作用的至少一个可结晶片段区域。
[0223]
如本文所使用的表述“商业配制的抗体”是指包含治疗性抗体和一种或多种赋形剂的市售制剂。优选地，商业配制的抗体是在欧盟市售的制剂。商业配制的抗体的示例包括修美乐坎帕斯泰圣奇舒莱舒莱安维汀爱必妥赛尼哌兆珂普罗力普罗力易普利姆玛易普利姆玛欧狄沃拉特沃奥密塔克希冉择美罗华瑞图宣萨温珂百克沙赫塞汀喜达诺及其生物仿制药。有关商业配制的抗体的信息可以例如在allgemeine and spezielle pharmakologie und toxicologie,thomas karow and ruth lang-roth,karow,27
th ed.(2018)中找到。
[0224]
优选地，商业配制的抗体为经欧洲药品管理局(european medicines agency，ema)批准在欧盟市售的、授权编号为eu/1/00/145/001和eu/1/00/145/002(可以购自罗氏)的(含曲妥珠单抗的制剂)，或经ema批准在欧盟市售的、授权编号为eu/1/98/067/001、eu/1/98/067/002、eu/1/98/067/003和eu/1/98/067/004的(含利妥昔单抗的制剂)。
[0225]
如本文所使用的表述“fc-融合蛋白”是指至少包括含fc的抗体片段—即包含至少一个fc区域的免疫球蛋白衍生部分—和衍生自第二非免疫球蛋白的部分的蛋白质。含fc的抗体片段形成fc-融合蛋白的一部分，由此掺入至fc-融合蛋白中。含fc的抗体片段可以衍生自上文所描述的抗体，特别是衍生自igg，例如igg1、igg2、igg3、igg4。优选地，含fc部分衍生自igg1蛋白，更优选衍生自人igg1蛋白。非ig蛋白可以是治疗性蛋白，例如衍生自以下的治疗性蛋白：促红细胞生成素(erythropoietin，epo)、诸如thpo结合肽的促血小板生成素(thrombopoietin，thpo)、生长激素、诸如ifnα、ifnβ或ifnγ的干扰素(interferon，ifn)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，pdgf)、诸如il1α或il1β的白细胞介素(interleukin，il)、诸如tgfα或tgfβ的转化生长因子(transforming growth factor，tgf)、或诸如tnfα或tnfβ的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，tnf)，或者衍生自受体的治疗性蛋白、特别是衍生自受体胞外结构域的配体结合片段的治疗性蛋白，例如衍生自分化簇2(cluster of differentiation 2，cd2)、cd4、cd8、cd11、cd14、cd18、cd20、cd22、cd23、cd25、cd33、cd40、cd44、cd52、cd58(lfa3)、cd80、cd86、cd147、cd164、il2受体、il4受体、il6受体、il12受体、表皮生长因子(epidermal growth factor，egf)受体、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)受体、上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，epcam)或细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4
(cytotoxic t-lymphocyte-associated protein 4，ctla4)。fc-融合蛋白的实施例包括贝拉西普阿柏西普利纳西普罗米司亭阿巴他塞(abtacept)(恩瑞舒)、阿法赛特和依那西普(恩利)。
[0226]
本文所使用的术语“癌症”是指哺乳动物中以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。肿瘤包括一个或多个癌细胞。癌症的实施例包括癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。癌症的其他实施例包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃窦癌或胃癌，包括胃肠道癌、胃肠道间质瘤；胰腺癌；成胶质细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；肝细胞瘤；乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾腺癌；肾脏癌或肾癌；前列腺癌；甲状腺癌；以及肝癌。
[0227]
如本文所使用的表述“固相基质”(或同义词“固体支承物”、“固相”或“固相材料”)表征不溶或可通过后续反应变得不溶的材料。固相材料的代表性实施例包括聚合物或玻璃珠、微粒、管、片、板、载玻片、孔和带。
[0228]
如本文所使用的术语“烷基”是指具有1至20个碳原子的直链或支链烃基，优选为甲基或乙基；具有3至20个碳原子的环烷基，优选为5至8个碳原子的环烷基。环烷基可以由单个环构成，但也可以由两个或多个稠环形成。
[0229]
如本文所使用的术语“芳基”是指具有6-14个环碳原子的、单环或多环(例如，双环或三环)4n+2芳环系统(例如，具有在环状阵列中共享的6、10或14个π电子)、且在芳环系统中提供零个杂原子的基团。在一些实施方案中，芳基具有6个环碳原子(例如，苯基)。在一些实施方案中，芳基具有10个环碳原子(例如，诸如1-萘基和2-萘基的萘基)。在一些实施方案中，芳基具有14个环碳原子(例如，蒽基)。如本文所使用的术语“芳基”意在涵盖环系统，其中芳环与一个或多个碳环基或杂环基稠合，其中基团或附接点位于芳环上(在这种情况下，碳原子的数目表示芳环系统中的碳原子的数目)。除非另有说明，否则芳基可以是未取代的(“未取代的芳基”)或由一个或多个(例如，1至5个)取代基取代的(“取代的芳基”)。芳基的非限制性示例包括衍生自苯、萘、蒽、联苯等的基团。
[0230]
如本文所使用的术语“杂芳基”是指在芳环系统中具有环碳原子和1-4个杂原子的、5-14元单环或多环(例如双环、三环)4n+2芳环系统(例如，具有在环状阵列中共享的6、10或14个π电子)的基团，其中各杂原子独立地选自氮、氧和硫。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，如果化合价允许，则附接点可以是碳原子或氮原子。杂芳基多核环系统可以在一个或两个环中包含一个或多个杂原子。如本文所使用的术语“杂芳基”意在涵盖杂芳基环与一个或多个碳环基或杂环基稠合的环系统，其中附接点在杂芳基环上(在这种情况下，环成员的数目表示杂芳基环系统中的环成员的数目)。术语“杂芳基”还意在包括其中杂芳基环与一个或多个芳基稠合的环系统，其中附接点在芳基或杂芳基环上(在这种情况下，环成员的数目表示稠合多核(芳基/杂芳基)环系统中的环成员的数目)。
[0231]
如本文所使用的表述“取代的芳基”是指其中一个或多个氢原子各自独立地由取代基取代的芳基。取代基的非限制性示例包括-z、-r、-or、-sr、-nr2、-nr3、-cz3、-cn、-ocn、-scn、-no2、-c(o)r、-c(o)nr2、-so3、-s(o)2r、-c(s)r、-c(o)or、-c(o)sr，其中各z独立地为卤素(即-f、-cl、-br或-i)，并且各r独立地为-h、-c
1-20
烷基或烷氧基、-c
6-20
芳基或-c
5-14
杂芳
基。上面描述的杂芳基可以类似地被取代。
[0232]“二价亚芳基”的表述是指衍生自如上定义的任选取代的芳基或杂芳基的二价部分，其中两个氢原子由共价键取代，从而允许附接至相邻部分。二价亚芳基型二硫桥(例如，式-s-x
3-s-/-s-x
4-s-的二价基团，其中x3/x4代表二价亚芳基)可以根据本领域已知的技术(参见stefanucci et al.acs med.chem.lett.2017,8,449-454，以及beard et al.bioorg.&med.chem.2018,26,3039-3045)通过侧链-至-侧链环化作用获得。
[0233]
如本文所使用的表述“二价二甲苯基团”是指衍生自二甲苯的三种异构体(即，邻-二甲苯、间-二甲苯、对-二甲苯)中的一个的二价部分，其中各甲基的一个氢原子由共价键取代，从而允许附接至相邻部分。优选地，二价二甲苯基团是二价间-二甲苯基团。二价二甲苯型二硫桥(例如，式-s-x
3-s-/-s-x
4-s-的二价基团，其中x3/x4代表二价二甲苯基团)可以例如在二溴二甲苯的存在下、通过侧链-至-侧链环化作用获得，如在stefanucci等人在acs med.chem.lett.2017,8,449-454中描述的。
[0234]
如本文所使用的表述“二价马来酰亚胺基团”是指衍生自马来酰亚胺的二价部分，其中位置2和位置3处的氢原子中的各自由共价键取代，从而允许附接至相邻部分。二价马来酰亚胺型二硫桥(例如，式-s-x
3-s-/-s-x
4-s-的二价基团，其中x3/x4代表二价马来酰亚胺基团)可以例如在2,3-二溴马来酰亚胺或另一种合适的试剂的存在下、通过侧链-至-侧链环化作用获得，如在kuan等人在chem.eur.j.2016,22,17112-17129中描述的。
[0235]
如本文所使用的表述“二价丙酮基团”是指衍生自丙酮(acetone，ace)的二价部分，其中各甲基的一个氢原子由共价键取代，从而允许附接至相邻部分。二价ace型二硫桥(例如，式-s-x
3-s-/-s-x
4-s-的二价基团，其中x3/x4代表二价ace基团)可以例如在二溴丙酮或二氯丙酮的存在下、通过侧链-至-侧链环化作用获得(例如参见assem et al.angew.chem.int.ed.engl.2015,54(30),8665-8668)。
[0236]
如本文所使用的表述“能够调节x的电子密度和稳定性的基团”是指可以调节(增加或减少)相邻基团(x)的性质(电子密度/稳定性)的基团，例如式(3b)中的部分(f2)。调节基团(m)可以例如通过诱导效应和/或中介效应(参见international union of pure and applied chemistry,compendium of chemical technology,gold book 2012,477-480)向相邻基团吸收或供给电子。优选地，诱导和中介效应可以导致电子密度分布向调节基团的偏移，从而调节相邻基团(例如，f2)的电子密度和稳定性。电子密度的调节可以通过
13
cnmr光谱测定、例如通过测量碳酸盐(酯)基团的碳原子的位移并将其与参考化合物(例如，化合物31)的位移进行比较而确定。碳酸盐(酯)信号的nmr位移变化为更高的ppm值(与参考化合物的位移相比)，表明电子密度降低，因此稳定性降低。碳酸盐(酯)信号的nmr位移变化为更低的ppm值(与参考化合物的位移相比)，表明电子密度增加和稳定性增加。电子密度的所述调节可以用于优化本发明偶联物的反应性和稳定性。
[0237]
根据本发明的实施方案，选择能够调节x的电子密度和稳定性的基团，使得在不存在其他试剂的情况下偶联物对降解(例如，水解)是稳定的，这意味着在当偶联物与浓度为1mg/ml、ph为9的水/dmso(95/5,v/v)混合并在25℃下以500rpm搅拌1小时时，该偶联物表现出如hplc测定的低于50％的降解、优选低于25％的降解、更优选低于10％的降解、特别是低于5％的降解。
[0238]
如本文所使用的表述“吸电子基团”是指可以从与其键合的部分吸收电子的基团
或取代基，即与携带氢原子而不是吸电子基团的相同部分相比，该吸电子基团降低该部分的电子密度。通常吸电子基团包括但不限于氰基、硝基、卤代烷基、羧基、芳基、磺酰基等。吸电子基团可以通过诱导效应和/或中介效应发挥其吸电子效应(如上所示)。如本文所使用的表述“吸电子”意在涵盖这两种含义。吸电子基团/取代基在本领域中是已知的，并且例如由凯里和松德贝里(carey&sundberg)在advanced organic chemistry,part a：structure and mechanisms,4
th edition中描述。
[0239]
如本文所使用的表述“离去基团”是指从被认为是参与特定反应的分子的剩余或主要部分的原子或分子中脱离的原子或基团(可以带电或不带电)，该特定反应例如为亲核取代反应(pure appl.chem.1994,66,1134)。离去基团的示例包括苯硫代酚盐(酯)、酚盐(酯)、羧酸盐(酯)、磺酸盐(酯)。
[0240]
在本描述提及“优选”实施方案/特征的情况下，只要这些“优选”实施方案/特征的组合在技术上有意义，则这些“优选”实施方案/特征的组合也应被视为已公开。
[0241]
下文中，在本发明的说明书和权利要求书中，术语“含有”和“包括”的使用应理解为除了所提及的元素之外，还可以存在其他未提及的元素。然而，作为更受限制的实施方案，这些术语也应被理解为公开了术语“由
……
组成”，这样就不可能存在其他未提及的元素，只要这在技术上有意义。
[0242]
除非另有说明或上下文另有说明，否则对“取代”或“任选取代”的基团的引用应理解为对存在(或任选存在，视情况而定)至少一个选自以下的取代基的引用：f、cl、br、i、cn、no2、nh2、nh-c
1-6-烷基、n(c
1-6-烷基)2、-x-c
1-6-烷基、-x-c
2-6-烯基、-x-c
2-6-炔基、-x-c
6-14-芳基、-x-(具有1-3个选自n、o、s的杂原子的5-14元杂烷基)，其中x代表单键、-(ch2)-、-o-、-s-、-s(o)-、-s(o)
2-、-nh-、-co-或它们的任何组合，包括例如-c(o)-nh-、-nh-c(o)-。取代基的数目没有特别限制、并且可以在1至可以由取代基饱和的最大价数的范围内。取代基的数目典型地为1、2或3，通常为1或2，最典型地为1。
[0243]
除非另有说明，否则本文描述的化合物或部分的单个原子的所有化合价都是饱和的。特别地，它们被所示的结合配偶体饱和。如果未示出结合配偶体或结合配偶体的数量太少，则各个原子的剩余化合价被相应数量的氢原子饱和。
[0244]
除非另有说明，否则手性化合物和部分可以以纯立体异构体的形式或以立体异构体的混合物的形式存在，包括50:50的外消旋体。在本发明的上下文中，对特定立体异构体的引用应理解为对化合物或部分的引用，其中指定立体异构体以至少90％对映体过量(enantiomeric excess，ee)、更优选至少95％ee和最优选100％ee的形式存在，其中，％ee定义为(r-s)/(r+s)*100％，其中r和s表示各自对映体的摩尔量。
[0245]
除非另有说明或上下文另外规定，否则相邻氨基酸基团之间的所有连接均由肽(酰胺)键形成。
[0246]
除非上下文另有规定，和/或本文明确规定了替代含义，否则所有术语意旨具有本领域公认的含义，如iupac gold book(2019年11月1日状态)或dictionary of chemistry,oxford,6
th ed.所示。
[0247]
2.概述
[0248]
本发明是基于以下令人惊讶的发现：有效负载与抗体或抗体片段的区域选择性附接可以使用本发明的化合物来完成，更具体地，所述区域选择性附接可以在一个单一步骤
中完成，例如无需进一步的化学反应来裂解载体、与抗体或抗体片段之间的共价键。
[0249]
3.式(1)的化合物
[0250]
本发明涉及由通式(1)表示的化合物：
[0251]
p-y-s-v
ꢀꢀ
(1)
[0252]
式(1)的化合物包含载体v、间隔物s、反应性部分y和有效负载p，该载体v能够与抗体或其片段的fc-区域相互作用(具有对fc-区域的结合亲和力)，所述抗体片段任选地掺入fc-融合蛋白中，间隔物s具有长度z。
[0253]
3.1有效负载(p)
[0254]
待使用的有效负载没有特别限制，并且只要它可以附接至反应性部分，就可以使用任何例如标记和/或药学上活性的分子。
[0255]
根据一个实施方案，有效负载包含选自以下的部分、以及所述部分的放射性同位素和/或所述部分的药学上可接受的盐：
[0256]
(i)选自以下的部分：
[0257]
·
标记部分，该标记部分包括放射性核素，优选螯合剂，诸如1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、环己基二亚乙基三胺五乙酸(ch-x-dtpa)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(pcta)或去铁胺(dfo)，其中所述螯合剂任选地螯合放射性核素；
[0258]
·
发色团；
[0259]
·
荧光团，诸如荧光素或罗丹明；以及
[0260]
·
含有放射性核素(诸如
125
i、
123
i、
131
i、
18
f、
11
c、
15
o、
18
f)的标记部分，例如，衍生自含有放射性核素(诸如，
125
i、
123
i或
131
i)的4-羟基苯丙酸酯(又名博尔顿亨特(bolton-hunter)试剂)的部分；
[0261]
(ii)选自包含偶联基团的部分的部分，从而允许稍后附接如本文项目(i)和(iii)指定的有效负载。这可以是选自由以下组成的组的部分：任选取代的共轭二烯、任选取代的四嗪、任选取代的炔烃或叠氮化物、任选取代的二苯并环辛炔(dbco)、任选取代的反式-环辛烯(tco)、任选取代的双环[6.1.0]壬炔(bcn)、任选取代的醛、任选取代的酮、和任选取代的肼；
[0262]
(iii)衍生自选自以下的药物的部分
[0263]
·
抗肿瘤剂，诸如为dna-烷化剂，该dna-烷化剂例如为多卡霉素(duocarmycin)；
[0264]
·
拓扑异构酶抑制剂，例如多柔比星；
[0265]
·
rna-聚合酶ii抑制剂，例如α-鹅膏蕈碱；
[0266]
·
dna裂解剂，例如卡利奇霉素(calicheamicin)；
[0267]
·
抗有丝分裂剂或微管干扰剂，例如紫杉烷、澳瑞他汀或美登醇(maytansinoid)；
[0268]
·
抗代谢物；
[0269]
·
激酶抑制剂，例如帕他色替(ipatasertib)；
[0270]
·
免疫调节剂；
[0271]
·
抗感染性疾病剂；
[0272]
根据一个实施方案，其中有效负载是任选螯合放射性核素的螯合剂，该螯合剂优选是衍生自以下的部分：二乙三胺五乙酸(dtpa)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1
(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(pcta)、环己基二亚乙基三胺五乙酸(ch-x-dtpa)、去铁胺(dfo)、1-(1,3-羧基丙基)-4,7-羧基甲基-1,4,7-四乙酸(nodaga)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-戊二酸-4,7,10-三乙酸(dotaga)、2,2'-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸盐(酯)(no2a)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(nota)、乙二胺四乙酸(edta)、乙二胺二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸(ttha)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(cyclam)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(teta)、1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸(cb-te2a)、2,2',2
”‑
(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(do3am)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,7-二乙酸(do2a)、1,5,9-三氮杂环十二烷(tacd)、(3a1s,5a1s)-十氢-3a,5a,8a,10a-四氮杂芘(顺-乙二醛-环拉胺)、1,4,7-三氮杂环壬烷(tacn)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(轮环藤宁(cyclen))、三(羟基吡啶酮)(thp)、3-(((4,7-双((羟基(羟甲基)磷酰基)甲基)-1,4,7-三唑烷-1-基)甲基)(羟基)磷酰基)丙酸(nopo)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(pcta)、2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酸(trita)、2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(tritam)、2,2',2
”‑
(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(tritram)、反式-n-二甲基环拉胺、2,2',2
”‑
(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(notam)、氧环拉胺、二氧环拉胺、1,7-二氧杂-4,10-二氮杂环十二烷、交联桥环拉胺(cb-环拉胺)、三氮杂环壬烷亚膦酸盐(酯)(trap)、双吡哆酸基二磷酸盐(酯)(dpdp)、内消旋-四(4-磺酰基苯基)卟吩(tpps4)、亚乙基双羟基苯基甘氨酸(ehpg)、六亚甲基二胺四乙酸、二甲基膦基甲烷(dmpe)、亚甲基二磷酸、二巯基琥珀酸(dmpa)或其衍生物。
[0273]
根据一个优选实施方案，有效负载是任选螯合放射性核素的螯合剂，该螯合剂是衍生自dtpa、dota、dfo、nota、pcta、ch-x-dtpa、nodaga或dotaga的部分，优选衍生自dtpa、dota、dfo、nota、pcta、ch-x-dtpa或nodaga的部分，更优选衍生自dtpa、dota、dfo或pcta的部分。最优选地，螯合剂是dtpa。
[0274]
根据一个实施方案，螯合剂螯合放射性核素，该放射性核素选自
124
i、
131
i、
86
y、
