用于治疗中风和相关疾病的抗纤溶酶肽
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2020年1月9日提交的美国专利申请第62/959,091号的优先权，其以全文引用的方式并入本文中。序列表
2.本技术包括在2021年1月7日创建的名为695323wo的txt文件中的序列，该文件以引用的方式并入本文。
背景技术：3.tat-nr2b9c(也称为na-1)是一种药剂，其抑制psd-95，从而破坏与n-甲基-d-天门冬氨酸受体(nmdar)和神经元一氧化氮合酶(nnos)的结合，并减少由脑缺血诱导的兴奋性毒性。治疗可减少脑损伤和神经退行性疾病模型中的梗死面积和功能缺陷。tat-nr2b9c已经经历了成功的ii期临床试验(参见wo 2010144721和aarts等，science 298,846-850(2002)；hill等，lancet neurol.11:942
–
950(2012))和成功的3期临床试验(hill等，lancet 395:878-887(2020))。
4.除甘氨酸外，所有标准α-氨基酸都可以存在为两种旋光异构体中的任何一种，这两种旋光异构体是彼此的镜像，称为l-和d氨基酸。蛋白质和大多数天然存在的肽完全由l型氨基酸组成。仅在少数天然肽中检测到d氨基酸。这些d氨基酸在l氨基酸发生翻译后改变(posttranslational alteration)时形成。由于自然界中d氨基酸的稀有性，它们通常至少不像l氨基酸那样被l-蛋白识别。简单地将l氨基酸替换为d氨基酸在创建母体分子的模拟物时通常是无效的，因为它改变了相对于靶位点的侧链方向。替换l-或d氨基酸并颠倒氨基酸顺序会导致产生与母体分子相似的侧链拓扑结构，但具有倒置的酰胺肽键，其适应左旋螺旋，而l型肽适应右旋螺旋。因此，靶标结合仍然可能丢失或改变。
技术实现要素：5.本发明提供一种活性剂，包含与抑制肽连接的内化肽，所述抑制肽抑制psd-95与nos和/或nmdar2b的结合，其中所述内化肽具有包含ygrkkrrqrrr(seq id no:1)的氨基酸序列，并且所述抑制肽具有包含klssiesdv(seq id no：2)或其变体的序列，在所述内化肽和抑制肽中总共具有最多五个取代或缺失，其中所述抑制肽的至少四个c末端氨基酸是l氨基酸，且包括所有r和k残基的连续的氨基酸片段是d氨基酸。可选地，其中紧邻最c末端的r或k残基的c末端残基也是d残基。可选地，中所述作为融合肽的内化肽的c末端与所述抑制肽的n末端连接。可选地，所述抑制肽在c末端包含[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:3)。可选地，所述抑制肽在c末端包含i-e-[s/t]-d-v(seq id no:4)。可选地，所述抑制肽在c末端包含iesdv(seq id no：5)。
[0006]
可选地，所述抑制肽的五个c末端氨基酸中的每一个都是l氨基酸。可选地，所述活性剂的每隔一个的残基是d氨基酸。可选地，所述活性剂具有氨基酸序列ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:6)、ygrkkrrqrrrkssiesdv(seq id no:7)、
ygrkkrrqrrrksiesdv(seq id no:8)或ygrkkrrqrrrkiesdv(seq id no:9)。可选地，所述的活性剂具有氨基酸序列ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no：6)，其中小写字母是d氨基酸，大写字母是l氨基酸。
[0007]
可选地，所述活性剂与tat-nr2b9c相比在血浆中具有增强的稳定性。可选地，所述的活性剂与tat-nr2b9c相比具有增强的纤溶酶抗性。可选地，所述的活性剂对psd-95的结合亲和力在tat-nr2b9c的2倍以内。可选地，所述活性剂抑制psd-95与nmdar2b结合的ic
50
在tat-nr2b9c的2倍以内。
[0008]
可选地，所述的活性剂为氯盐。
[0009]
本发明还提供任何所述的活性剂的制剂，还包含组氨酸和海藻糖。
[0010]
本发明还提供任何所述的活性剂的制剂，还包含磷酸盐缓冲剂。
[0011]
本发明还提供一种包含任何所述的活性剂和抗炎剂的复合制剂。可选地，所述抗炎剂是肥大细胞脱颗粒抑制剂或抗组胺。
[0012]
本发明还提供一种包含任何所述的活性剂和溶栓剂的复合制剂。
[0013]
本发明还提供一种治疗患有疾病或处于疾病风险中的对象的方法，所述疾病选自中风、脑缺血、中枢神经系统(cns)外伤、蛛网膜下腔出血、疼痛、焦虑、癫痫，所述方法包括将根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂的有效方案施用至所述对象。
[0014]