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lu、
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64
cu、
177
lu、
68
ga和
99m
tc，特别是
111
in。
[0275]
在一个优选实施方案中，有效负载是螯合
111
in的dtpa。
[0276]
在另一个优选实施方案中，有效负载选自：
[0277]
·
衍生自螯合
111
in的dota、pcta、dtpa或ch-x-dtpa的部分(i)，最优选为螯合
111
in的ch-x-dtpa；
[0278]
·
衍生自螯合
64
cu的nota、nodaga或pcta的部分(i)，最优选为螯合
64
cu的nota；
[0279]
·
衍生自螯合
89
zr的dota、dfo、dfo'或dfo-cyclo'的部分(i)，最优选为螯合
89
zr的dfo。
[0280]
根据一个实施方案，有效负载是选自包含偶联基团的部分的部分，从而允许稍后附接如本文项目(i)和(iii)中指定的有效负载。这可以是包含适合于“点击化学”的偶联基团的部分，该“点击化学”通过与包含“点击化学”配偶体基团的另一个部分(即，包含偶联配
偶体基团的有效负载)反应来快速且可靠地产生共价键，例如，经由应变促进的环加成、[2+3]偶极环加成或狄尔斯-阿尔德(diels-alder)环加成。
[0281]
在一个实施方案中，该部分是选自由以下组成的组的、包含偶联基团部分的部分：任选取代的共轭二烯、任选取代的四嗪、任选取代的炔烃或叠氮化物、任选取代的二苯并环辛炔(dbco)、任选取代的反式-环辛烯(tco)、任选取代的双环[6.1.0]壬炔(bcn)、任选取代的醛、任选取代的酮、以及任选取代的肼。
[0282]
在一个实施方案中，该部分是包含偶联基团的部分，所述偶联基团可以在不存在金属催化剂(“无金属”)的情况下反应形成共价键，例如becer等人在“click chemistry beyond metal-catalysed cycloaddition”angewandte chemie int.ed.2009,48(27),4900-4908”中描述的。可以在不存在金属催化剂的情况下反应的偶联基团的示例包括缺电子炔烃、应变炔烃，诸如环辛炔、四嗪和叠氮化物。优选地，该部分是包含选自以下的偶联基团的部分：叠氮化物(n3)、tz、tco、bcn和dbco，更优选为bcn或dbco，最优选为dbco。
[0283]
根据一个实施方案，有效负载是衍生自药物的部分。下文是可以在本发明的化合物中作为有效负载使用的示例性药物：
[0284]
(a)诸如dna-烷化剂的抗肿瘤剂，例如多卡霉素(包括合成类似物：阿多来新、卡折来新、比折来新、kw-2189和cbi-tmi)，氮芥类似物(例如，环磷酰胺-苯丁酸氮芥、美法仑、双氯乙基甲胺、异环磷酰胺、曲洛磷胺、泼尼莫司汀、苯达莫司汀、萘氮芥、雌莫司汀、二氯甲基二乙胺、氧化二氯甲基二乙胺盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、甘露莫司汀、二溴卫矛醇、新恩比兴、苯芥胆甾醇、乌拉莫司丁)，烷基磺酸盐(例如，白消安、苏消安、甘露舒凡、英丙舒凡和哌泊舒凡)，乙烯亚胺(例如，噻替派、三亚胺醌、卡巴醌)；亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、氯脲霉素、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀)、环氧化物(例如，依托格鲁)、其他烷基化剂(例如，二溴甘露醇、哌泊溴烷、替莫唑胺、达卡巴嗪)；
[0285]
(b)拓扑异构酶抑制剂，例如多柔比星、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星、脱氧多柔比星、依托泊苷、磷酸依托泊苷、伊立替康及其代谢物(诸如，sn-38、替尼泊苷、托泊替康、白藜芦醇、表鬼臼毒素(epipodophyllin)(例如，9-氨基喜树碱、喜树碱、克立那托(crisnatol)、道诺霉素、米托蒽醌、诺凡特酮、维甲酸(视黄醇)、9-硝基喜树碱(rfs 2000)))；
[0286]
(c)rna聚合酶ii抑制剂，例如α-鹅膏蕈碱、其他鹅膏蕈碱；
[0287]
(d)dna裂解剂，例如卡利奇霉素；
[0288]
(f)抗有丝分裂剂或微管破坏剂，例如长春花生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、温诺平(navelbin)、长春氟宁(vinflunide)、长春福肽(vintafolide))；紫杉烷类(例如，紫杉醇、多西他赛、多聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel polyglumex)、卡巴他赛)及其类似物；美登素生物碱(例如，dm1、dm2、dm3、dm4、美登素和安丝霉素)及其类似物；隐藻素(cryptophycins)(例如，隐藻素1和隐藻素8)；埃博霉素、软珊瑚醇(eleutherobin)、圆皮海绵内酯(discodermolide)、草苔虫素(bryostatin)、耳状截尾海兔毒素(dolostatin)、澳瑞他汀(例如，单甲基澳瑞他汀e、单甲基澳瑞他汀f)、微管溶素、赛法洛他汀(cephalostatin)；水鬼蕉硷、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵他汀(spongistatin)、地美可辛、丝裂霉素；
[0289]
(f)抗代谢物，例如dhfr抑制剂(例如，甲氨蝶呤、三甲曲沙、二甲叶酸、蝶罗呤、氨基蝶呤(4-氨基蝶酸)或其他叶酸类似物，诸如雷替曲塞、培美曲塞、普拉曲沙)；imp脱氢酶抑制剂(例如，霉酚酸、噻唑呋林、利巴韦林、eicar)；核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如，羟基脲、去铁胺)；嘧啶类似物(例如，阿糖胞苷、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶及其代谢物、喃氟啶、卡莫氟、吉西他滨、卡培他滨、阿扎胞苷、地西他滨、氟尿嘧啶组合物、喃氟啶组合物、三氟尿苷组合物、胞嘧啶阿拉伯糖苷、安西他滨、氟尿苷、去氧氟尿苷)、尿嘧啶类似物(例如，6-氮杂尿苷、脱氧尿苷)；胞嘧啶类似物(例如，依诺他滨)；嘌呤类似物(例如，咪唑硫嘌呤、氟达拉滨、巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、氯法拉滨、奈拉滨)；叶酸补充剂，诸如叶酸；
[0290]
(g)激酶抑制剂，例如伊帕替尼(ipatasertib)、bibw 2992(抗egfr/erb2)、伊马替尼、吉非替尼、哌加他尼、索拉非尼、达沙替尼、舒尼替尼、埃罗替尼、尼罗替尼、拉帕替尼、阿昔替尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿法替尼、维莫非尼、克唑替尼、瑞格拉非尼、马赛替尼、达拉菲尼、曲美替尼、依鲁替尼、色瑞替尼、乐伐替尼、尼达尼布、西地尼布、帕博西尼、奥希替尼、艾乐替尼(alectinib)、艾乐替尼、鲁卡帕尼(rociletinib)、考比替尼、米哚妥林、奥美替尼、e7080(抗-vegfr2)、莫立替尼(mubritinib)、帕纳替尼(ap24534)、巴氟替尼(inno-406)、博舒替尼(ski-606)、卡博替尼、维莫德吉(vismodegib)、伊尼帕布(iniparib)、鲁索替尼、cyt387、替沃扎尼(tivozanib)、伊斯平斯(ispinesib)、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司、地磷莫司(ridaforolimus)；
[0291]
(h)免疫调节剂，其包括免疫刺激剂、免疫抑制剂、环孢霉素、环孢霉素a、氨基己酸、咪唑硫嘌呤、溴隐亭、苯丁酸氮芥、氯喹、环磷酰胺、皮质类固醇(例如，安西奈德、倍他米松、布地奈德、氢化可的松、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、氟考龙达那唑(fluocortolone danazol)、地塞米松、强的松、曲安奈德、丙酸倍氯米松)、dhea、羟化氯喹、美洛昔康、甲氨蝶呤、莫非替利(mofetil)、麦考酚酸酯(mycophenylate)、西罗莫司、他克莫司、依维莫司、芬戈莫德、依鲁替尼；
[0292]
(i)抗传染病药物，包括抗菌药物、抗分支杆菌药物和抗病毒药物。在抗生素-抗体药物偶联物中使用的抗生素的非限制性实施例是利福霉素(rifalogue)衍生物，雷帕霉素(rafamycin)衍生物。
[0293]
根据一个实施方案，有效负载是衍生自以下的部分、或所述部分的放射性同位素和/或所述部分的药学上可接受的盐：依喜替康、pnu-159682、(α-)鹅膏蕈碱、多卡霉素、澳瑞他汀、美登素、微管溶素、卡利奇霉素、sn-38、紫杉醇、道诺霉素、长春碱、多柔比星、甲氨蝶呤、吡咯并苯并二氮杂卓，吡咯类驱动蛋白纺锤体蛋白(ksp)抑制剂、吲哚啉-苯并二氮杂卓二聚体。
[0294]
在本发明的一些方面，优选使用具有一定程度亲水性的有效负载，例如，在螯合放射性核素的螯合剂的情况下，以避免和/或防止可能的聚集现象。例如，可以通过添加/增加/存在于抗体与有效负载之间的接头的peg单元的数量来克服高聚集现象。
[0295]
有效负载与反应性基团的这种附接可以通过联结基团(或“接头”)进行。在本公开的上下文中，该联结基团可以被认为是有效负载的一部分。因此，在一个实施方案中，有效负载由下式(2)表示：
[0296]
p
1-l
‑‑
*'
ꢀꢀ
(2)
[0297]
其中，
[0298]
p1表示如上文所述的有效负载-例如任选螯合放射性核素的螯合剂(诸如
177
lu-dota)，或衍生自药物的部分，
[0299]
l表示接头，
[0300]
*'指代共价附接至反应性部分。
[0301]
接头是二价基团，优选包含选自碳、氮、氧和硫的一个或多个原子。
[0302]
在一个实施方案中，接头可以选自
[0303]
(a1)具有1至12个碳原子数的亚烷基，优选具有2至6个碳原子数的亚烷基，诸如亚乙基、亚丙基；
[0304]
(b1)具有2或3个碳原子且具有1至36个重复单元的聚环氧烷基；优选由式-nh-(ch2ch2o)
n1
–
ch2ch2–
表示的基团，其中n1是0至35的整数，例
[0305]
如1至20的整数；以及
[0306]
(c1)具有2至12个氨基酸的肽基团。
[0307]
在更具体的实施方案中，接头选自
[0308]
(a1)具有2至6个碳的亚烷基(-(ch2)
2-6-)；
[0309]
(b1)式-nh-(ch2ch2o)
n1-ch2ch
2-的聚亚烷基，n1为0至35的整数；以及
[0310]
(c1)包含2至12个氨基酸的肽接头，氨基酸任选地是可裂解的，优选地为包含val-cit单元、val-ala单元、val-cit-pabc或val-cit-pabc-dmea单元的可裂解肽接头。
[0311]
接头可以是可裂解的或不可裂解的接头。在一个实施方案中，接头是不可裂解的接头。在另一实施方案中，接头是可裂解的接头。
[0312]
可裂解的接头可以是能够在靶细胞内化时特异性释放有效负载的接头。它可以利用靶细胞(例如，癌细胞)的固有特性来选择性地从修饰抗体或修饰抗体片段释放有效负载，即(1)蛋白酶敏感性(酶触发释放接头系统)，(2)ph敏感性，(3)谷胱甘肽敏感性，或(4)葡萄糖苷酸酶敏感性。在具体实施方案中，接头是包含缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)或缬氨酸-丙氨酸(val-ala)二肽的可裂解接头，该可裂解接头可以用作组织蛋白酶b(cathepsin b，cat b)细胞内裂解的底物。
[0313]
在另一具体实施方案中，接头是可裂解接头，该可裂解接头包含能够通过消除类或环化类机制释放有效负载的自消耗(self-immolative)部分。包含自消耗部分的可裂解接头的示例是对-氨基苄氧羰基(para-amino benzyloxycarbonyl，pabc)接头，如在本妥昔单抗偶联物单抗偶联物中使用的(younes et al.n.engl.j.med.2010,363,1812-1821；jain et al.pharm.res.2015,32(11),3526
–
3540)。含有pabc的接头包含蛋白酶敏感性val-cit-pabc二肽接头单元，该接头单元可以由cat b识别和裂解。该接头单元可以通过马来酰亚胺丙酰基部分(以及在抗体修饰至抗体后)附接至反应性部分。这种接头可以帮助避免由cat b在底物识别中的空间冲突。瓜氨酸-pabc酰胺键的酶促裂解后，得到的pabc-取代的有效负载自发地经历1,6-消除，该1,6-消除将自由有效负载作为产品释放至靶细胞中。因此，根据式(2)的基团可以表示本妥昔单抗，即，由衍生自单甲基澳瑞他汀e的有效负载部分组成的基团，该基团通过包含val-cit-pabc单元的接头附接至反应性部分。
[0314]
在另一具体实施方案中，接头是包括c端二肽单元的可裂解接头，该可裂解接头能够用作cat b的肽链端解酶活性(exo-cat b)的高特异性底物。exo-cat b-可裂解接头系统
的示例在wo 2019/096867 a1中进行描述。特别地，接头l可以包含如wo 2019/096867 a1的权利要求1、2或3所定义的c-端二肽单元(“axx-ayy”或“ayy-axx”)。
[0315]
3.2反应性部分(y)
[0316]
本发明的化合物包含可以与暴露于抗体或抗体片段表面的氨基酸侧链反应(例如，通过亲核取代反应)的反应性部分(y)。优选地，反应性部分能够与侧链赖氨酸反应。该反应使得有效负载(p)共价附接至所述抗体或抗体片段，同时释放间隔物(s)和载体(v)。当反应性部分(y)与暴露在抗体或抗体片段表面的氨基酸的侧链反应形成共价键时，y内、或y与s之间的共价键自发裂解以释放肽(无需进一步的化学反应，诸如水解或还原)。
[0317]
反应性部分包含反应中心(reactive center，rc)，该反应中心例如通过亲核取代反应能够与氨基酸的侧链反应，优选与赖氨酸残基的侧链反应。优选地，反应中心是亲电的。能够与氨基酸侧链反应的亲电反应中心的非限制性示例包括c＝o和c＝s。优选的反应中心是羰基(c＝o)或硫代羰基(c＝s)，特别优选的是羰基(c＝o)。
[0318]
共价附接至反应中心一侧的是部分(f1)，反应中心(rc)通过该部分(f1)附接至有效负载(p)，共价附接至反应中心的另一侧的是部分(f2)，反应中心(rc)通过该部分(f2)经由间隔物(s)附接至载体(v)。因此，反应性部分(y)可以由下式(3a)表示：
[0319]
**
‑‑
f1-rc-f2
‑‑
*
ꢀꢀ
(3a)
[0320]
其中，
[0321]
rc是反应中心，优选为亲电反应中心，更优选为选自c＝o和c＝s的基团，最优选c＝o；
[0322]
f1代表单个共价键、原子或原子基团；优选为选自o和s的原子，或包含选自c、n、o和s的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自o和s的原子；
[0323]
f2代表原子，或原子基团；优选为选自o和s的原子，或包含选自c、n、o和s的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自o和s的原子；
[0324]
**指代附接至有效负载(p)，并且
[0325]
*指代附接至间隔物(s)。
[0326]
f1和f2可以是相同的原子或原子基团。然而，优选地，构成f2的原子或原子基团为使其在亲核取代反应中成为比f1更好/优选的离去基团。这确保了当反应中心通过亲核取代反应与抗体或抗体片段上的氨基酸残基的侧链(例如，与赖氨酸残基的侧链)反应时，f2是优选的离去基团；使得有效负载附接至抗体或抗体片段，而不是载体/间隔物构建体。
[0327]
根据一个实施方案，式(3a)的反应性部分由下式(4a)至(4m)中的一个表示
[0328][0329]
其中**指代附接至有效负载(p)，*指代附接至间隔物(s)。
[0330]
为了确保f2在亲核取代反应中是比f1更好或更优选的离去基团，特别是如果f1和f2是相同的原子或原子基团，f2可以链接至修饰基团(m)，其中m是例如吸收或供给电子、能够调节相邻部分f2的电负性和/或稳定性的基团。
[0331]
因此，在实施方案中，反应性部分(y)由下式(3b)表示：
[0332]
**
‑‑
(f1-rc-f2)-(m)
‑‑
*
ꢀꢀ
(3b)
[0333]
其中，rc、f1、f2、**、*如上式(3a)中所定义的，m表示能够调节f2的电子密度和稳定性的基团，优选能够吸收电子的基团。
[0334]
在实施方案中，m由下式(3c)表示：
[0335]
***'
‑‑
m'—b—c
‑‑
*
ꢀꢀ
(3c)
[0336]
其中，
[0337]
m'是分别具有6元环、10元环或14元环和1个、2个或3个稠环的芳基，或具有5至20元环、1个、2个或3个稠环和独立地选自n、o和s的、1至4个杂原子的杂芳基，m'可以由一个或多个取代基取代；优选为可以由一个或多个取代基取代的苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基或苯并三唑基，各取代基优选选自-f、-br、-cl、-i、-no2、-cn、-c
1-6-烷基、-c
1-6-烷氧基、诸如-c(o)nh2的-c
1-6-氨基、及它们的组合诸如-ccl3、-cf3或-ch2no2；
[0338]
b为单个共价键、o、s、nr'，其中r'表示氢原子、oh、烷基或环烷基、c
2-6-亚烯基、c
2-6-亚炔基、具有以下通式的基团或它们的任何组合：
[0339]
–
(ch2)
n1-(h1)
x1-(ch2)
n2-(h2)
x2-(ch2)
n3-(h3)
x3-(ch2)
n4
‑ꢀꢀ
(3c')
[0340]
其中，
[0341]
n1、n2、n3和n4中的每个表示独立地选自0至10的整数，使得n1+n2+n3+n4为10或更小，
[0342]
x1、x2和x3中的每个独立地选自0和1，并且
[0343]
h1、h2和h3中的每个为独立地选自n、o和s的原子，
[0344]
条件是，如果x1+x2＝2，则n2≥1，如果x2+x3＝2，则n3≥0，如果x1+x3＝2，则n2≥1或n3≥1，如果x1+x2+x3为3，则n2≥1且n3≥1；
[0345]
b优选为单个共价键、nh或c
1-10-亚烷基；更优选为单个共价键；
[0346]
c是c＝o、c＝s、c(nr”)其中r”表示氢原子、oh、烷基或环烷基、s(＝o)或s(＝o)2；优选为c＝o；
[0347]
*指代共价附接至间隔物(s)；并且
[0348]
***'指代共价附接至f2。
[0349]
根据一个实施方案，在式(3b)中，部分(f1-rc-f2)由式(4a')至(4m')中的一者表示、和/或m独立地由下式(5a)至(5j')中的一者表示：
[0350]
[0351]
[0352][0353]
其中*指代共价附接至间隔物(s)，**指代共价附接至有效负载(p)，***指代共价附接至修饰基团(m)，***'指代共价附接至f2。
[0354]
在优选的实施方案中，反应性部分由下式(6a)至(6l')中的一者表示：
[0355]
[0356]
[0357]
[0358][0359]
其中*指代共价附接至间隔物(s)，**指代共价附接至有效负载(p)。
[0360]
最优选地，反应性部分由式(6a)、(6b)和(6m)中的一个表示，特别是由式(6a)表示。
[0361]
3.3间隔物(s)
[0362]
本发明的化合物包含具有长度z的间隔物(s)，其中长度z是使得当载体与抗体或其片段的fc区域相互作用时、反应性部分能够与暴露于抗体或抗体片段表面的氨基酸残基的侧链反应、使得有效负载(和任选的接头)区域选择性附接至抗体或抗体片段的长度。间隔物通过载体化学结构的官能团(例如，氨基、羧基)连接至载体(v)。如果载体是肽，则间隔物附接至肽的n端或c端(如下文进一步描述)。例如，间隔物可以附接至多肽骨架的n端或c端处的氨基或羧基官能团，或附接至n端或c端氨基酸侧链。特别是在非肽载体分子的情况下，优选识别间隔物(s)的附接点，使得与没有附接间隔物的载体相比、结合亲和力(表示为kd)没有显著降低(《20％)。
[0363]
长度z是指间隔物在其天然构象中的长度(不是其最大拉伸长度)。当间隔物链接到载体和作为本发明的反应性偶联物的构建体的一部分的反应性部分时，可以采用天然构象。
[0364]
长度z的合适长度可以通过使用计算机建模(购自chemical computing group的分子操作环境(molecular operating environment，moe))或x射线晶体学来确定，以计算抗体或其片段的fc结构域上载体的结合位点与靶氨基酸之间的、以埃为单位的近似距离，该靶氨基酸例如为赖氨酸或半胱氨酸残基，最优选赖氨酸。在聚合物的情况下，长度z可以通过应用如下面将进一步描述的蠕虫状链(worm-like-chain，wlc)模型来确定。分辨率为的fc-iii/fc-区域复合物的三维结构可以在pdb标识符1dn2下获得(delano et al.science 2000,vol.287,no.5456,1279-1283)。
[0365]
在一个实施方案中，长度z为13至优选14至更优选16至
[0366]
发明人认为，长度z在13至的范围内(如上所述)可能会导致在抗体或抗体片段的fc区域(抗体中高度保守的区域，特别是igg抗体)上氨基酸的靶向，例如在位置317、326、338、340和439处(特别是在位置317和/或326处)发现的一个或多个赖氨酸残基，并且长度z在13至的范围内可能导致反应性部分的反应和具有高度区域选择性的有效负载
的附接。在实施方案中，如果有效负载负载比fc/f(ab)2大于1.0、大于1.5、大于2.0、特别是大于2.5，则实现了高度的区域选择性。区域选择性的程度可以通过测量fc与f(ab)2区域之间的有效负载负载比(选择性fc/f(ab)2)来确定，如下面将进一步描述的。
[0367]
间隔物可以是具有前述长度z的、能够链接载体和反应性部分的任何基团。优选间隔物是化学惰性的。
[0368]
在一个实施方案中，间隔物优选地选自
[0369]
(a2)具有6至36个重复单元、例如具有8至24个重复单元的聚环氧烷基团；
[0370]
优选为下式(7)表示的基团：
[0371]
–
x1–
(ch2ch2o)
n2
–
ch2ch2–
x2–ꢀꢀ
(7)
[0372]
其中，
[0373]
x1为nh、o或s；优选nh；
[0374]
x2为nh或c＝o，如果x2共价结合至载体，则x2优选为c＝o；并且
[0375]
n2为4至28的整数，优选为6至20的整数、更优选为8至12的整数、特别是10；
[0376]
(b2)肽基团，该肽基团在主链中具有6至25个氨基酸，例如在主链中具有9个氨基酸，各氨基酸优选选自pro、gly、ala、asn、asp、thr、glu、gln和ser；更优选为pro、gly或ser。
[0377]
在式(7)中，在一些实施方案中，x2共价结合至载体，x1共价结合至反应性部分；在一些其他实施方案中，x1共价结合至载体，x2共价结合至反应性部分。在一些具体实施方案中，间隔物与载体的附接点、以及x1和x2各自独立地选择，使得与载体的附接形成酰胺键。例如，如果载体通过n端(即，通过n端氨基酸的氨基)附接至间隔物，则x2可以选择为c＝o，并且如果载体通过c端(即，通过c端氨基酸的羧基)附接至间隔物，则x1(或x2)可以选择为nh。
[0378]
根据一个实施方案，间隔物包含具有4至36个重复单元、优选6至28个重复单元、更优选7至24个重复单元、例如10或20个重复单元的聚环氧乙烷基团。最优选间隔物包含具有10个重复单元的聚氧化乙烯基。
[0379]
3.4载体(v)
[0380]
本发明的化合物包含能够与抗体或其片段的可结晶片段(fc)区域相互作用(结合)的载体(v)(或“配体”)，该抗体片段任选掺入fc-融合蛋白中。载体与fc区域的相互作用使得暴露在抗体或抗体片段表面的氨基酸侧链附近的反应性部分的浓度增加，从而使得有效负载共价附接至侧链。在一些方面，载体与fc区域的相互作用引起靶向作用，因为反应性部分将与暴露于抗体或抗体片段表面的特定氨基酸的侧链(例如，位置317处的氨基酸残基)反应，使得有效负载区域选择性地附接至抗体或抗体片段。
[0381]
能够与抗体或其片段的fc区域相互作用的载体是本领域已知的，并且例如在choe等人，materials 2016,9,994中描述的。合适的载体也在wo 2018/199337a1中公开。能够与抗体或其片段的fc区域相互作用的载体的非限制性示例包括蛋白质z和fc-iii。特别是环肽fc-iii已被描述为对igg蛋白的fc区域具有高亲和力的肽载体/配体，报道的解离常数kd为约16nm(delano et al.science 2000,287,1279-1283)。
[0382]
在一个实施方案中，在本发明的化合物中使用的载体是包含11至17个氨基酸、优选13至17个氨基酸的序列的肽。在一些具体实施方案中，间隔物通过其n端或c端附接至载体(即附接至前述肽序列)。在一些更具体的实施方案中，载体不进行进一步修饰，以将间隔物附接至n端或c端。
[0383]
根据一个优选的实施方案，载体是由下式(8a)和(8b)中的一者表示的肽：
[0384][0385]
其中，
[0386]
bxx、cxx、dxx、exx、fxx中的每个独立地表示氨基酸；
[0387]
axx表示氨基酸、二羧酸或由下式(9a)表示的肽部分：
[0388]
‑‑‑
axx1
–
axx2
–
axx3
‑‑‑ꢀꢀ
(9a)
[0389]
其中，
[0390]
axx1表示单个共价键或氨基酸，诸如arg；
[0391]
axx2表示氨基酸，诸如为gly或cys；并且
[0392]
axx3表示氨基酸，诸如为asp或asn；
[0393]
gxx表示氨基酸或由下式(9b)表示的肽部分：
[0394]
‑‑‑
gxx1
–
gxx2
–
gxx3
‑‑‑ꢀꢀ
(9b)
[0395]
其中，
[0396]
gxx1表示氨基酸，诸如为thr；
[0397]
gxx2表示氨基酸，诸如为tyr或cys；并且
[0398]
gxx3表示单个共价键或氨基酸，诸如his；
[0399]
并且式(9a)中axx2的侧链可以共价结合至式(9b)中gxx2的侧链以形成环；如果axx2为cys、且gxx2为cys，则优选将axx2和gxx2的侧链链接在一起以形成式
–
(s
–
x4–
s)
–
的基团，其中x4表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或多个原子的二价基团，诸如二价马来酰亚胺基、二价丙酮基或二价芳基(例如，二价二甲苯基)。优选地，x4表示单个共价键。
[0400]
hxx表示单个共价键或三官能氨基酸，诸如二氨基羧酸。
[0401]
z1表示：
[0402]
·
如果hxx为单个共价键，则z1表示共价结合至gxx的c端的基团，该基团选自-n(h)(r)，其中r表示氢原子、烷基或环烷基，以及衍生自含有偶联基团的化合物的部分，该偶联基团选自生物素、dbco、tco、bcn、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇；
[0403]
·
如果hxx为三官能氨基酸、且y'结合至hxx的侧链，则z1表示共价结合至hxx的c端的基团，该基团优选为n(h)(r)，其中如果z1共价结合至hxx的c端，则r表示氢原子、烷基或环烷基；或者
[0404]
·
如果hxx为三官能氨基酸、且y'结合至hxx的c端，则z1表示结合至hxx的侧链的
氢原子。
[0405]
z2表示：
[0406]
·
如果hxx为单个共价键，则z2表示共价结合至axx的n端的基团，该基团选自氢原子、诸如乙酰基的含羰基基团和诸如生物素的含有偶联部分的基团；
[0407]
·
如果hxx是三官能氨基酸、且y'结合至hxx的侧链，则z2表示共价结合至hxx的n端的基团，该基团选自氢原子和诸如乙酰基的含羰基基团；或者
[0408]
·
如果hxx为三官能氨基酸、且y'结合至hxx的n端，则z2表示结合至hxx的侧链的氢原子。
[0409]
如果hxx为三官能氨基酸，则仅存在y'；且
[0410]
·
如果z1结合至式(8a)中hxx的c端，或如果z2结合至式(8b)中hxx的n端，则y'代表共价结合至hxx侧链的部分；
[0411]
·
如果z1结合至式(8a)中hxx的侧链，则y'代表共价结合至hxx的c端的部分；
[0412]
·
如果z2结合至式(8b)中hxx的侧链，则y'代表共价结合至hxx的n端的部分；
[0413]
·
y'衍生自含有偶联基团的化合物，该偶联基团优选选自生物素、dbco、tco、bcn、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇。
[0414]
x3表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或多个原子的二价基团，该二价基团诸如为二价马来酰亚胺基、二价丙酮基或二价亚芳基(例如，二价二甲苯基)。优选地，x3表示单个共价键。
[0415]
****指代共价附接至间隔物(s)。
[0416]
在实施方案中，部分y'由下式(9c)表示：
[0417]y1-l1‑‑
****
’ꢀꢀ
(9c)
[0418]
其中，
[0419]
y1是衍生自偶联基团的部分，该偶联基团选自生物素、dbco、tco、bcn、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇；
[0420]
l1为二价基团，优选包含选自c、n、o和s的一个或多个原子，更优选包含具有1-12个重复单元(例如，4个重复单元)的聚环氧乙烷基团；并且
[0421]
****'指代共价附接至hxx。
[0422]
接头是二价基团，优选包含选自碳、氮、氧和硫的一个或多个原子。
[0423]
在实施例中，接头l1可以选自
[0424]
(a1)具有1至12个碳原子数的亚烷基，优选具有2至6个碳原子数的亚烷基，诸如亚乙基、亚丙基；
[0425]
(b1)具有2或3个碳原子、且具有1至36个重复单元的聚环氧烷基；
[0426]
优选由式
–
nh
–
(ch2ch2o)
n1
–
ch2ch2–
表示的基团，其中n1是0至35的整数，例如1至20；以及
[0427]
(c1)具有2至12个氨基酸的肽基团。
[0428]
根据一优选的实施方式，式(8a)和(8b)中的axx、bxx、cxx、dxx、exx、fxx、gxx和hxx中的至少一者定义如下：
[0429]
axx表示选自ala、2,3-二氨基-丙酸(2,3-diamino-propionic acid，dap)、asp、glu、2氨基辛二酸、α-氨基丁酸、asn和gln的氨基酸，选自琥珀酸、戊二酸和己二酸的二羧
酸，或式(9a)的肽部分；axx优选为ala、asp或asn，更优选为asp；其中axx1为单个共价键，axx2为cys，并且axx3为asp；
[0430]
bxx表示选自trp、phe、tyr、苯基甘氨酸(phg)、3-苯并噻吩-2-基-l-丙氨酸、3-萘-2-基-l-丙氨酸、3-联苯-4-基-l-丙氨酸和3-萘-1-基-l-丙氨酸的氨基酸；优选为trp；
[0431]
cxx表示选自his、ala、3-吡啶-2-基-l-丙氨酸、间位-酪氨酸(meta-tyrosine，mtyr)和phe的氨基酸；优选为his、ala或mtyr；更优选为his；
[0432]
dxx表示选自ala、abu、gly、leu、ile、val、met、环己基丙氨酸(cyclohexyl alanine，cha)、phe、thr、cys、tyr和正亮氨酸(norleucine，nle)的氨基酸；优选为ala、nle或leu；更优选为leu；
[0433]
exx表示选自ala、gly、asn、ser、abu和asp的氨基酸；优选为ala或gly；更优选为gly；
[0434]
fxx表示选自ala、glu、asp、gln、his、arg、ser和asn的氨基酸；优选为asp或glu；更优选为glu；
[0435]
gxx表示选自thr、ser、ala、asn、val、2-氨基-丁酸(2-amino-butyric acid，abu)、ile、met、leu、pro、gln和cys的氨基酸，或者式(9b)的肽部分；gxx优选为thr或ser；更优选为thr；其中gxx1为thr，gxx2为cys，并且gxx3为单个共价键；
[0436]
hxx表示选自dap、dab、lys、orn和高赖氨酸(homo-lys)的氨基酸，优选选自dap、dab、lys、orn和高赖氨酸的氨基酸；
[0437]
根据一实施方案，能够与抗体或其片段的fc区域相互作用的配体v是由下式(8a')至(8d')中的一者表示的肽：
[0438]
[0439]
在上式(8a')、(8b')、(8c')和(8d')中，z1、z2、x3、x4和****如上文关于式(8a)和(8b)中所描述的。
[0440]
在实施方案中，上式中半胱氨酸残基之间的二硫桥(即式-(s-x
3-s)-或-(s-x
4-s)-的二硫桥)可以各自独立地由适用于侧链-至-侧链环化的二价基团取代(有时称为“半胱氨酸重新桥接”；参见例如stefanucci等人，scientific reports 2019,9:5771)。合适的二价基团的示例包括二价二甲苯基团、二价马来酰亚胺基团、二价含三唑基团、二价含羰基基团(例如，二价丙酮基团)、二价琥珀酰亚胺基团(其可以通过使半胱氨酸侧链与例如芳氧基马来酰亚胺试剂反应而获得；参见marculescu等人，chem.commun.2014,50,7139)，二价硫醚基团(其可以通过使半胱氨酸侧链与例如双砜或烯丙基砜试剂反应而获得；参见brocchini等人，nat.protoc.2006,1,2241-2252)，以及二价哌嗪二酮基团(其可以通过使半胱氨酸侧链与例如二溴哌嗪二酮试剂反应而获得；参见chudamasa等人，chem.commun.2011,47,8781-8783)。特别地，二硫桥可以各自独立地由可通过“点击”化学获得的二价含三唑基团取代。在这种情况下，半胱氨酸残基(在上式中形成桥)可以由具有侧链的氨基酸取代，该侧链含有适合点击化学的官能团，即，炔基或叠氮基，它们可以反应生成二价三唑部分(例如，1,4-二取代-1,2,3-三唑部分)。
[0441]
优选地，载体是由式(8a')或(8b')表示的肽。
[0442]
根据一个实施方案，本发明的化合物是由选自以下的式表示的化合物：v-s
1-(o-(c＝o)-o)-p、v-s
1-(o-(c＝o))-p、v-s
1-(s-(c＝o))-p、v-s
1-(s-(c＝o)-o)-p、v-s
1-(o-(c＝s)-o)-p、v-s
1-(o-(c＝o)-s)-p、v-s
1-(s-(c＝o)-s)-p、v-s
1-(s-(c＝s)-o)-p、v-s
1-(o-(c＝s)-s)-p、v-s
1-(s-(c＝s))-p、v-s
1-(o-(c＝o)-nh)-p、v-s
1-(s-(c＝s)-s)-p、v-s
1-(m-o-(c＝o)-o)-p、v-s
1-(m-o-(c＝o))-p、v-s
1-(m-s-(c＝o))-p、v-s
1-(m-s-(c＝o)-o)-p、v-s
1-(m-o-(c＝s)-o)-p、v-s
1-(m-o-(c＝o)-s)-p、v-s
1-(m-s-(c＝o)-s)-p、v-s
1-(m-s-(c＝s)-o)-p、v-s
1-(m-o-(c＝s)-s)-p、v-s
1-(m-s-(c＝s))-p、v-s
1-(m-o-(c＝o)-nh)-p、v-s
1-(m-s-(c＝s)-s)-p、v-s
1-(o-(c＝o)-o)-l-p1、v-s
1-(o-(c＝o))-l-p1、v-s
1-(s-(c＝o))-l-p1、v-s
1-(s-(c＝o)-o)-l-p1、v-s
1-(o-(c＝s)-o)-l-p1、v-s
1-(o-(c＝o)-s)-l-p1、v-s
1-(s-(c＝o)-s)-l-p1、v-s
1-(s-(c＝s)-o)-l-p1、v-s
1-(o-(c＝s)-s)-l-p1、v-s
1-(s-(c＝s))-l-p1、v-s
1-(o-(c＝o)-nh)-l-p1、v-s
1-(s-(c＝s)-s)-l-p1、v-s
1-(m-o-(c＝o)-o)-l-p1、v-s
1-(m-o-(c＝o))-l-p1、v-s
1-(m-s-(c＝o))-l-p1、v-s
1-(m-s-(c＝o)-o)-l-p1、v-s
1-(m-o-(c＝s)-o)-l-p1、v-s
1-(m-o-(c＝o)-s)-l-p1、v-s
1-(m-s-(c＝o)-s)-l-p1、v-s
1-(m-s-(c＝s)-o)-l-p1、v-s
1-(m-o-(c＝s)-s)-l-p1、v-s
1-(m-s-(c＝s))-l-p1、v-s
1-(m-o-(c＝o)-nh)-l-p1、以及v-s
1-(m-s-(c＝s)-s)-l-p1，其中v、p、p1和l如上所定义，s1为如上所定义的间隔物s，并且其中优选地v、s
l
、p、p
l
、l和m中的至少一个(例如，两个、三个、四个或多于四个)定义如下：
[0443]
(α)v为式(8a)或(8b)的肽，优选为式(8a')或(8b')的肽；
[0444]
(β)s1为选自以下的基团：
[0445]
(a2)具有6至36个重复单元的聚环氧烷基团；优选下式(7)表示的基团：
[0446]
–
x1–
(ch2ch2o)
n2
–
ch2ch2–
x2–ꢀꢀ
(7)
[0447]
其中，
[0448]
x1为nh、o或s；优选nh；
l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(s-(c＝o))-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(s-(c＝o)-o)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(o-(c＝s)-o)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(o-(c＝o)-s)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(s-(c＝o)-s)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(s-(c＝s)-o)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(o-(c＝s)-s)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(s-(c＝s))-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(o-(c＝o)-nh)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(s-(c＝s)-s)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-o-(c＝o)-o)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-o-(c＝o))-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-s-(c＝o))-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-s-(c＝o)-o)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-o-(c＝s)-o)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-o-(c＝o)-s)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-s-(c＝o)-s)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-s-(c＝s)-o)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-o-(c＝s)-s)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-s-(c＝s))-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-o-(c＝o)-nh)-l-p1、v
1-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-nh-(m-s-(c＝s)-s)-l-p1、p-(o-(c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-((c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-((c＝o)-s-m)-nh-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-(o-(c＝o)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-(o-(c＝s)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-(s-(c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-(s-(c＝o)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-(o-(c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-(s-(c＝s)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-((c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-(nh-(c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-(s-(c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(o-(c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-((c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-((c＝o)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(o-(c＝o)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(o-(c＝s)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(s-(c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(s-(c＝o)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(o-(c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(s-(c＝s)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-((c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(nh-(c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2、以及p
1-l-(s-(c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
6-20-ch2ch
2-(c＝o)-v2，其中v、p、p1和l如上定义，v1为式(8b)的肽，v2为式(8a)的肽，并且其中优选地，v1、v2、p、p1、l和m中的至少一个(例如，两个、三个、四个或多于四个)定义如下：
[0491]
(α)v1为式(8b')的肽，v2为式(8a')的肽；
[0492]
(γ)p或p1为衍生自以下的部分：
[0493]
(γ1)nota、dota、nodaga、dtpa，它们中的每个都可以任选地螯合选自以下的放射性核素：
89
zr、
111
in、
64
cu、
177
lu、
68
ga和
99m
tc，优选选自
89
zr、
111
in、
64
cu，
[0494]
(γ2)n3、tz、tco、dbco、bcn，
[0495]
(γ3)澳瑞他汀(例如，mmae)或pnu-159582；
[0496]
(δ)l为选自以下的接头：
[0497]
(a1)具有2至6个碳的亚烷基(-(ch2)
2-6-)，
ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-((c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-(nh-(c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p-(s-(c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(o-(c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-((c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-((c＝o)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(o-(c＝o)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(o-(c＝s)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(s-(c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(s-(c＝o)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(o-(c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(s-(c＝s)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-((c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、p
1-l-(nh-(c＝o)-o-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2、以及p
1-l-(s-(c＝s)-s-m)-nh-(ch2ch2o)
10-ch2ch
2-(c＝o)-v2，其中v、p、p1和l如上定义，v1为式(8b)的肽，v2为式(8a)的肽，并且其中优选地，v1、v2、p、p1、l和m中的至少一个(例如，两个、三个、四个或多于四个)如下定义：
[0506]
(α)v1为式(8b')的肽，v2为式(8a')的肽；
[0507]
(γ)p或p1为衍生自以下的部分：
[0508]
(γ1)nota、dota、nodaga、dtpa，它们中的每个都可以任选地螯合选自以下的放射性核素：
89
zr、
111
in、
64
cu、
177
lu、
68
ga和
99m
tc，优选选自
89
zr、
111
in、
64
cu，
[0509]
(γ2)n3、tz、tco、dbco、bcn，
[0510]
(γ3)澳瑞他汀(例如，mmae)或pnu-159582；
[0511]
(δ)l为选自以下的接头：
[0512]
(a1)具有2至6个碳的亚烷基(-(ch2)
2-6-)，
[0513]
(b1)式-nh-(ch2ch2o)
n1-ch2ch
2-的聚亚烷基，n1为0至35的整数，以及
[0514]
(c1)包含2至12个氨基酸的肽接头，该肽接头任选地是可裂解的，优选地是包含val-cit单元、val-ala单元、val-cit-pabc或val-cit-pabc-dmea单元的可裂解肽接头；以及
[0515]
(ε)m为式(5a)或(5e)的基团，优选为式(5a)的基团。
[0516]
根据优选实施方案，上式中，v1、v2和m如下定义：
[0517]
(a)v1为式(8b')的肽，v2为式(8a')的肽；以及
[0518]
(ε)m为式(5a)的基团。
[0519]
如果(γ)p1为衍生自澳瑞他汀的部分(例如，mmae)，则(δ)l优选表示包含val-cit单元、val-ala单元或val-cit-pabc单元的可裂解接头，更优选表示包含val-cit-pabc单元的可裂解接头。如果(γ)p1是衍生自pnu-159582的部分，则(δ)l优选表示包含val-cit-pabc-dmea单元的可裂解接头。
[0520]
在一实施方案中，式(1)的化合物选自：
[0521][0522]
其中p表示如上文所定义的有效负载，优选为任选螯合放射性核素的螯合剂，更优选衍生自dtpa、dota、dfo、nota、pcta、ch-x-dtpa、nodaga或dotaga的部分；y'表示衍生自含有偶联基团的化合物的部分，该偶联基团优选选自生物素、dbco、tco、bcn、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇，更优选选自生物素、dbco、bcn和叠氮化物。上述化合物中间
隔物聚环氧乙烷部分的重复数目(即，9)可以替换为5至35中的任一个，优选7-19中的任一个，具有9个聚环氧乙烷重复单元的间隔物是最优选的选择。
[0523]
在一实施方案中，式(1)的化合物选自：
[0524]
[0525]
[0526]
[0527]
[0528]
[0529]
[0530]
[0531]
[0532]
[0533]
[0534]
[0535]
[0536]
[0537]
[0538]
[0539]
[0540]
[0541]
[0542]
[0543]
[0544]
[0545]
[0546]
[0547][0548]
以及，
[0549][0550]
在一实施方案中，上述化合物中间隔物聚环氧乙烷部分的重复数目(即，9)可以替换为5至35中的任一个，优选为7至19中的任一个，具有9个聚环氧乙烷重复单元的间隔物是最优选的选择。
[0551]
在优选的实施方案中，式(1)的化合物选自
[0552]
[0553]
[0554]
[0555]
[0556][0557]
上述化合物中间隔物聚环氧乙烷部分的重复数目(即，9)可以替换为5至35中的任一个，优选7-19中的任一个，具有9个聚环氧乙烷重复单元的间隔物是最优选的选择。
[0558]
在一更优选的实施方案中，式(1)的化合物选自：
[0559]
[0560][0561]
以及，
[0562][0563]
在上述化合物中，dfo表示去铁胺基团，该去铁胺基团通过其氨基附接至分子的残基、以与它所附接的含硫代羰基的基团一起形成硫脲基团。上述化合物中间隔物聚环氧乙烷部分的重复数目(即，9)可以替换为5至35中的任一个，优选7-19中的任一个，具有9个聚环氧乙烷重复单元的间隔物是最优选的选择。
[0564]
4.用于抗体或抗体片段的位点特异性修饰的试剂盒
[0565]
在一些方面，本发明涉及一种试剂盒，该试剂盒包含上文所述化合物和缓冲液，该试剂盒可以用于抗体或其片段的区域选择性修饰(例如，用于标记)，抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中，该试剂盒特别是用于治疗性抗体的区域选择性修饰。
[0566]
本发明的化合物和缓冲剂(一起形成试剂盒)可以单独存在，例如在单个初级容器中(可以在单个盒子中运送给客户)，这可以长时间储存而不会降解。化合物和缓冲液可以配制并按比例配置为给定量的待修饰抗体或其片段。在一些方面，本发明的化合物作为固体(例如，作为冻干粉末，或非共价吸附或共价结合至如下文进一步描述的固相基质)，或作为在合适溶剂中的溶液存在，诸如可以以水溶性的、极性非质子溶剂(例如，dmf、dmso)，该化合物可以在抗体或抗体片段修饰前不久与缓冲液混合。
[0567]
本发明的试剂盒中待使用的缓冲液没有特别限定。优选地，缓冲液的ph为5.5至11，更优选为7.5至9.5。缓冲剂可以选自例如2-双(2-羟乙基)氨基乙酸(2-bis(2-hydroxyethyl)amino acetic acid，bicine)、碳酸盐-碳酸氢盐、三(羟甲基)甲基氨基丙磺酸(tris(hydroxymethyl)methylamino propane sulfonic acid，taps)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid，hepes)。优选地，缓冲剂是ph为7.5至9.5(例如，约9.0)的的碳酸盐-碳酸氢盐或bicine缓冲剂。
[0568]
根据一实施方案，本发明的化合物固定在固相基质(固体支持物)上，例如固定在
珠上。可以使用本领域已知的方法固定化合物，诸如高亲和力(例如，生物素-链霉亲和素、生物素-中性抗生物素蛋白)结合、“点击”化学(如kolb kolb等人在“click chemistry:diverse chemical function from a few good reactions”angewandte chemie int.ed.2001,40(11),2004-2021中定义的)、腙连接反应等。优选地，固相基质是惰性基质，诸如聚合物凝胶，包括材料的三维结构、晶格或网络。更优选地，固相基质是用于亲和色谱的材料，诸如干凝胶。这种凝胶在干燥后收缩成仅包含凝胶基质的致密固体。当干燥的干凝胶重新悬浮在液体中时，凝胶基质吸收液体、膨胀并返回凝胶状态。可以适用于本发明的干凝胶的示例包括聚合物凝胶，诸如纤维素、交联葡聚糖凝胶(例如，)、琼脂糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。
[0569]
在一实施方案中，化合物通过式(8a)中的偶联基团y'固定在固相基质上，例如通过高亲和力结合(诸如生物素-链霉亲和素或生物素-中性抗生物素结合)(在这种情况下，式(8a)中y'表示例如含生物素的基团)、通过点击化学(在这种情况下，y'表示例如含dbco-、叠氮基或炔基的基团)、通过四嗪连接反应(在这种情况下，式(8a)中y'表示含tco或tz的基团)、通过硫醇与马来酰亚胺之间或硫醇与乙酰胺之间的反应(在这种情况下，式(8a)中y'表示例如含有马来酰亚胺或(氯)乙酰胺的基团)。
[0570]
5.反应性偶联物在抗体或抗体片段的区域选择性修饰的方法中的用途
[0571]
本发明的化合物可以在抗体或其片段的区域选择性修饰的方法中使用，该抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中。该方法产生修饰抗体或修饰抗体片段(例如，adc)，该修饰抗体或修饰抗体片段可以在如下文进一步描述的诊断、监测(例如，监测治疗(例如，随时间推移)的有效性)、成像或治疗疾病的方法中使用。
[0572]
在一实施方案中，该方法包括使抗体或其片段与化合物反应(接触)的步骤，该化合物可以包含在上文所述的试剂盒中。反应混合物可以通过本领域已知的技术来纯化，例如使用合适溶剂的凝胶渗透色谱法来纯化。
[0573]
当本发明的化合物固定在固相基质上时，固定的化合物与含有待修饰抗体或抗体片段的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤固相基质，该溶剂将基本上除去样品中除结合至固相基质的抗体外、的所有物质。最后，固相基质用另一种合适的溶剂洗涤，诸如ph2.5的甘氨酸缓冲液，该溶剂将从固相基质中释放出修饰抗体/抗体片段(例如，adc)。
[0574]
本发明的方法可以应用于任何抗体(例如igg蛋白)、抗体片段或fc融合蛋白，条件是，该抗体包含用于与配体v相互作用的fc区域。在一实施方案中，待修饰抗体是单克隆抗体(mab)，优选选自以下组成的组的抗体：阿达木单抗、阿杜那单抗、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗、阿特珠单抗、阿奈妥单抗、阿维鲁单抗、巴匹组单抗、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、贝迈奇单抗、贝西索单抗、贝伐珠单抗、贝洛托舒单抗、本妥昔单抗、维布妥昔单抗、布罗达单抗、博纳吐单抗、卡妥索单抗、西米普利单抗、西妥昔单抗、辛帕奈单抗、克利妥珠单抗、泰坦-克利妥珠单抗、泰坦-克雷内治单抗、达珠单抗、达雷妥尤单抗、地诺单抗、地努妥昔单抗、德瓦鲁单抗、依决洛单抗、埃罗妥珠单抗、依帕伐单抗、恩弗妥单抗、维汀-恩弗妥单抗、依帕珠单抗、依帕珠单抗-sn-38、埃达组单抗、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、吉妥昔单抗、戈奈单抗、替伊莫单抗、英比利珠单抗、英夫利昔单抗、英妥珠单抗、奥英妥珠单抗、伊匹单抗、艾萨妥昔单抗、伊西贝单抗、j591 psma-抗体、拉贝珠单抗、莱卡单抗、莫格利珠单抗、奈昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、奥戈伏单
抗、帕尼单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、维博妥珠单抗、普尼珠单抗、雷妥莫单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、司妥昔单抗、沙西妥珠单抗、戈沙妥组单抗、西瑞奈单抗、司妥昔单抗、茄尼醇单抗、他珠单抗、替妥木单抗、替拉奈单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、德喜曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、ts23、乌司奴单抗、维多珠单抗、伏妥莫单抗、泽格特奈单抗、扎芦木单抗、扎木单抗、其片段及衍生物；更优选为阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗、利妥昔单抗或曲妥珠单抗。
[0575]
在一实施方案中，待修饰抗体或其片段是商业制剂的抗体，优选具有由美国ema或食品和药物管理局(food and drug administration，fda)提供的上市许可的商业制剂的抗体。根据一实施方案，商业配制的抗体选自修美乐坎帕斯舒莱安维汀安维汀爱必妥赛尼哌兆珂普罗力普罗力易普利姆玛欧狄沃拉特沃奥密塔克希冉择美罗华瑞图宣萨温珂百克沙赫塞汀喜达诺和其生物类似物；优选选自
[0576]
市售抗体通常与组氨酸一起配制以保持稳定性。当市售抗体与反应性偶联物混合时，组氨酸将有望以竞争方式作用于反应中心，从而降解反应性偶联物，这将导致adc的产率降低。然而，发明人惊奇地发现，使用本发明的化合物，产率没有受到影响，或受到显著影响。不希望受到理论的约束，发明人认为这是由于本发明化合物与抗体或抗体片段(例如赖氨酸或半胱氨酸)侧链上的氨基酸之间的反应速率增加所致。这种有利的动力学可能与载体与fc片段结合后、靶标氨基酸附近的反应中心的局部浓度急剧增加有关。
[0577]
在一个实施方案中，待修饰抗体片段被掺入至fc-融合蛋白，该fc-融合蛋白优选选自贝拉西普、阿柏西普、ziv-阿柏西普、度拉糖肽、利钠西普、罗米司亭、阿巴西普和阿法西普。
[0578]
6.修饰抗体或修饰抗体片段
[0579]
通过将本发明化合物与抗体或抗体片段反应获得(可获得)的修饰抗体和修饰抗体片段(抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中)包括通过二价基团附接至抗体或其片段的一个或多个有效负载，该二价基团是衍生自式(1)中的反应性部分y的基团(即，它对应于式(1)中的反应性部分y，该反应性部分已与暴露于抗体或其片段表面的氨基酸侧链反应)。
[0580]
根据一个实施方案，修饰抗体或修饰抗体片段由下式(10)表示：
[0581]
(p-w)
p-a
ꢀꢀ
(10)
[0582]
其中，
[0583]
p为如上所述的有效负载，优选为如上文项目(i)至(iii)中指定的部分；
[0584]
w为f1-rc'，其中f1附接至p，并且rc'为衍生自附接至a的反应中心(rc)的部分，f1和rc如式(3a)和(3b)所定义；
[0585]
a为衍生自任选地掺入至fc-融合蛋白中的抗体或抗体片段的部分，所述抗体或抗体片段如上面所定义的；并且
[0586]
p为1至4的整数。优选p为1至2。
[0587]
在反应性部分与lys侧链反应的那些示例中，有效负载与抗体或抗体片段的附接是通过含氮原子的基团(诸如，酰胺基、氨基甲酸乙酯基、硫代氨基甲酸乙酯基、二硫代氨基甲酸乙酯基等)发生的。例如，如果本发明化合物包括式(4a)或(4d)(或式(4a')或(4d')的反应部分，则式(10)中的二价基团w是氨基甲酸乙酯基，其中氮原子形成lys侧链的一部分。如果化合物包括例如式(4e)、(4f)或(4j)(或式(4e')、(4f')或(4j'))的反应性部分，则二价基团w是硫代氨基甲酸乙酯基。
[0588]
p表示修饰抗体或修饰抗体片段的偶联程度(degree of conjugation，doc；有时称为“药物-抗体-比”(drug-antibody-ratio，dar))。
[0589]
根据一实施方案，修饰抗体或修饰抗体片段由下式(11)表示：
[0590]
(p1-l-w)
p-a
ꢀꢀ
(11)
[0591]
其中，
[0592]
p1、l、w、a和p如上定义。
[0593]
7.修饰抗体或修饰抗体片段在诊断和/或治疗目的中的用途
[0594]
通过本发明的化合物与抗体或抗体片段(抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中)反应获得(或可获得)的修饰抗体和修饰抗体片段可以用于诊断和/或治疗疾病，特别是癌症。该治疗可以是疗法和/或预防性治疗，目的是预防、减少或停止不希望的生理变化或失调(disorder)。在某些情况下，与未接受治疗的预期生存期相比，治疗可延长受试者的生存期。
[0595]
通过修饰抗体或修饰抗体片段(例如，adc)治疗的疾病可以是受益于该治疗的任何疾病，包括慢性和急性失调或疾病，以及易患该失调的病理状况。在某些情况下，该疾病是一种肿瘤疾病，诸如癌症，该肿瘤疾病可以通过靶向破坏肿瘤细胞进行治疗。可以治疗的癌症的非限制性实施例包括良性和恶性肿瘤，无论是实体瘤还是液体瘤。白血病和淋巴样恶性肿瘤，以及乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌。该疾病可以是神经元疾病、神经胶质疾病、星形胶质细胞疾病、下丘脑疾病或其他腺状疾病、巨噬细胞疾病、上皮疾病、基质疾病和囊胚腔疾病；或炎症性疾病、血管原疾病或免疫疾病。一种示例性疾病是实体的、恶性肿瘤。
[0596]
根据一个实施方案，所述疾病或其治疗选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脑动脉硬化、脑病、亨廷顿氏病、多发性硬化、帕金森氏病、进行性多灶性白质脑病、系统性红斑狼疮、系统性硬化、心绞痛(包括不稳定型心绞痛)、主动脉瘤、动脉粥样硬化、心脏移植、心脏毒性诊断、冠状动脉旁路移植、心力衰竭(包括心房颤动终止的收缩性心力衰竭)、高胆固醇血症、局部缺血、心肌梗塞、血栓栓塞、血栓症、强直性脊柱炎、
自身免疫性细胞减少、自身免疫性心肌炎、克罗恩氏病、移植物抗宿主病、肉芽肿性多血管炎、特发性血小板减少性紫癜、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、狼疮、显微镜下多血管炎、多发性硬化、斑块性银屑病、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎(uc)、葡萄膜炎和血管炎。
[0597]
根据一实施方案，待治疗的疾病涉及选自以下的细胞：淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、肾癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状癌细胞、小细胞肺癌细胞、睾丸癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、黑色素瘤、头颈癌细胞，以及以不受调节和加速的速度生长和分裂而导致癌症的任何细胞；优选选自乳腺癌细胞、小细胞肺癌细胞、淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞和头颈癌细胞。
[0598]
根据一实施方案，所述修饰抗体或修饰抗体片段用于通过向受试者(例如，患者)施用所述修饰抗体或修饰抗体片段来诊断、监测(例如，随时间监测治疗的有效性)、成像和/或治疗疾病(例如，癌症)的方法中。
[0599]
这种分子可以一次性或通过一系列治疗施用至受试者。根据疾病的类型和严重程度，和/或有效负载，和/或抗体或抗体片段，在首次人体试验中，约0.1μg/kg至1mg/kg之间的药物可以作为首次施用的初始候选剂量、例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注来使用。典型的每日剂量范围为约0.1mg/kg至50mg/kg或更多，或约0.5mg/kg至约30mg/kg，例如患者体重的0.5mg/kg至约25mg/kg。然而，典型剂量将取决于多种因素，包括特定有效负载(活性剂)、年龄、体重、一般健康、性别和受试者的饮食；施用是否用于成像、监测或治疗目的，以及医学领域众所周知的其他因素。
[0600]
在治疗癌症时，观察到的治疗效果可以是癌细胞数目的减少；小肿瘤尺寸的减少；癌细胞浸润周围器官的抑制或延缓；肿瘤生长的抑制；和/或与癌症相关的一种或多种症状的缓解。
[0601]
根据优选实施方案，通过注射(诸如，肠外、静脉内、皮下、肌肉内)施用修饰抗体或修饰抗体片段。
[0602]
根据另一实施方案，修饰抗体或修饰抗体片段用于诊断、监测(例如，监测治疗的有效性(例如随时间))、成像和/或治疗癌症的方法中，并且修饰抗体或修饰抗体片段与一种或多种其他治疗剂同时施用，该其他治疗剂诸如为化疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、自身免疫性疾病试剂、抗感染试剂或一种或多种其他修饰抗体或修饰抗体片段。也可以在修饰抗体或修饰抗体片段之前或之后施用其他治疗剂。
[0603]
8.本发明的化合物的制备
[0604]
在下文中，提供了用于制备配体、间隔物、有效负载-接头和化合物(反应性偶联物)的方法以及在它们在治疗性抗体或治疗性蛋白质(例如，fc-融合蛋白)的区域选择性修饰中的用途。本发明的化合物可以依靠标准化学方法和fmoc类的固相肽合成(solid-phase peptide synthesis，spps)(包括树脂上肽偶联和聚合策略)进行合成。下面还举例说明了各种有效负载的引入，以及固相基质上的化合物固定化。本领域技术人员已知且在图2、图5和图9中说明了可以用于制备本发明化合物的一般策略和方法。
[0605]
9.实施例
[0606]
9.1在实施例中使用的缩写列表：
[0607]
acn：乙腈
[0608]
dcm：二氯甲烷
[0609]
dic：二异丙基碳化二亚胺
[0610]
diea：二异丙基乙胺
[0611]
dmf：二甲基甲酰胺
[0612]
dmso：二甲基亚砜
[0613]
fl或fitc：荧光素
[0614]
hatu：1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化六氟磷酸盐
[0615]
hplc：高效液相色谱法
[0616]
hrms：高分辨率质谱法
[0617]
pbs：磷酸盐缓冲盐水
[0618]
sds-page:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
[0619]
spps：固相肽合成
[0620]
tfa：三氟乙酸
[0621]
tis：三异丙基硅烷
[0622]
uplc：超高效液相色谱
[0623]
wlc：蠕虫状链
[0624]
9.2原材料和化学品：
[0625]
下面列出了以下实施例中使用的主要原材料和化学品：
[0626]
》用于固相肽合成的树脂(fmoc-rink酰胺am树脂、4-fmoc-肼基苯甲酰基am novagel
tm
)和受保护氨基酸、n,n-二异丙基碳化二亚胺(n,n-diisopropylcarbodiimide，dic)、来自诺瓦生化公司(novabiochem)(瑞士)的哌嗪，除非另有说明；
[0627]
》来自默克(merck)或费舍尔科学(fischer scientific)ag(瑞士)的用于合成的溶剂、脱保护试剂、裂解试剂；
[0628]
》来自西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)(瑞士)的马来酰亚胺基丙酸、4-硝基苯基氯甲酸酯、tfa、tis和diea；
[0629]
》来自巴亨(bachem)ag(瑞士)、诺瓦生化公司和aapptec(美国)的氨基酸；
[0630]
》来自马舍雷-纳格尔(macherey-nagel)(瑞士)的用于高效液相色谱(hplc)、超高效液相色谱质谱(uplc-ms)的溶剂和化学品；
[0631]
》来自金斯瑞(genscript)(usa)的荧光标记肽fc-iii-fam；
[0632]
》来自genovis(瑞典)的蛋白酶；
[0633]
》来自普洛麦格(promega)(瑞士)的蛋白酶；
[0634]
》来自百康特(bioconcept)(瑞士)的蛋白酶；
[0635]
》来自broadpharm(美国)的生物素-peg4-胺和peg接头；
[0636]
》来自罗氏(瑞士)的(商业曲妥珠单抗)；
[0637]
》来自macrocyclics(usa)的p-scn-bn-chx-a
”‑
dtpa.3hcl、p-scn-bn-pcta.3hcl；
[0638]
》来自chematech(法国)的p-ncs-bz-dfo。
[0639]
生物相似性单克隆igg1抗体(曲妥珠单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗)是在
应用科学大学g.hagens博士实验室(hes-so瓦莱州(valais/wallis)，瑞士)通过培养重组cho细胞系进行制备的。
[0640]
gingiskhan和fabalactica是半胱氨酸蛋白酶，其可以对铰链上方的igg1进行位点特异性裂解，从而产生两个fab片段和一个fc片段。fabricator是一种半胱氨酸蛋白酶，其可以对铰链下方的抗体进行位点特异性消化，从而产生f(ab')2和fc/2片段。
[0641]
9.3方法：
[0642]
以下方法用于评估本发明的化合物和偶联物：
[0643]
9.3.1间隔物长度的确定
[0644]
通过使用蠕虫状链(wlc)模型计算在fc结合载体的n端处引入的间隔物(式(1)的部分s)的长度，该模型将间隔物视为连续柔性杆并且被证明是用于生物聚合物的合适模型(rubinstein and colby(2003),polymer physics,oxford university press)：
[0645]
《r2》＝2
×
l
p
×
l
[0646]
其中l
p
为持久长度(链方向的相关长度)，并且l为伸直长度(完全拉伸的链的长度)。使用聚乙二醇间隔物的持久长度值为(kienberger等人，single molecules 2000,1(2),123-128)。sggpppppp间隔物的长度是根据文献中描述的步骤估计的(mahoney等人，nature chemical biology 1997,4(12),953-960；garbuio et al.chemistry:a european journal 2015,21(30),10747-10753)。
[0647]
9.3.2饱和fp结合试验
[0648]
饱和荧光偏振(fluorescence polarization，fp)测量在平底384-孔康宁微孔板(默克公司)中、在spectramax paradigm多模块检测平台(购自美谷分子(molecular devices))上、分别使用485nm和535nm的激发波长和发射波长来执行的。采集时间为700毫秒，且读取高度为1mm。测定中使用的所有试剂均在含有0.05％吐温20的pbs中稀释。
[0649]
将荧光标记肽fc-iii-fam(结构如下所示)与一系列igg1稀释液在含有0.05％吐温的pbs中混合，得到最终肽浓度为5nm。将样品在27℃下温育15分钟，并一式三份测量荧光各向异性。
[0650]
collision-induced dissociation，高能碰撞诱导解离)被用作片段方法，归一化碰撞能量分别为12％、15％和18％。
[0662]
使用具有99％噪声抑制置信度和20ppm平均质量识别准确度的respect算法、用protein deconvolution(赛默飞世尔科技，usa)分析完整质量测量数据。使用mash suite软件(ge研究小组，威斯康星大学)对中等下数据进行去卷积。使用prosight lite软件(kelleher研究小组，西北大学)，将用3个不同nce值获得的数据组合在一起以创建具有15ppm质量容差的指定b-和y-片段的片段图。
[0663]
9.3.6通过hrms分析确定偶联度
[0664]
平均偶联度(average degree of conjugation,doc)值使用hrms数据和下面的等式1(eq.1)计算。这些结果衍生自去卷积质谱中的相对峰强度。
[0665][0666]
其中，i(dock)为具有k个附加分子/抗体的偶联物的相对峰强度。
[0667]
9.3.7 sds-page
[0668]
在bolt 4-12％bis-tris plus gels(赛默飞世尔(thermofisher),德国)上执行还原性或非还原性bis-tris sds-page。将负载缓冲液添加至抗体偶联物(非还原性bolt样品缓冲液，赛默飞世尔)中，并且将样品在70℃加热10分钟。为了还原sds-page，在上样缓冲液之前将还原缓冲液添加至样品中。使用bolt mes电泳缓冲液、在恒定电压(200v)下电泳凝胶25-30分钟。在用考马斯蓝染色之前，荧光在fluorom生物成像系统(syngene，英国)上进行可视化。
[0669]
实施例1：fc结合载体的制备和特性
[0670]
使用标准的fmoc/tbu类spps(包括树脂上偶联和聚合策略)制备如本文所述的fc结合载体和载体间隔物构建体(式(1)的部分v或s-v)。实施例1中制备的配体在下表1中所示(粗体下划线表示各cys残基的侧链之间存在二硫键)。如上所述，通过使用wlc模型计算间隔物长度。
[0671]
[0672][0673]
表1:fc结合载体(根据式(1)的部分v/sv)
[0674]
肽通过标准fmoc/tbu类spps、使用rink酰胺am树脂制备(负载：0.57mmol/g)和liberty bluetm自动微波肽合成仪(购自cem corp.，德国)来制备。
[0675]
在室温下，使用利用0.5m dic预活化的0.2m fmoc氨基酸和1m的dmf执行用于酰胺键形成的偶联反应超过4分钟。使用10％哌嗪的dmf(v/v)执行fmoc去保护。
[0676]
合成完成后，在室温下通过tfa/tis/水(90/5/5，v/v/v)处理，在温和搅拌下从树脂中手动裂解肽1.5小时。在用氮气流过滤和蒸发裂解混合物后，用冷乙醚沉淀粗肽，离心，并用冷乙醚洗涤粗肽。将肽干燥、溶解在超纯水acn中，冷冻并冻干。
[0677]
对于二硫键的形成，将粗冻干肽重新悬浮在dmso/acn/水(2/3/3，v/v/v)的混合物中，然后加入水直到肽变得可溶(约35-50ml)、并且用nh4hco3或nahco3(浓度：0.1-0.5mm)使得到的溶液变为ph8.5。通过分析型uplc-ms来监测氧化进程。反应完成后，用sep-pak c18 plus long cartridge去除盐分(每个滤芯820mg吸附剂，粒径：55-105μm，购自waters，瑞士)，并将肽冷冻干燥。
[0678]
使用溶剂系统a(水中0.1％tfa)和b(acn中0.1％tfa)，以35ml/min的流速和25min内15-55％b范围内的梯度，在xb-c18柱(5μm，100
×
21.2mm；phenomenex helvetia)上通过制备反相hplc纯化肽。在214nm的波长下监测肽洗脱。在浓缩和冻干之前，通过uplc-ms分析合适的级分。
[0679]
对于化合物3-12和15-16的合成，将fmoc-nh-(ch
2-ch
2-o)n-ch
2-ch
2-cooh(n＝2、4、6、8、10、12、15、20、24或36；1.3当量，4.7μmol)和hatu(1.2当量，4.33μmol)的dmf溶液搅拌1分钟，并加入diea(2当量，7.16μmol)。在预活化3分钟后，将fc结合肽(化合物1、13或14)的dmf(1当量，3.58μmol)添加至反应混合物中并在室温下搅拌1-2小时。通过ulpc-ms监测反应完成。然后用冷乙醚沉淀肽。在室温下，用dmf中20％哌啶(v/v)执行fmoc去保护30分钟，然后用冷乙醚沉淀肽(图2a)。在hplc纯化后分离肽(如前一段所描述的)。
[0680]
肽的纯度在waters acquity uplc系统上使用溶剂系统测定，该系统与带有
xb-c18柱(1.7μm，50
×
2.1mm；phenomenex helvetia)的micromass quattro micro api质谱仪耦合，该溶剂系统使用溶剂系统a(水中0.1％tfa)和b(acn中0.1％tfa)、以0.6ml/min的流速和4min内2-98％的b梯度。在214nm波长下监测偶联物的洗脱。结果如下表所示。
[0681][0682][0683]
表2:化合物1-16的特征
[0684]
实施例2：饱和fp结合试验
[0685]
在上述饱和fp结合试验中，评估了fc结合配体fc-iii-fam(如上所示结构)结合igg1抗体(即，曲妥珠单抗、阿仑单抗、贝伐单抗和利妥昔单抗)的fc-区域的倾向。结果如图3所示。证实了fc结合配体fc-iii-fam、以高亲和力结合相应抗体(曲妥珠单抗：14nm，阿仑单抗：13nm，贝伐单抗：7nm，利妥昔单抗：11nm)。
[0686]
实施例3：竞争性fp结合试验
[0687]
在上述竞争性fp结合试验中评估了实施例1中制备的fc结合配体(化合物1、2、9-11、13、15和16)抗fc-iii-fam、以结合曲妥珠单抗的fc区域的倾向。结果如下表3所示，如图4所示。
[0688][0689]
表3:曲妥珠单抗对fc-iii-fam的竞争性fp结合试验中fc结合配体的ic
50
值
[0690]
这些结果证实实施例1的fc-结合配体(化合物1、2、9、10和11)和fc-iii-fam竞争曲妥珠单抗fc区域上的相同结合位点。此外，结果表明用间隔物部分(例如，诸如ser-(gly)
2-(pro)6的肽间隔物或聚乙二醇间隔物)对fc-iii肽(化合物1)的n端修饰不会影响修饰肽与抗体fc区域的结合。特别是，化合物2、9、10和11抗fc-iii-fam(图4)在竞争性fp结合试验中表现出对曲妥珠单抗的高亲和力。
[0691]
另一方面，化合物15和16中fc-iii的c端序列的修饰(即，用trp-ala-cys-thr(wact)或val-trp-ala-thr(vwat)取代val-trp-cys-thr(vwct))影响了肽结合至抗体。在下文中，带有所述修饰c端序列(wact或vwat)的化合物或偶联物用作阴性对照使用。
[0692]
实施例4：dota-、fl-和dbco-碳酸酯衍生物和fl-硫酯衍生物—化合物17、18、19、20、21、22和23的制备
[0693]
化合物17、18、19、20、21、22和23(式(1)的部分p-y)根据下述步骤制备并且显示在图5中。化合物17-23各自的结构如下表所示。
[0694]
[0695][0696]
表4:dota-、fl-、dbco-碳酸酯衍生物和fl-碳酸酯-萘、fl-碳酸酯-异喹啉、fl-硫酯-ch2ch2衍生物(根据式(1)的部分py)的结构
[0697]
化合物17的制备：
[0698][0699]
向2.0g 2-(2-boc-氨基乙氧基)乙醇1(9.6mmol)的70ml乙腈溶液中加入5.2g的n,n'-二琥珀酰亚胺碳酸酯(19mmol，2.0当量)，然后加入2.7ml的三乙胺(19mmol，2.0当量)并将悬浮液在40℃搅拌1小时30分钟。真空除去溶剂。将残余物溶解在dcm中并通过硅胶柱过滤，用二氯甲烷/乙酸乙酯80/20洗脱，得到粗品2-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙氧基]乙基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(纯度》80％，产率：99％)。lcms：m/z＝247[m-boc+h]
+
，369[m+na]
+
。1h nmr(cdcl3)：δ4.52
–
4.40(m,2h)，3.77
–
3.68(m,2h)，3.55(t,2h)，3.32(dd,2h)，2.84(s,4h)，1.44(s,9h)。
[0700]
将1.5g 2-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙氧基]乙基(2,5-二氧吡咯烷-1-基)碳酸酯
(3.4mmol，2.0当量)的12mldcm溶液用0.35g 4-羟基苯甲酸叔丁酯(1.7mmol)来处理，随后用0.43g 4-(二甲氨基)吡啶(3.4mmol，2当量)来处理。将反应混合物在室温搅拌30分钟。加入50ml水并用3
×
10ml二氯甲烷来萃取。将有机层真空浓缩。通过快速色谱法(环己烷/乙酸乙酯，90/10至60/40)纯化残余物，得到0.64g4-[2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基羰氧基]苯甲酸叔丁基酯(tert-butyl-4-[2-[2-(tertbutoxycarbonylamino)ethoxy]ethoxycarbonyloxy]benzoate)，无色油状(纯度》98％，产率：88％)。lcms：m/z＝326[m-boc+h]+，448[m+na]+。1h nmr(dmso)δ7.96(d,2h),7.38(d,2h),6.83(s,1h),4.41
–
4.28(m,2h),3.75
–
3.60(m,2h),3.43(t,j＝6.0hz,2h),3.09(q,2h),1.54(s,9h),1.37(s,9h)。
[0701]
将2.1ml的tfa(27mmol，17当量)在0℃下添加至0.67g上述化合物(1.5mmol)的6.3ml dcm溶液中，并在室温下将反应混合物搅拌3h。将混合物真空浓缩，得到0.73g的化合物4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基羰氧基]苯甲酸；2,2,2-三氟乙酸，白色固体(纯度》80％，产率：97％)。lcms：m/z＝270[m+h]+。1h nmr(dmso)δ8.01(d,1h),7.87(s,2h),7.37(d,2h),4.38(dd,2h),3.75(dd,2h),3.65(t,2h),3.06
–
2.97(m,2h)。
[0702]
向0.70g dota-tris(tbu)酯nhs酯(0.83mmol)的3.5mlacn溶液中添加0.88ml的diea(5.0mmol，6.0eq)，然后添加0.44g的4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基羰基]苯甲酸(0.92mmol，1.1当量)，并在室温下搅拌反应混合物10分钟(注：在超声波作用后立即出现溶解的固体)。将溶液在3.5ml水中稀释并通过c18柱快速色谱法(水/acn，90/10至0/100)纯化。收集级分，在真空中浓缩并冻干，以得到0.66g化合物17(4-[2-[2-[2-[2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代-乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基-1-基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基羰氧基]苯甲酸(4-[2-[2-[[2-[4,7,10-tris(2-tert-butoxy-2-oxo-ethyl)-1,4,7,10-tetrazacyclododec-1-yl]acetyl]amino]ethoxy]ethoxycarbonyloxy]benzoic acid))，白色固体(纯度》95％，产率：93％)。lcms：m/z＝824[m+h]+、413[m/2+h]+。1h nmr(dmso)δ8.56(s,1h),7.95(d,2h),7.27(d,2h),4.31(s,2h),3.66(s,2h),3.48
–
3.42(m,2h),3.35
–
3.25(m,8h),3.00(s,2h),2.75(s,8h),2.63(s,4h),1.37(s,27h)。
[0703]
化合物18的制备：
[0704][0705]
向1.0g 5-羟基-2-硝基苯甲酸(5,4mmol)的14ml甲苯溶液中添加7,6ml的2-甲基丙烷-2-醇(80mmol，15当量)，并在85℃下加热反应混合物。缓慢添加4,5ml的n,n-二甲基甲酰胺二新戊乙缩醛(16mmol，3.0当量)，并在85℃下搅拌反应混合物3h。冷却反应，然后添加
10ml饱和nahco3水溶液，并用3
×
5ml乙酸乙酯萃取水层。将合并的有机层用10ml水洗涤并真空浓缩，得到1.1g粗制5-羟基-2-硝基-苯甲酸叔丁基酯，黄色油状物(纯度：89％，产率：73％)。lcms：m/z＝238[mh]-。1h nmr(dmso):δ8.00(d,1h),7.00(dd,1h),6.92(d,1h),1.50(s,9h)。
[0706]
将0.35g粗制5-羟基-2-硝基-苯甲酸叔丁酯(1.3mmol)的5.0mldcm溶液添加至0.90g的2-[2-(叔-丁氧基羰氨基)乙氧基]乙基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(2,6mmol，2,0当量；如上所示制备)中，然后添加0.46ml的diea(2,6mmol，2,0当量)。将反应混合物在室温搅拌30分钟。将混合物通过快速色谱法纯化(环己烷/乙酸乙酯，90/10至40/60)，得到0.18g的5-((11,11-二甲基-9-氧代-2,5,10-三噁-8-氮杂十二烷酰基)氧基)-2-硝基苯甲酸(5-((11,11-dimethyl-9-oxo-2,5,10-trioxa-8-azadodecanoyl)oxy)-2-nitrobenzoic acid)，黄色油状物(纯度：99％，产率：29％)。lcms：m/z＝315[m-boc-(t-bu)+h]+、371[m-boc+h]+、493[m+na]+。1h nmr(dmso):δ8.15(d,1h),7.77(d,1h),7.69(dd,1h),6.84(s,1h),4.39
–
4.32(m,2h),3.71
–
3.65(m,2h),3.47
–
3.39(m,2h),3.14
–
3.05(m,2h),1.50(s,9h),1.37(s,9h)。
[0707]
向0.60ml tfa(7.8mmol，21当量)的1.8ml dcm溶液中添加0.17g的5-((11,11-二甲基-9-氧代-2,5,10-三噁-8-氮杂十二烷酰基)氧基)-2-硝基苯甲酸化合物(0,37mmol)，并且反应混合物在室温下搅拌2小时。添加0.30ml的tfa并将混合物在室温下搅拌30分钟。真空蒸发溶剂得到0.23g粗5-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基羰氧基]-2-硝基-苯甲酸；2,2,2-三氟乙酸，黄色油状物(纯度：67％，产率：定量)。lcms：m/z＝315[m+h]+。1h nmr(dmso):δ8.13(d,1h),7.78(d,1h),7.67(dd,1h),4.46
–
4.35(m,2h),3.01(q,2h).
[0708]
向0.22g 5-(11,11-二甲基-9-氧代-2,5,10-三噁-8-氮杂十二烷酰基)氧基)-2-硝基苯甲酸(0.34mmol，1.15当量)的1.3ml乙腈溶液中添加0.25g2,2',2'-(2-(2,5-二氧基吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁基酯(tri-tert-butyl2,2’,2
”‑
(10-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7,10-tetraazacyc lododecane-1,4,7-triyl)triacetate)(0.30mmol)，然后添加0.31ml的n,n-二异丙基乙胺(1.8mmol，6.0当量)，并在室温下搅拌反应混合物10min。添加1.5ml水，并通过c18快速色谱法(水/乙腈95/5至0/1)纯化溶液，以获得85mg化合物18(2-硝基-5-[2-[2-[[2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代-乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基羰氧基]苯甲酸)(2-nitro-5-[2-[2-[[2-[4,7,10-tris(2-tert-butoxy-2-oxo-ethyl)-1,4,7,10-tetrazacyclo dodec-1-yl]acetyl]amino]ethoxy]ethoxycarbonyloxy]benzoic acid)，透明黄色固体(纯度》80％，产率：26％)。lcms:m/z＝701[m-3(t-bu)+h]+,757[m-2(t-bu)+h]+,813[m-(t-bu)+h]+,869[m+h]+.1h nmr(dmso):δ8.62(s,1h),7.69(d,1h),7.39(d,1h),7.23(dd,1h),4.38
–
4.31(m,2h),3.70
–
3.67(m,2h),1.42(s,6h),1.41(s,27h)。
[0709]
化合物19的制备：
[0710][0711]
向0.71g 4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基羰氧基]苯甲酸的4.0mlacn；2,2,2-三氟乙酸(1.2mmol，1.2当量)溶液中添加0.40g的异硫氰酸荧光素异构体(1.0mmol)和4.0ml的二甲基甲酰胺，然后添加1.1ml的n,n-二异丙基乙胺(6.0mmol，6.0当量)。将该混合物在室温下搅拌10分钟。在真空下蒸发溶剂。残余物用c18快速色谱法(水/乙腈95/5至0/1)纯化，得到0.38g化合物19(4-[2-[2-[(3',6'-二羟基-3-氧代-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)氨基甲酰基硫代氨基]乙氧基]乙氧基羰氧基]苯甲酸(4-[2-[2-[(3',6'-dihydroxy-3-oxo-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthene]-5-yl)carbamothioylamino]ethoxy]ethoxycarbonyloxy)，橙色固体)(纯度：98％，产率：56％)。lcms：m/z＝657[mh]-、659[m+h]+。1h nmr(dmso):δ13.07(s,1h),10.24
–
9.95(m,3h),8.26(s,1h),8.16(s,1h),7.98(d,2h),7.74(d,1h),7.35(d,2h),7.18(d,1h),6.67(d,2h),6.61
–
6.53(m,h),4.42
–
4.37(m,2h),3.80
–
3.66(m,6h)。
[0712]
化合物20的制备：
[0713][0714]
在0℃下，向194mg三(乙二醇)双(氯甲酸酯)(0.690mmol,2.0当量)和0.070ml diea(0.420mmol,1.2当量)的干燥dcm(1.20ml)溶液中滴加3-氨基-1-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]氮辛-5(6h)-基)-1-丙酮(3-amino-1-(11,12-didehydrodibenzo[b,f]azocin-5(6h)-yl)-1-propanone)(100mg,0.350mmol,1.0当量)超过10分钟。反应在室温下搅拌。10分钟后，随后将0.3ml diea(1.73mmol,5.0当量)的干燥dcm(1.20ml)溶液和336mg4-羟基苯甲酸叔丁酯(1.73mmol,5.0当量)添加至反应混合物中。将反应在室温搅拌30分钟。然后向反应混合物中添加饱和氯化铵水溶液，并用dcm(2
×
5ml)萃取混合物。合并的有机萃取物用mgso4干燥。过滤后，真空除去溶剂，残余物通过快速色谱法纯化(环己烷/乙酸乙酯，40/60至10/90)，得到67.6mg的4-[2-[2-[2-[[3-(2-氮杂三环[10.4.0.04,9]十六烷-1(12),4(9),5,7,13,15-六烯-10-炔-2-基)-3-氧代-丙基]氨基甲酰氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基羰氧基]苯甲酸叔丁酯(tert-butyl 4-[2-[2-[2-[[3-(2-azatricyclo[10.4.0.04,9]hexadeca-1(12),4(9),5,7,13,15-hexaen-10-yn-2-yl)-3-oxo-propyl]carbamoyloxy]ethoxy]et hoxy]ethoxycarbonyloxy]benzoate)。(纯度：80％，产量：23％)。lcms：m/z＝673.3[m+h]
+
。
isolera，60g，c18 snap ultra biotage柱)纯化材料。将含有产物的级分冷冻干燥，得到期望的化合物(180mg，产率64％，纯度71％)。esi：m/z＝707(mh)-。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ[ppm]＝3.68-3.83(m,6h),4.41-4.46(m,2h),6.52-6.70(m,6h),7.19(d,1h),7.50(dd,1h),7.75(d,1h),7.88(d,1h),8.01(s,2h),8.14-8.24(m,2h),8.28(d,1h),8.65(s,1h),10.06(brs,1h),10.11(br s,2h),13.13(brs,1h)。
[0721]
向6-(((2-(2-(3-(3',6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)硫脲基)乙氧基)乙氧基)羰基)氧)-2-萘甲酸(70.0mg,0.099mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(1.00ml)溶液中添加n-羟基琥珀酰亚胺(34.0mg,0.300mmol)，然后添加edci.hcl(57.0mg,0.300mmol)。将混合物在环境温度下搅拌4小时，然后在60g的c18柱上用5-95％乙腈(0.1％甲酸)的水(0.1％甲酸)洗脱液进行纯化。合并期望的级分并冷冻干燥，得到标题化合物(55.0mg，产率69％，纯度95％)。esi：m/z＝806(m+h)
+
。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ[ppm]＝2.94(s,4h),3.68-3.84(m,6h),4.42-4.48(m,2h),6.51-6.63(m,4h),6.66(d,2h),7.19(d,1h),7.61(dd,1h),7.75(d,1h),7.99(d,1h),8.08(dd,1h),8.16(d,2h),8.28(d,1h),8.34(d,1h),8.91(s,1h),10.00-10.15(m,3h)。
[0722]
化合物22的制备：
[0723][0724]
向6-羟基喹啉-2-羧酸(750mg,3.96mmol)的叔丁醇(40.0ml)溶液中添加的2-叔丁基-1,3-二异丙基异脲(3.20ml，11.9mmol)的叔丁醇(5.00ml)。反应混合物在室温下搅拌3天。减压浓缩反应混合物，将残余物悬浮在乙酸乙酯中并通过用乙酸乙酯冲洗的二氧化硅塞过滤。将滤液减压浓缩，然后通过正相色谱法(biotage isolera，40g，silicycle siliasep柱)、使用5-50％乙酸乙酯的庚烷纯化，得到期望的化合物(378mg，产率39％，纯度95％)，橙色油状物。esi：m/z＝244(mh)-。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ[ppm]＝1.60(s,9h),7.21(d,1h),7.40(dd,1h),7.94(d,1h),7.99(d,1h),8.27(d,1h),10.42(br s1h)。
[0725]
向6-羟基喹啉-2-羧酸叔丁酯(200mg，0.820mmol)和(2-(2-(((((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)羰基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(706mg，2.04mmol)的二氯甲烷(15.0ml)溶液中添加4-二甲基氨基吡啶(199mg，1.64mmol)。该反应混合物在室温搅拌2小时。反应混合物用水洗涤，水层用二氯甲烷洗涤。合并的有机层减压浓缩。残余物通过正相色谱法(biotage isolera，40g，silicycle siliasep柱)、使用10-90％乙酸乙酯的庚烷纯化，得到期望的化合物(278mg，产率71％，纯度94％)，无色油状物。esi：m/z＝499(m+na)
+
。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ[ppm]＝1.38(s,9h),1.62(s,9h),3.07-3.16(m,2h),3.46(t,2h),
3.68-3.74(m,2h),4.35-4.41(m,2h),6.80-6.87(m,1h),7.79(dd,1h),8.00(d,1h),8.10(d,1h),8.22(d,1h),8.56(d,1h)。
[0726]
向6-((11,11-二甲基-9-氧代-2,5,10-三恶-8-氮杂十二烷酰基)氧基)喹啉-2-羧酸叔丁酯(290mg，0.61mmol)的二氯甲烷(5.00ml)溶液中添加三氟乙酸(1.50ml)，将反应混合物在室温下搅拌26小时。混合物减压浓缩。残留物溶解在n,n-二甲基甲酰胺(2.00ml)和乙腈(2.00ml)中，然后添加异硫氰酸荧光素异构体1(237mg,0.610mmol)，然后添加dipea(530μl,3.04mmol)。该反应混合物在室温搅拌2小时。材料通过反相色谱法(biotage isolera，60g，c18 snap ultra biotage柱)、使用含有0.1％甲酸的水和含有0.1％甲酸的乙腈(90:10至100:0)纯化。将含有产物的级分冷冻干燥，得到标题化合物(150mg，产率35％，纯度91％)。esi：m/z＝710(m+h)
+
。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ[ppm]＝3.68-3.83(m,6h),4.41-4.46(m,2h),6.52-6.69(m,6h),7.18(d,1h),7.72-7.80(m,2h),7.97(d,1h),8.12-8.22(m,3h),8.27(d,1h),8.53(d,1h),10.00-10.20(m,3h),13.49(br s,1h)。
[0727]
向6-(((2-(2-(3-(3'，6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)硫脲基)乙氧基)乙氧基)羰基)氧基)喹啉-2-羧酸(70.0mg，0.099mmol)的n，n-二甲基甲酰胺(1.00ml)溶液中添加n-羟基琥珀酰亚胺(34.0mg，0.300mmol)，然后添加edci.hcl(57.0mg，0.300mmol)。将混合物在环境温度下搅拌2小时，然后在60g的c18柱上用5-95％乙腈(0.1％甲酸)的水(0.1％甲酸)洗脱液进行纯化。合并期望的级分并冷冻干燥，得到标题化合物(55.0mg，产率69％，纯度92％)。esi：m/z＝807(m+h)
+
。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ[ppm]＝2.94(s,4h),3.68-3.85(m,6h),4.43-4.48(m,2h),6.52-6.63(m,4h),6.66(d,2h),7.19(d,1h),7.75(d,1h),7.87(dd,1h),8.09(d,1h),8.13-8.21(m,1h),8.25-8.33(m,3h),8.72(d,1h),10.00-10.13(m，3h)。
[0728]
化合物23的制备：
[0729][0730]
向3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸(300mg，1.29mmol)的二氯甲烷(3.00ml)溶液中添加edci.hcl(296mg，1.54mmol)，然后添加1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(177mg，1.54mmol)。该反应混合物在室温搅拌4小时。反应混合物用二氯甲烷稀释并用水洗涤。使有机层通过15.0ml的telos相分离柱并浓缩，得到期望的产物(313mg，纯度79％)，无色油状物。不经纯化用于下一步。esi：m/z＝353(m+na)
+
,231(m-boc+h)+。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ[ppm]＝1.38(s,9h),2.82(s,4h),2.92(t,2h),3.04-3.09(m,2h),3.40(t,2h),3.69(t,2h),6.71-6.75(m,1h)。nmr光谱包含未知杂质：2.50(t),3.50(t)。
[0731]
向2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酸酯(200mg，0.606mmol)的二氯甲烷(4.00ml)悬浮液中添加4-巯基氢化肉桂酸(88.4mg，0.485mmol)，然后添加4-二甲基氨基吡啶(148mg，1.21mmol)。该反应混合物在室温搅拌2小时。反应混合物用10％柠檬酸水溶液洗涤，然后用水洗涤。使有机层通过15.0ml的telos相分离柱，减压浓缩滤液。残余物通过反相色谱法(biotage isolera，30g，c18 snap ultra biotage柱)、使用含有0.1％甲酸的水和含有0.1％甲酸的乙腈(80:20至20:80)纯化。将合适的级分冷冻干燥，得到期望的产物(94.0mg，2步产率29％，纯度97％)，白色固体。esi：m/z＝298(m-boc+h)
+
。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ[ppm]＝1.44(s,9h),2.70(t,2h),2.85-2.91(m,2h),2.99(t,2h),3.27-3.32(m,2h),3.49(t,2h),3.76(t,2h),4.94(br s,1h),7.27(d,2h)(与chcl3峰重叠),7.36(d，2h)。
[0732]
向3-(4-((3-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙氧基)丙酰基)硫代)苯基)丙酸(180mg，0.453mmol)的二氯甲烷(2.25ml)溶液中添加三氟乙酸(0.59ml，7.70mmol)并将反应混合物在室温下搅拌1小时。减压浓缩混合物，得到期望的产物(205mg，纯度80％)，淡黄色油状物。不经纯化用于下一步。esi：m/z＝298(m+h)
+
。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ[ppm]＝2.57(t,2h),2.87(t,2h),2.96-3.01(m,4h),3.58(t,2h),3.74(t,2h),7.31-7.36(m,4h),7.76(br s,3h)。
[0733]
向3-(4-((3-(2-氨基乙氧基)丙酰基)硫代)苯基)丙酸三氟乙酸盐(最大0.453mmol)的n，n-二甲基甲酰胺(3.70ml)和乙腈(3.70ml)溶液中添加异硫氰酸荧光素异构体1(176mg，0.453mmol)，然后添加dipea(0.12ml，0.680mmol)。将反应混合物在室温搅拌1小时，然后减压浓缩。材料通过反相色谱法(biotage isolera，60g，c18 snap ultra biotage柱)、使用含有0.1％甲酸的水和含有0.1％甲酸的乙腈(95:5至20:80)纯化。将含有产物的级分冷冻干燥，得到期望的化合物(145mg，2步产率51％，纯度68％)，橙色固体。esi：m/z＝687(m+h)
+
。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ[ppm]＝2.55(t,2h)(与dmso峰重叠),2.85(t,2h),2.99(t,2h),3.61(t,2h),3.67-3.72(m,2h),3.76(t,2h),6.55-6.69(m,6h),7.18(d,1h),7.29-7.34(m,4h),7.74(d,1h),8.10(br s,1h),8.26(s,1h),10.05(br s,1h),10.13(br s,2h),12.16(br s,1h)。
[0734]
向3-(4-((3-(2-(3-(3'，6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)硫脲基)乙氧基)丙酰基)硫代)苯基)丙酸(140mg，0.204mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(4.70ml)溶液中添加n-羟基琥珀酰亚胺(117mg，1.02mmol)，然后添加edci.hcl(196mg(1.02mmol)。在室温下继续搅拌1小时。反应混合物直接通过反相色谱法(biotage isolera,60g,c18 snap ultra biotage柱)、使用含有0.1％甲酸的水和含有0.1％甲酸的乙腈(80:20至30:70)纯化。将含有产物的级分冷冻干燥，得到期望的化合物(25.3mg，产率16％，纯度81％)，橙色固体。esi：m/z＝784(m+h)
+
。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ[ppm]＝2.81(s,4h),2.96-3.06(m,6h),3.62(t,2h),3.68-3.71(m,2h),3.76(t,2h),6.56(dd,2h)),6.61(d,2h),6.68(d,2h),7.18(d,1h),7.33(d,2h),7.39(d,2h),7.74(d,1h),8.08(br s,1h),8.26(d,1h),10.03(br s,1h),10.13(br s,2h)。
[0735]
实施例5：含dota的反应性偶联物的制备
[0736]
通过将化合物17(或化合物19)偶联至各个fc结合载体的n端，将实施例1中制备的fc结合载体转化为式(1)的反应性偶联物(图2b)。实施例5中制备的含dota的反应性偶联物
的结构如下表所示。
[0737]
[0738][0739]
表4:式(1)的含有dota的反应性偶联物的结构
[0740]
为了制备反应性偶联物，将碳酸盐(酯)衍生物(1.2当量；化合物17)的dmf溶液添加至hatu(1.1当量)中并搅拌1分钟，然后添加diea(2当量)。3分钟后，将预活化碳酸盐(酯)衍生物加入至fc结合载体且反应混合物在室温下搅拌2至4小时。通过uplc-ms监测反应的完成。如果反应没有完成，则添加额外量的预活化碳酸盐(酯)衍生物(约1至3当量)，并将混合物进一步搅拌1至2小时。反应性偶联物用冷乙醚沉淀并通过hplc纯化(如上所述)。
[0741]
随后，通过在室温下用tfa/tis/水(95/2.5/2.5,v/v/v)处理超过2.5小时来除去dota部分的叔丁基保护基团，然后用冷乙醚沉淀并通过hplc纯化(如上所述)。
[0742]
反应性偶联物的纯度在waters acquity uplc系统上、使用溶剂系统测定，该系统与具有xb-c18柱(1.7μm，50
×
2.1mm；phenomenex helvetia)的micromass quattro micro api质谱仪偶联，该溶剂系统使用溶剂系统a(0.1％tfa的水)和b(0.1％tfa的acn)、以0.6ml/min的流速和4min内2-98％的b梯度。在214nm波长下监测偶联物的洗脱。结果如下表所示。
[0743][0744]
表5:反应偶联物24-34的特性
[0745]
dota部分中的铟螯合通过将incl3溶解在超纯水(1.5当量，14.2nmol，2μl)中、在50mm乙酸钠缓冲液(ph 5(3μl))中与上述反应性偶联物(9.45nmol，5μl)混合，且在37℃下温育5-30分钟来执行。通过uplc-ms监测和分析in-螯合作用。
[0746]
实施例6：曲妥珠单抗-dota偶联物的制备
[0747]
使用曲妥珠单抗作为模型系统评估实施例5的反应性偶联物与抗体反应的倾向。为了制备曲妥珠单抗-dota缀合物，将实施例5中制备的2当量反应性偶联物(化合物24-33；1.62nmol，0.86μl)的dmf添加至在50mm的、ph9.0的nahco3中稀释的曲妥珠单抗(1当量，0.81nmol；购自roche的市售曲妥珠单抗在偶联之前在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中缓冲交换)溶液，并将反应混合物(24μl)在室温下搅拌2小时。
[0748]
在dota偶联后，将反应缓冲液用ph 2.5的0.1m甘氨酸稀释或使用30kda500离心浓缩器来交换为ph2.5的0.1m甘氨酸。然后使用预平衡的bio-spin p-30柱(床高：3.7cm，总长度：5cm；购自bio-rad，usa)、通过凝胶过滤色谱法纯化抗体偶联物，然后用ph2.5的0.1m甘氨酸洗脱抗体偶联物。用ph8.5的1m pbs中和纯化的抗体偶联物级分。
[0749]
通过hrms分析评估dota部分与曲妥珠单抗的偶联(如上所述)。通过使化合物31与曲妥珠单抗反应制备的曲妥珠单抗-dota偶联物的示例性hrms谱图在图6中示出。样品显示+517da加合物(d1-d3)，这是dota掺入的特征。
[0750]
通过用gingiskhan蛋白酶消化偶联物(在2mm半胱氨酸，0.1m tris，ph8.0存在下，在37℃下1小时，每μg抗体偶联物1单位)评估fc与f(ab)2之间的有效负载比(选择性)，和随后的hrms分析(如上所述)。消化偶联物的示例性hrms光谱显示图7中示出。峰d0-d2对应于偶联dota部分的数量，而g0f/g0f、g0f/g1f和g1f/g1f对应于fc区域的不同聚糖。
[0751]
曲妥珠单抗-dota偶联物的偶联度(doc)基于hrms分析的结果(如上所述)来评估。hrms分析结果在下表6中示出。
[0752][0753]
这些结果表明化合物(反应性偶联物)27至33可以产生对抗体的fc区域具有优异的选择性的曲妥珠单抗-dota偶联物。特别是，化合物27、30和31产生了具有优异选择性和产率的曲妥珠单抗-dota偶联物。
[0754]
使用hrms通过肽谱图分析曲妥珠单抗-dota偶联物，以确定抗体上dota部分的偶联位点(数据未显示)。发现在大多数偶联物中，fc区域的lys317几乎被定量标记，而在每个fc区域带有3个dota部分的具有较高doc的偶联物中另外观察到lys326的标记。
[0755]
实施例7：曲妥珠单抗-dota偶联物和曲妥珠单抗对sk-br-3(her2+)和md-mb-231(her2-)细胞的亲和力
[0756]
通过测量偶联物对skbr-3(her2+)和mda-mb-231(her2-)乳腺癌细胞系的亲和力来评估曲妥珠单抗-dota偶联物结合腺癌细胞的倾向。具体地，通过将曲妥珠单抗-dota偶联物和(未标记的)曲妥珠单抗、与skbr-3或mda-mb-231细胞一起温育，使用流式细胞术测量以与实施例6中相同的方式制备的曲妥珠单抗-dota偶联物的亲和力(类似于偶联物8；doc＝0.89)。随后，添加对曲妥珠单抗特异性的荧光二抗，以通过荧光测量结合。结果在图8中示出。
[0757]
如图8所示，当使用未标记的曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-dota偶联物时，中值荧光强度(median fluorescence intensity，mfi)以剂量反应方式增加，证实了dota偶联物不影响抗体与skbr-3细胞的结合。浓度为30μg/ml的曲妥珠单抗和偶联物(skbr-3细胞)的平均荧光强度降低可以通过高浓度的一级抗体来解释。两种样品(阴性对照)均未观察到与mda-mb-231的结合。
[0758]
实施例8：含fl的反应性偶联物的制备
[0759]
根据如上面实施例5中描述的相同步骤，通过将化合物19偶联至各个fc结合配体的n端，将实施例1中制备的fc结合载体转化为式(1)的反应性偶联物(化合物35-42)(图9b)。实施例8中制备的含fl的反应性偶联物在下表中示出。
[0760][0761][0762]
表7:式(1)的含fl的反应性偶联物的结构
[0763]
通过uplc-ms测定反应性偶联物的纯度(如上所述)。结果在下表中示出。
[0764][0765][0766]
表8:反应性偶联物35-42的特性
[0767]
实施例9：曲妥珠单抗-fl偶联物的制备
[0768]
使用曲妥珠单抗作为模型系统评估实施例8的反应性偶联物与抗体反应的倾向。使用化合物35-41、根据与上述实施例6中描述的相同的步骤制备曲妥珠单抗-fl配合物。通过sds-page分析获得的曲妥珠单抗-fl偶联物(图10)。
[0769]
发现化合物36-39引起有效的曲妥珠单抗标记和对fc区域的良好选择性(图10中的泳道2-5)。当使用化合物40和41时(阴性对照；泳道6和7)，未观察到曲妥珠单抗标记。
[0770]
为了制备曲妥珠单抗-fitc(随机)偶联物，将10当量fitc(0.47μmol，25.5μl)的dmso溶液添加至在50mm、ph9.0的nahco3中稀释的曲妥珠单抗(1当量，47nmol；购自roche的市售曲妥珠单抗在偶联之前将曲妥珠单抗缓冲交换至磷酸盐缓冲盐水(pbs)中)的溶液中，并且将反应混合物(1.4ml)在室温下搅拌16小时。
[0771]
在fitc偶联后，反应缓冲液用0.1m的、ph2.5的甘氨酸稀释。然后使用手动填充有bio-spin p-30细珠(床高：5.0cm)的预平衡柱、通过凝胶过滤色谱法纯化抗体偶联物，然后用0.1m的ph 2.5的甘氨酸洗脱抗体偶联物。纯化的抗体偶联物级分用ph8.5的1m磷酸盐缓冲液来中和。
[0772]
通过hrms分析评估该部分与曲妥珠单抗的偶联(如上所述)。曲妥珠单抗-fitc和曲妥珠单抗-fi的hrms分析结果显示在下表9中示出。
[0773][0774][0775]
表9:实施例9中制备的曲妥珠单抗-fi偶联物和曲妥珠单抗-fitc偶联物的特性
[0776]
实施例10：曲妥珠单抗-fl偶联物、曲妥珠单抗-fitc偶联物(11,12)对bt-474(her2+)和mda-mb33(her2-)细胞的亲和力
[0777]
通过测量偶联物对bt-474(her2+)和mda-mb33(her2-)乳腺癌细胞系的亲和力来
评估曲妥珠单抗-fl偶联物、曲妥珠单抗-fitc偶联物与腺癌细胞的结合倾向。具体地，通过将曲妥珠单抗-fl偶联物、曲妥珠单抗-fitc偶联物和(未标记的)曲妥珠单抗、与skbr-3或mda-mb-231细胞一起温育，使用流式细胞术测量如实施例9中描述的制备的曲妥珠单抗-fitc偶联物的亲和力(ms数据在表9中示出)。
[0778]
如图11所示，在添加未标记的曲妥珠单抗(竞争抗体)后，fitc-偶联抗体和fl-偶联抗体的平均荧光指数(mean fluorescence index，mfi)以剂量反应的方式降低。对于偶联物11观察到接近50％的mfi降低，而对于偶联物12在等摩尔浓度的标记抗体和未标记抗体(10μg/ml)处mfi降低接近70％。这些结果表明荧光素偶联物不影响抗体与her2细胞的结合，而偶联物12的随机标记影响抗体的亲和力。两种样品均未观察到与mda-mb33的结合(阴性对照，数据未显示)。
[0779]
实施例11：使用曲妥珠单抗、商业曲妥珠单抗、阿仑单抗、贝伐单抗和利妥昔单抗来制备抗体-fl偶联物
[0780]
使用曲妥珠单抗、商业曲妥珠单抗阿仑单抗、贝伐单抗和利妥昔单抗来评估本发明的反应性偶联物与不同抗体反应的倾向。根据与上述实施例6中描述的相同步骤，使用化合物38和上述抗体制备抗体-fl偶联物。通过sds-page分析偶联物(图12)。
[0781]
发现化合物38引起有效的抗体标记(图12中的泳道1、3、5、7和9)。当使用化合物40时未观察到曲妥珠单抗标记(泳道2,4,6,8和10)。
[0782]
实施例12：含有dbco的反应性偶联物和曲妥珠单抗-dbco偶联物的制备
[0783]
通过将化合物20偶联至各个fc结合配体的n端，将实施例1中制备的fc结合配体(化合物10)转化为式(1)的相应反应性偶联物。实施例12中制备的含dbco的反应性偶联物的结构在下表中示出。
[0784][0785]
表10:式(1)的含dbco的反应性偶联物的结构反应性偶联物的纯度通过uplc-m测定(如上所述)。结果在下表中示出。
[0786][0787]
表11:反应性偶联物43的特性
[0788]
使用化合物43和商业曲妥珠单抗根据与上述实施例6中描述的相同步骤制备曲妥珠单抗-dbco偶联物。用gingiskhan消化偶联物、并且如上面描述通过hrms分析。结果在下表中示出。
[0789][0790]
表12:实施例12中制备的曲妥珠单抗-dbco偶联物的特性
[0791]
实施例13：固定化含fl反应性偶联物的制备及曲妥珠单抗的固相修饰
[0792]
制备固定在固体支承物上的反应性偶联物，并评估该反应性偶联物与曲妥珠单抗反应的倾向。
[0793]
使用4-fmoc-肼基苯甲酰基am novagel
tm
(负载0.61mmol/g)和liberty blue
tm
自动微波肽合成仪(购自cem公司，德国)，通过标准fmoc/tbu类spps来制备生物素化的fc结合载体。在室温下，使用利用0.5m dic预活化的0.2m fmoc氨基酸和1m的dmf执行酰胺键形成的偶联反应超过4分钟。使用10％哌嗪的dmf(v/v)执行fmoc去保护。
[0794]
合成完成后，通过将树脂重新悬浮在dmf中并与1.4当量的cuii(aco)2*h2o、3.5当量的生物素-peg
4-nh2和3当量吡啶混合，将肽从树脂手动裂解。将反应在室温下搅拌4小时。过滤裂解混合物，肽用水沉淀并过滤。将沉淀物(pellet)溶解在裂解混合物(tfa/tis/水90:5:5)中，并且通过在室温下搅拌2小时使肽的侧链脱保护。浓缩混合物且粗肽(化合物41)用冷乙醚沉淀、离心、用冷乙醚洗涤、干燥、溶解在超纯水/乙腈中、冻干、并通过hplc纯化。
[0795]
将fmoc-nh-(peg)
20-cooh(1.3当量，4.7μmol)和hatu(1.2当量，4.33μmol)的dmf溶液搅拌1分钟，并添加diea(10当量，35.8μmol)。预活化3分钟后，将生物素化的fc结合肽(化合物44)的dmf(1当量，3.58μmol)溶液添加至反应混合物中并在室温下搅拌1-2小时以制备化合物45。由ulpc-ms监测反应完成。然后用冷乙醚沉淀肽。用20％哌啶的dmf(v/v)在室温下执行fmoc脱保护30分钟，然后用冷乙醚沉淀肽，并通过hplc纯化。
[0796]
根据与上述实施例5中描述的相同步骤，通过将化合物19偶联至化合物45的n端，将生物素化的fc结合配体转化为反应性偶联物(化合物46)。实施例13中制备的化合物的结构在下表中示出。
[0797][0798]
表13:实施例13制备的化合物的结构
[0799]
为了将生物素化的反应偶联物固定在固体支承物上，将neutravidin琼脂糖树脂(赛默飞世尔)填充至柱(赛默飞世尔)中，并用结合缓冲液(0.1m磷酸盐缓冲液，0.15m氯化钠，ph 7.2)清洗。化合物46(2.1nmol)与洗涤过的neutravidin琼脂糖珠(40μl珠：7.5μg肽)
在室温下温育30分钟(图13)。
[0800]
将珠用结合缓冲液洗涤4次，然后添加50mm ph 9.0的bicine以增加ph值。将ph 7.0的曲妥珠单抗的pbs(2.1nmol)添加至珠中，将混合物在室温下搅拌2小时，然后用结合缓冲液洗涤3-4次。将标记的曲妥珠单抗(100μl，0.1m的甘氨酸，ph 2.5)以1:10的体积比洗脱至含有中和缓冲液(1m、ph 8.5的磷酸盐缓冲液)的收集管中。重复洗脱步骤，合并级分。然后使用30kda的mwco500离心浓缩器将洗脱的标记曲妥珠单抗与ph 7.0的pbs进行缓冲交换。
[0801]
然后通过sds-page分析抗体。凝胶显示一条荧光带，这表明fl部分与曲妥珠单抗成功偶联。
[0802]
实施例14：其他含有有效负载碳酸盐(酯)的反应性偶联物的制备
[0803]
通过将不同有效负载(dtpa、pcta、dfo)耦合至nh
2-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii，将实施例1中制备的fc结合载体转化为式(1)的反应性偶联物(化合物47-49)。这些含有有效负载的反应性偶联物的结构在下表中示出。
[0804][0805]
表14:式(1)的其他含有有效负载碳酸盐(酯)的反应性偶联物的结构
[0806]
通过uplc-ms测定反应性偶联物的纯度(如上所述)。结果在下表中示出。
[0807][0808]
表15:肽反应性偶联物的特性
[0809]
nh
2-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii的制备：
[0810][0811]
步骤1.在室温下，将diea添加至在4-[2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基羰氧基]苯甲酸(2.35mg，6.4mol，1.3当量)的dmf(0.65ml)溶液中。在室温下搅拌1分钟后，将hatu.hpf6(2.81mg，5.4mol，1.1当量)添加至反应混合物中。在室温搅拌3分钟后，将化合物7(10.0mg，4.9μmol，1.0当量)的dmf(0.65ml)溶液添加至反应混合物中。在室温搅拌18小时后，添加2滴0.1％tfa的水溶液。在c18(12g，30-70％acn+0.1％tfa的水+12cv以上0.1％tfa)上纯化，冻干后得到bochn-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii(2.4mg，1.0μmol，uv纯度95％，20％产率)，白色粉末。uplc-ms：rt＝2.78min，m/z＝1147[m-boc+2h]
2+
、1195[m-2h]
2-。
[0812]
步骤2.将tfa添加至bochn-carb-peg
10-fciii(23.9mg，8.3μmol，1.0当量)的dcm(0.5ml)溶液中。将反应混合物在室温搅拌1.5小时，然后在真空下浓缩。添加acn/水的混合物(1:1，5ml)，并将混合物冷冻干燥，得到h2n-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii(23.7mg，8.3μmol，uv纯度99％，定量产率)，白色粉末。uplc-ms：rt＝2.20min，m/z＝1147[m+2h]
2+
、1145[m-2h]
2-。
[0813]
dtpa-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii的制备：
[0814]
在室温下，将p-scn-bn-chx-a
”‑
dtpa.3hcl(4.47mg，6.0μmol，1.0当量)添加至nh
2-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii(14.35mg，6.0μmol，1.0当量)的dmf(0.3ml)溶液中。将反应混合物在室温搅拌5分钟，然后添加三乙胺(4.0μl，30.0μmol，5.0当量)。在室温下搅拌36小时后，添加p-scn-bn-chx-a
”‑
dtpa.3hcl(0.90mg，1.2μmol，0.2当量)和三乙胺(0.5μl，3.6μmol，0.6当量)，并且将反应混合物在室温下搅拌18h。通过制备型hplc(30-60％acn+0.1％fa的水+0.1％fa)纯化，冷冻干燥后得到dtpa-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii(1.4mg，0.52μmol，8.7％产率)，白色粉末。
[0815]
pcta-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii的制备：
[0816]
在室温下，将p-scn-bn-pcta.3hcl(4.15mg，6.5μmol，1.05当量)添加至nh
2-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii(14.9mg，6.2μmol，1.0当量)的dmf(0.1ml)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加三乙胺(4.2μl，30.0μmol，5.0当量)加入。在室温搅拌3小时后，在室温下将1p-scn-bn-pcta.3hcl(4.15mg，6.5μmol，1.05当量)添加至反应混合物。在室温下搅拌16小时后，通过制备型hplc(28-37％acn+0.1％tfa的水+0.1％tfa)纯化，冷冻干燥后得到pcta-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii(2.53mg，8.97μmol，14％产率)，白色粉末。
[0817]
dfo-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii的制备：
[0818]
在室温下，将diea(10μl，80.0mol，16.0当量)添加至在nh
2-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii(12.42mg，4.9μmol，1.0当量)和dfo-nhs(8.2mg，5.9μmol，1.2当量)的dmf(0.4ml)溶液。在室温下搅拌3.5h后，添加acn/水/tfa(1:1:0.5％，0.2ml)，并在室温下搅拌反应混合物5min。通过制备型hplc纯化(25-60％acn+0.1％fa的水+0.1％fa)纯化，冷冻干燥后得到dfo-碳酸盐(酯)-peg
10-fc-iii(1.6mg，0.45μmol，uv纯度86％，9％产率)，白色粉末。
[0819]
实施例15：曲妥珠单抗-dtpa/pcta/dfo偶联物的制备
[0820]
使用曲妥珠单抗评估实施例14的反应性偶联物与抗体反应的倾向。曲妥珠单抗dtpa/pcta/dfo偶联物根据与上文实施例6中描述的相同步骤、使用化合物47-49制备。通过hrms分析得到的曲妥珠单抗dtpa/pcta/dfo偶联物(表16)。
[0821][0822]
表16:曲妥珠单抗-dtpa/pcta/dfo偶联物的特性
[0823]
将*数值外推：选择性fc/f(ab)2＝(doc mab
–
doc f(ab)2)/doc(fab)2[0824]
实施例16：具有不同化学性质或反应性调节剂的含fl的反应性偶联物的制备
[0825]
根据下述步骤，通过将fl-碳酸萘/-碳酸异喹啉/-ch2ch2硫酯(化合物21-23)耦合至fc结合配体7的n端，实施例1中制备的fc结合载体转化为反应性偶联物。实施例16中制备的这些含有有效负载的反应性偶联物的结构在下表中。
[0826][0827]
表17:具有不同化学性质或反应性调节剂的含fl的反应性偶联物的结构
[0828]
化合物50(萘)的制备：
[0829]
在环境温度下，向2,5-二氧吡咯烷-1-基-6-(((2-(3-(3',6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)硫脲基)乙氧基)乙氧基)羰基)氧基)-2-萘酚(19.0mg，0.023mmol)和化合物7(40.0mg，0.019mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(1.00ml)溶液中添加dipea(10.0μl，0.057mmol)。将混合物搅拌3小时，然后在60g的c18柱上用在5-95％乙
腈(0.1％甲酸)的水(0.1％甲酸)洗脱液进行纯化。合并期望的级分并冷冻干燥。所得材料与从2,5-二氧吡咯烷-1-基6-(((2-(3-(3',6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)硫脲基)乙氧基)乙氧基)羰基)氧基)-2-萘酚(11.0mg，0.014mmol)与tfa.peg
10-fciii(30.0mg，0.014mmol)和dipea(7.00μl，0.042mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(1.00ml)中反应获得的类似批次合并，并在60g的c18柱上用20-60％乙腈(0.1％甲酸)的水(0.1％甲酸)洗脱液进一步纯化。将期望的级分合并并冷冻干燥，得到标题化合物(11.9mg，13％合并产率，纯度95％)。uplc4-ms：rt＝1.95min.，94.5％。esi：m/z＝911.8[m+3h]/3
+
。
[0830]
化合物51(异喹啉)的制备：
[0831]
向2,5-二氧吡咯烷-1-基6-(((2-(3-(3',6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)硫脲基)乙氧基)乙氧基)羰基)氧)喹啉-2-羧酸盐(酯)(11.0mg，0.014mmol)和tfa.peg
10-fciii(30.0mg，0.014mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(1.00ml)溶液中添加dipea(7.00μl，0.042mmol)。将混合物搅拌2小时，然后在60g的c18柱上用20-60％乙腈(0.1％甲酸)的水(0.1％甲酸)洗脱液进行纯化。合并期望的级分并冷冻干燥，得到标题化合物(8.70mg，产率23％，纯度93％)，黄色粉末。uplc-ms：rt＝1.93min。esi：m/z＝912.0[m+3h]/
3+
。
[0832]
化合物52(硫酯)的制备：
[0833]
向2,5-二氧吡咯烷-1-基3-(4-((3-(2-(3-(3',6'-二羟基-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)硫脲基)乙氧基)丙酰基)硫代)苯基)丙酸盐(酯)(12.8mg，0.0163mmol)和化合物7(21.1mg，0.00980mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(1.00ml)溶液中添加dipea(8.52μl，0.0489mmol)。在室温下继续搅拌2小时。通过反相色谱法(biotage isola，60g，c18 snap ultra biotage cartridge)、使用含有0.1％甲酸的水和含有0.1％甲酸的乙腈(80:20至30:70)直接纯化反应。将含有产物的级分冷冻干燥，得到期望的化合物(4.88mg，产率4％，纯度87％)，黄色固体。uplc4-ms：rt＝1.67min。esi：m/z＝904[m+3h]/3
+
。
[0834]
实施例17：曲妥珠单抗-fl偶联物的制备
[0835]
使用曲妥珠单抗评估实施例16的反应性偶联物与抗体反应的倾向。使用化合物50-52、根据与上述实施例6中描述的相同步骤制备曲妥珠单抗-fl偶联物。通过hrms分析获得的曲妥珠单抗-fl偶联物(表18)。
[0836][0837]
表18:曲妥珠单抗-fl偶联物的特性。

技术特征：
1.一种由下式(1)表示的化合物：p-y-s-v
ꢀꢀꢀꢀ
(1)其中，p为有效负载；y为能够与氨基酸的侧链反应的反应性部分，优选为能够与赖氨酸的侧链反应的部分；v为载体，所述载体能够与抗体或抗体片段的片段可结晶(fc)区域相互作用，所述抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中；s为具有长度z的间隔物，其中z为使得当所述载体v与所述抗体或抗体片段的所述fc区域相互作用时、所述反应性部分y能够在所述抗体或抗体片段上与氨基酸残基的侧链反应的长度；2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述有效负载包括选自以下的部分、以及所述部分的放射性同位素和/或所述部分的药学上可接受的盐：(i)选自以下的部分：
·
标记部分，所述标记部分可以包括放射性核素，所述标记部分优选为螯合剂，所述螯合剂诸如为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、环己基二亚乙基三胺五乙酸(ch-x-dtpa)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(pcta)或去铁胺(dfo)，其中所述螯合剂任选地螯合放射性核素；
·
发色团；
·
荧光团，诸如荧光素或罗丹明；以及
·
含有诸如
125
i、
123
i、
131
i、
18
f、
11
c、
15
o、
18
f的放射性核素的标记部分，例如，衍生自含有诸如
125
i、
123
i或
131
i的放射性核素的4-羟基苯丙酸酯的部分；(ii)选自包含偶联基团的部分的部分，所述包含偶联基团的部分包括任选取代的共轭二烯、任选取代的四嗪(tz)、任选取代的炔烃或叠氮化物、任选取代的二苯并环辛炔(dbco)、任选取代的反式-环辛烯(tco)、任选取代的双环[6.1.0]壬炔(bcn)、任选取代的醛、任选取代的酮、以及任选取代的肼；(iii)衍生自选自以下的药物的部分
·
抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂诸如为dna-烷化剂，所述dna-烷化剂例如为多卡霉素；
·
拓扑异构酶抑制剂，例如多柔比星；
·
rna-聚合酶ii抑制剂，例如α-鹅膏蕈碱；
·
dna裂解剂，例如卡利奇霉素；
·
抗有丝分裂剂或微管干扰剂，例如紫杉烷、澳瑞他汀或美登醇；
·
抗代谢物；
·
激酶抑制剂，例如帕他色替；
·
免疫调节剂；
·
抗感染性疾病剂；3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，所述有效负载是任选螯合放射性核素的螯合剂，所述螯合剂优选是衍生自以下的部分：dtpa、ch-x-dtpa、dfo、1-(1,3-羧丙基)-4,7-羧甲基-1,4,7-四乙酸(nodaga)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-戊二酸-4,7,10-三乙酸
(dotaga)、2,2'-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸盐(酯)(no2a)、dota、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(nota)、乙二胺四乙酸(edta)、乙二胺二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸(ttha)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(cyclam)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(teta)、1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸(cb-te2a)、2,2',2
”‑
(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(do3am)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,7-二乙酸(do2a)、1,5,9-三氮杂环十二烷(tacd)、(3a1s,5a1s)-十氢-3a,5a,8a,10a-四氮杂(顺-乙二醛-环拉胺)、1,4,7-三氮杂环壬烷(tacn)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(轮环藤宁)、三(羟基吡啶酮)(thp)、3-(((4,7-双((羟基(羟甲基)磷酰基)甲基)-1,4,7-三唑烷-1-基)甲基)(羟基)磷酰基)丙酸(nopo)、pcta、2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酸(trita)、2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(tritam)、2,2',2
”‑
(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(tritram)、反式-n-二甲基环拉胺、2,2',2
”‑
(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(notam)、氧环拉胺、二氧环拉胺、1,7-二氧杂-4,10-二氮杂环十二烷、交联桥环拉胺(cb-环拉胺)、三氮杂环壬烷亚膦酸盐(酯)(trap)、双吡哆酸基二磷酸盐(酯)(dpdp)、内消旋-四(4-磺酰基苯基)卟吩(tpps4)、亚乙基双羟基苯基甘氨酸(ehpg)、六亚甲基二胺四乙酸、二甲基膦基甲烷(dmpe)、亚甲基二磷酸、二巯基琥珀酸(dmpa)或其衍生物；更优选衍生自dtpa、dota、dfo、nota、pcta、ch-x-dtpa、nodaga或dotaga的部分。4.根据权利要求2或3所述的化合物，其中，所述放射性核素选自
124
i、
131
i、
86
y、
90
y、
177
lu、
111
in、
188
re、
55
co、
64
cu、
67
cu、
68
ga、
89
zr、
203
pb、
212
pb、
212
bi、
213
bi、
72
as、
211
at、
225
ac、
223
ra、
97
ru、
149
tb、
152
tb、
161
tb、
99
mtc、
226
th、
227
th、
201
tl、
89
sr、
44/43
sc、
47
sc、
153
sm、
133
xe和al
18
f，优选选自
89
zr、
111
in、
64
cu、
177
lu、
68
ga、
99m
tc、
203
pb、
72
as、
55
co、
97
ru、
201
tl、
152
tb、
133
xe、
86
y和al
18
f，更优选地选自
89
zr、
111
in、
64
cu、
177
lu、
68
ga和
99m
tc，特别是
111
in。5.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，有效负载是衍生自以下的部分、或所述部分的放射性同位素和/或所述部分的药学上可接受的盐：依喜替康、pnu-159682、鹅膏蕈碱、多卡霉素、澳瑞他汀、美登素、微管溶素、卡利奇霉素、sn-38、紫杉醇、道诺霉素、长春碱、多柔比星、甲氨蝶呤、吡咯并苯并二氮杂卓、吡咯类纺锤体驱动蛋白(ksp)抑制剂、吲哚啉-苯并二氮杂卓二聚体。6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中，p由下式(2)表示：p
1-l
‑‑
*'
ꢀꢀꢀꢀ
(2)其中，p1为根据权利要求2至5中任一项所定义的有效负载；l为接头，优选为包含选自碳、氮、氧和硫的一个或多个原子的接头，所述接头任选地为可裂解的；*'指代共价附接至所述反应性部分(y)。7.根据权利要求6所述的化合物，其中，所述接头选自：(a1)具有1至12个碳原子的亚烷基，优选具有2至6个碳原子的亚烷基，诸如为亚丙基；(b1)具有2或3个碳原子、且具有1至36个重复单元的聚环氧烷基；优选为由式-nh-(ch2ch2o)
n1-ch2ch2–
表示的基团，其中n1为0至35的整数，n1例如为1至20的整数；(c1)具有2至12个氨基酸的肽基团。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中，所述反应性部分由下式(3a)表示：**
‑‑
(f1-rc-f2)
‑‑
*
ꢀꢀꢀꢀ
(3a)其中，rc为反应中心，优选为亲电反应中心，并且更优选为选自c＝o和c＝s的基团；f1为单个共价键、原子或原子基团；优选为选自o和s的原子，或包含选自c、n、o和s的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自o和s的原子；f2表示原子或原子基团；优选为选自o和s的原子，或包含选自c、n、o和s的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自o和s的原子；*指代共价附接至所述间隔物(s)；并且**指代共价附接至所述有效负载(p)。9.根据权利要求8所述的化合物，其中所述反应性部分由下式(4a)至(4n)中的一者表示：其中，*指代共价附接至所述间隔物(s)，**指代共价附接至所述有效负载(p)。10.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中，所述反应性部分由下式(3b)表示：**
‑‑
(f1-rc-f2)-(m)
‑‑
*
ꢀꢀꢀ
(3b)其中，rc为反应中心，优选为亲电反应中心，且更优选为选自c＝o和c＝s的基团；f1是单个共价键、原子或原子基团；优选为选自o和s的原子，或包含选自c、n、o和s的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自o和s的原子；f2表示原子或原子基团；优选为选自o和s的原子，或包含选自c、n、o和s的一个或多个
原子的原子基团；更优选为选自o和s的原子；m为能够调节f2的电子密度和稳定性的基团，优选为能够吸电子的基团；*指代共价附接至所述间隔物(s)；并且**指代共价附接至所述有效负载(p)。11.根据权利要求10所述的化合物，其中，能够调节f2的所述电子密度和稳定性的所述基团由下式(3c)表示：***'
‑‑
m'—b—c
‑‑
*
ꢀꢀꢀꢀ
(3c)其中，m'为分别具有6元环、10元环或14元环，和1个、2个或3个稠环的芳基；或具有5至20元环，1个、2个或3个稠环，和独立地选自n、o和s的1至4个杂原子的杂芳基；所述m'能够由一个或多个取代基取代；优选为能够由一个或多个取代基取代的苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基或苯并三唑基，各取代基优选选自-f、-br、-cl、-i、-no2、-cn、-c
1-6-烷基、-c
1-6-烷氧基、诸如-c(o)nh2的-c
1-6-氨基、及它们的组合诸如-ccl3、-cf3或-ch2no2；b为单个共价键、o、s、nr'，其中，r'表示氢原子、oh、烷基或环烷基、c
2-6-亚烯基、c
2-6-亚炔基、具有以下通式的基团或它们的任何组合：
–
(ch2)
n1-(h1)
x1-(ch2)
n2-(h2)
x2-(ch2)
n3-(h3)
x3-(ch2)
n4
‑ꢀꢀꢀꢀ
(3c')其中，n1、n2、n3和n4中的每个表示独立地选自0至10的整数，使得n1+n2+n3+n4为10或更小，x1、x2和x3中的每个独立地选自0和1，并且h1、h2和h3中的每个为独立地选自n、o和s的原子，条件是，如果x1+x2＝2、则n2≥1，如果x2+x3＝2、则n3≥0，如果x1+x3＝2、则n2≥1或n3≥1，如果x1+x2+x3为3、则n2≥1且n3≥1；或b优选为单个共价键、nh或c
1-10-亚烷基；更优选为单个共价键；c为c＝o、c＝s、c(＝nr”)，其中r”表示氢原子、oh、烷基或环烷基、s＝o或s(＝o)2；优选为c＝o；*指代共价附接至间隔物(s)；并且***'指代共价附接至f2。12.根据权利要求10或11所述的化合物，其中，所述部分(f1-rc-f2)由下式(4a')至(4m')中的一者表示，和/或m独立地由下式(5a)至(5j')中的一者表示：
其中，*指代共价附接至间隔物(s)，**指代共价附接至有效负载(p)，***指代共价附接至m，***’指代共价附接至f2。13.根据权利要求10至12中任一项所述的化合物，其中所述反应性部分由下式(6a)至(6l')中的一者表示：
其中*指代共价附接至间隔物(s)，**指代共价附接至有效负载(p)。14.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中，所述间隔物具有10至的长度；并且所述间隔物优选为主链中具有12至120个原子、例如为16至80个原子的基团，所述原子选自碳、氮、氧和硫；所述间隔物更优选地选自以下的基团：(a2)具有6至36个重复单元、例如为8至24个重复单元的聚环氧烷基团；优选为由下式(7)表示的基团：
–
x1–
(ch2ch2o)
n2
–
ch2ch2–
x2–ꢀꢀꢀꢀ
(7)其中，x1为nh、o或s；优选为nh；x2为nh或c＝o，如果x2共价结合至载体，则x2优选为c＝o；并且n2为4至28的整数，优选为6至20的整数、例如为10；(b2)肽基团，所述肽基团在所述主链中具有6至25个氨基酸、例如在所述主链中具有9个氨基酸，各氨基酸优选选自pro、gly、ala、asn、asp、thr、glu、gln和ser；更优选为pro、gly或ser。15.根据权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中，所述间隔物包括具有4至36个重复单元、优选6至28个重复单元、更优选7至24个重复单元的聚环氧乙烷基团。16.根据权利要求1至15中任一项所述的化合物，其中，所述载体是包括11至17个氨基酸、例如为13至17个氨基酸的序列的肽，优选由下式(8a)和(8b)中的一者表示的肽：
其中，bxx、cxx、dxx、exx、fxx中的每个独立地表示氨基酸；axx表示氨基酸、二羧酸或由下式(9a)表示的肽部分：
‑‑‑
axx1
–
axx2
–
axx3
‑‑‑ꢀꢀꢀꢀ
(9a)其中，在式(9a)中，axx1表示单个共价键或氨基酸，诸如arg；axx2表示氨基酸，诸如gly或cys；并且axx3表示氨基酸，诸如asp或asn；gxx表示氨基酸，或由下式(9b)表示的肽部分：
‑‑‑
gxx1
–
gxx2
–
gxx3
‑‑‑ꢀꢀꢀꢀ
(9b)其中，在式(9b)中，gxx1表示氨基酸，诸如thr；gxx2表示氨基酸，诸如tyr或cys；并且gxx3表示单个共价键或氨基酸，诸如his；并且axx2的侧链可以共价结合至gxx2的侧链以形成环；如果axx2为cys且gxx2为cys，则优选将axx2和gxx2的侧链连接在一起以形成式-(s-x
4-s)-的基团，其中x4表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或更多个原子的二价基团，所述二价基团诸如为二价马来酰亚胺基、二价丙酮基或二价亚芳基，所述x4优选为单个共价键；hxx表示单个共价键或三官能氨基酸，所述三官能氨基酸猪如为二氨基羧酸；z1表示
·
如果hxx为单个共价键，则z1表示共价结合至gxx的c端的基团，所述基团选自：-n(h)(r)，其中r表示氢原子、烷基或环烷基，以及衍生自含有偶联基团的化合物的部分，所述偶联基团选自生物素、dbco、tco、bcn、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇；
·
如果hxx为三官能氨基酸、且y'结合至hxx的侧链，则z1表示共价结合至hxx的c端的基团，所述基团优选为n(h)(r)，其中如果z1共价结合至hxx的c端，则r表示氢原子、烷基或环烷基；或者
·
如果hxx为三官能氨基酸、且y'结合至hxx的c端，则z1表示结合至hxx的侧链的氢原子。
z2表示
·
如果hxx为单个共价键，则z2表示共价结合至axx的n端的基团，所述基团选自氢原子、诸如乙酰基的含羰基基团和诸如生物素的含有偶联部分的基团；
·
如果hxx是三官能氨基酸、且y'结合至hxx的侧链，则z2表示共价结合至hxx的n端的基团，所述基团选自氢原子和诸如乙酰基的含羰基基团；或者
·
如果hxx为三官能氨基酸、且y'结合至hxx的n端，则z2表示结合至hxx的侧链的氢原子。如果hxx为三官能氨基酸，则仅存在y'；且
·
如果z1结合至hxx的c端，或者如果z2结合至hxx的n端，则y'表示共价结合至hxx的侧链的部分，
·
如果z1结合至hxx的侧链，则y'表示共价结合至hxx的c端的部分，或
·
如果z2结合至hxx的侧链，则y'表示共价结合至hxx的n端的部分；y'衍生自含有偶联基团的化合物，所述偶联基团优选选自生物素、dbco、tco、bcn、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇；x3表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或更多个原子的二价基团，所述二价基团诸如为二价马来酰亚胺基、二价丙酮基或二价亚芳基，优选地，x3为单个共价键；****指代共价附接至间隔物(s)。17.根据权利要求16所述的化合物，其中，axx、bxx、cxx、dxx、exx、fxx、gxx和hxx中的至少一者定义如下：axx表示选自ala、2,3-二氨基-丙酸(dap)、asp、glu、2氨基辛二酸、α-氨基丁酸、asn和gln的氨基酸，选自琥珀酸、戊二酸和己二酸的二羧酸，或式(9a)的肽部分；axx优选为ala、asp或asn，更优选为asp；其中axx1为单个共价键，axx2为cys，并且axx3为asp；bxx表示选自trp、phe、tyr、苯基甘氨酸(phg)、3-苯并噻吩-2-基-l-丙氨酸、3-萘-2-基-l-丙氨酸、3-联苯-4-基-l-丙氨酸和3-萘-1-基-l-丙氨酸的氨基酸，优选为trp；cxx表示选自his、ala、3-吡啶-2-基-l-丙氨酸、间位-酪氨酸(mtyr)和phe的氨基酸，优选为his、ala或mtyr，更优选为his；dxx表示选自ala、abu、gly、leu、ile、val、met、环己基丙氨酸(cha)、phe、thr、cys、tyr和正亮氨酸(nle)的氨基酸，优选为ala、nle或leu，更优选为leu；exx表示选自ala、gly、asn、ser、abu和asp的氨基酸，优选为ala或gly，更优选为gly；fxx表示选自ala、glu、asp、gln、his、arg、ser和asn的氨基酸，优选为asp或glu，更优选为glu；gxx表示选自thr、ser、ala、asn、val、2-氨基-丁酸(abu)、ile、met、leu、pro、gln和cys的氨基酸，或者式(9b)的肽部分，gxx表示优选为thr或ser，更优选为thr；其中gxx1为thr，gxx2为cys，并且gxx3为单个共价键；以及hxx表示选自dap、dab、lys、orn和高赖氨酸(高-lys)的氨基酸，优选选自dap、dab、lys、orn和高-lys的氨基酸。18.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物，其中，所述载体为由下式(8a')至(8d')中的一者表示的肽：
其中，z1、z2、x3、x4和****如在权利要求16中定义的；优选为由式(8a')或(8b')表示的肽。19.根据权利要求1至18中任一项所述的化合物，所述化合物选自
以及，其中，p为如在权利要求1至5中任一项所定义的，并且y’为如权利要求16中所定义的。20.根据权利要求1至19中任一项所述的化合物，所述化合物选自
以及，21.一种用于位点特异性修饰抗体或抗体片段的试剂盒，所述抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中，所述试剂盒包括根据权利要求1至20中任一项所述的化合物和缓冲液；其中，所述缓冲液的ph优选为5.5至11，更优选为7.5至9.5。22.根据权利要求21所述的用于区域选择性修饰抗体或抗体片段的试剂盒，其中，所述化合物被固定在固相基质上，所述固相基质例如为珠。23.一种用于区域选择性修饰抗体或抗体片段的方法，所述抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中，所述方法包括使抗体或其片段与根据权利要求1至20中任一项所述的化合物反应。24.根据权利要求23所述的方法，其中，
·
所述抗体为单克隆抗体，优选为选自以下组成的组的抗体：阿达木单抗、阿杜那单抗、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗、阿特珠单抗、阿奈妥单抗、阿维鲁单抗、巴匹组单抗、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、贝迈奇单抗、贝西索单抗、贝伐珠单抗、贝洛托舒单抗、本妥昔单抗、维布妥昔单抗、布罗达单抗、博纳吐单抗、卡妥索单抗、西米普利单抗、西妥昔单抗、辛帕奈单抗、克利妥珠单抗、泰坦-克利妥珠单抗、泰坦-克雷内治单抗、达珠单抗、达雷妥尤单抗、地诺单抗、地努妥昔单抗、德瓦鲁单抗、依决洛单抗、埃罗妥珠单抗、依帕伐单抗、恩弗妥单抗、维汀-恩弗妥单抗、依帕珠单抗、依帕珠单抗-sn38、埃达组单抗、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、吉妥昔单抗、戈奈单抗、替伊莫单抗、英比利珠单抗、英夫利昔单抗、英妥珠单抗、奥英妥珠单抗、伊匹单抗、艾萨妥昔单抗、伊西贝单抗、j591 psma-抗体、拉贝珠单抗、莱卡单抗、莫格利珠单抗、奈昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、维博妥珠单抗、普尼珠单抗、雷妥莫单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、司妥昔单抗、沙西妥珠单抗、戈沙妥组单抗、西瑞奈单抗、司妥昔单抗、茄尼醇单抗、他珠单抗、替妥木单抗、替拉奈单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、德喜曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗-、ts23、乌司奴单抗、维多珠单抗、伏妥莫单抗、泽格特奈单抗、扎芦木单抗、扎木单抗、及其片段和衍生物；更优选为阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗、利妥昔单抗或曲妥珠单抗；或者
·
将所述抗体片段掺入至fc-融合蛋白中，所述fc-融合蛋白优选选自贝拉西普、阿柏西普、ziv-阿柏西普、度拉糖肽、利钠西普、罗米司亭、阿巴西普和阿法西普。25.一种修饰抗体或修饰抗体片段，所述修饰抗体或修饰抗体片段通过使抗体或抗体片段与根据权利要求1至20中任一项所述的化合物反应而获得，所述抗体片段任选地掺入至fc-融合蛋白中，其中所述抗体或所述抗体片段优选具有如权利要求24中相同的定义。26.根据权利要求25所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，所述修饰抗体或修饰抗体片段用于诊断、监测、成像或治疗疾病的方法中，所述方法包括向受试者施用所述修饰抗体或所述修饰抗体片段。27.一种用于诊断、监测、成像或治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求25所述的修饰抗体或修饰抗体片段。28.根据权利要求26所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据权利要求27所述的方法，其中，所述疾病为神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫疾病或癌症。29.根据权利要求26或28所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述疾病或其治疗选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、脑动脉硬化症、脑病、亨廷顿氏病、多发性硬化症、帕金森氏病、进行性多灶性白质脑病、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、包括不稳定型心绞痛的心绞痛、主动脉瘤、动脉粥样硬化症、心脏移植、心脏毒性诊断、冠状动脉旁路移植术、包括心房颤动终止收缩性心力衰竭的心脏衰竭、高胆固醇血症、局部缺血、心肌梗塞、血栓栓塞、血栓症、强直性脊柱炎、自身免疫性血细胞减少症、自身免疫性心肌炎、克罗恩氏病、移植物抗宿主病、肉芽肿性多血管炎、特发性血小板减少性紫癜、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、狼疮、显微镜下多血管炎、多发性硬化症、斑块状银屑病、银屑病、银屑病性关节炎、风湿性关节炎、溃疡性结肠炎(uc)、葡萄膜炎、以及血管炎。30.根据权利要求26或28所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述疾病涉及选自以下的细胞：淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、肾癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞的细胞、卵巢癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状癌细胞、肺癌细胞、睾丸癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、黑色素瘤、头颈癌细胞,以及以不受调节和加快速度生长和分裂而导致癌症的任何细胞；优选选自乳腺癌细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞和头颈癌细胞。

技术总结
本发明涉及用于化学修饰治疗性抗体或蛋白质的化合物(反应性偶联物)。这些化合物能够在一个单一步骤中将有效负载区域选择性地附接至抗体或抗体片段，从而产生修饰抗体或修饰抗体片段，该修饰抗体或修饰抗体片段可以用于诊断、监测、成像或治疗疾病。成像或治疗疾病。成像或治疗疾病。


技术研发人员：奥里金
受保护的技术使用者：德彪药业国际股份公司
技术研发日：2020.12.03
技术公布日：2022/11/1