本发明还提供一种治疗患有中风或有中风风险的对象的缺血性中风的方法，包括向所述对象施用有效方案的活性剂，其中所述对象共同施用溶栓剂，其中所述活性剂包含与抑制肽连接的内化肽，所述抑制肽抑制psd-95与nos和/或nmdar2b的结合，其中所述抑制肽的至少四个c末端氨基酸是l氨基酸，并且所述活性剂的剩余的氨基酸中的至少一个是d氨基酸，其中所述活性剂和溶栓剂的给药时间足够接近，以通过包含至少一个d氨基酸而减少所述溶栓剂诱导的活性剂的裂解。可选地，作为融合肽的所述内化肽在n末端与所述抑制肽的c末端连接。可选地，所述抑制肽包含[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no：3)作为最后四个残基。可选地，所述抑制肽包含[i]-[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:10)作为最后五个残基，其每一个都是l氨基酸。可选地，所述内化肽是tat肽。可选地，所述tat肽的至少8个残基是d氨基酸。可选地，所述tat肽的每个残基都是d氨基酸。可选地，所述内化肽包含ygrkkrrqrrr(seq id no：1)，其在其n末端连接至作为所述抑制肽的klssiesdv(seq id no：2)或klssiesdv(seq id no：12)，形成融合蛋白。可选地，所述活性剂包含d残基的连续片段，包括k残基和r残基中的每一个。可选地，所述活性剂包括ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no：6)，其中小写字母代表d氨基酸，大写字母代表l氨基酸。可选地，所述溶栓剂在所述活性剂前的60、30或15分钟的窗口内给药。可选地，所述活性剂和溶栓剂同时给药。
[0015]
本发明还提供一种向有需要的对象递送活性剂的方法，包括通过非静脉途径施用根据前述权利要求中的任意一项所定义的活性剂，其中所述活性剂以治疗水平递送至血浆。可选地，所述活性剂经皮下给药。可选地，所述活性剂经肌肉内给药。可选地，所述活性剂经鼻内或肺内给药。可选地，所述剂量大于3mg/kg。可选地，所述剂量大于10mg/kg。可选地，所述剂量大于20mg/kg。可选地，所述剂量小于10mg/kg，并且所述变体在不联合施用肥大细胞脱颗粒抑制剂或抗组胺的情况下施用。可选地，所述剂量大于10mg/kg，并且施用所述变体。可选地，所述对象患有疾病或处于疾病风险中，所述疾病选自中风、脑缺血、中枢神
经系统外伤、疼痛、焦虑、癫痫、蛛网膜下腔出血、阿尔茨海默病或帕金森病。
附图说明
[0016]
图1：na-1(seq id no:58)上的纤溶酶切割位点。
[0017]
图2：当与rt-pa同时给药时，大鼠血浆中的na-1含量显著降低。
[0018]
图3：当与rt-pa同时给药时，人血浆中的na-1含量显著降低。
[0019]
图4：当与rt-pa(5.4mg/kg)同时给药时，na-1cmax和auc显著降低。
[0020]
图5：与na-1相比，d-tat-l-na-1在存在大鼠-pa的情况下在大鼠血浆中表现出优异的稳定性。
[0021]
图6：d-tat-l-na-1在人血浆中输注rt-pa期间对蛋白水解具有抗性。
[0022]
图7：当与tnk同时给药时，人血浆中的na-1含量降低，但d-tat-l-nr2b9c含量保持不变。
[0023]
图8：当与tnk同时给药时，大鼠血浆中的na-1含量降低，但d-tat-l-nr2b9c含量保持不变。
[0024]
图9：d-tat-l-nr2b9c对pbs培养基中的纤溶酶切割具有抗性。
[0025]
图10：结果：d-tat-l-nr2b9c在大鼠脑裂解物中解离预先形成的nr2b:psd95复合物。
[0026]
图11：d-tat-l-nr2b9c和d-tat-l-iesdv(seq id no:6)有效结合靶蛋白psd95-pdz2。
[0027]
图12：结果：na-1和d-tat-l-nr2b9c对psd95-pdz2结构域具有高结合亲和力。
[0028]
图13：皮下na-1实现了与iv na-1相似的血浆暴露。
[0029]
图14：相对于皮下的na-1，皮下的na-3实现了更高的血浆浓度和更大的血浆暴露。
[0030]
图15a(表)图15b(图表)：皮下na-3相对于sq(皮下注射)na-1实现了更大的血浆暴露。
[0031]
图16：d-na-1和na-3的肺滴注相对于肺内na-1实现了更高的血浆浓度和更大的血浆暴露。
[0032]
图17：以8.3mg/kg或2.8mg/kg的剂量皮下给药na-3后缺乏显著的组胺释放。
[0033]
图18：静脉内给药d-tat-l-nr2b9c(7.6mg/kg)和洛度沙胺(0.6mg/kg)的复合制剂后没有显著的组胺释放。
[0034]
图19：在中风发作后1小时静脉内给药d-tat-l-nr2b9c和洛度沙胺减少了经emcao模型的动物的梗死体积和半球肿胀。
[0035]
图20：d-tat-l-nr2b9c和洛度沙胺给药导致中风发作后24小时的改善的神经系统结果。
[0036]
图21：皮下na-3和nerinetide对梗死体积的影响。
[0037]
图22：皮下给药后15分钟的nerinetide和na-3血浆浓度。
[0038]
图23：25mg/kg的皮下na-3导致比nerinetide静脉输注更大的cmax和auc
[0039]
图24：皮下给药后的na-3药代动力学曲线。
具体实施方式
定义
[0040]“药物制剂”或组合物是允许活性剂有效的制剂，并且缺少对将被施用制剂的对象有毒的附加组分。
[0041]
除非上下文另有说明，使用大写的单字母氨基酸代码可以指代d-或l氨基酸。小写单字母代码用于表示d氨基酸。甘氨酸没有d和l形式，因此可以用大写或小写互换地表示。
[0042]
诸如浓度或ph值之类的数值在反映可以测量该值的准确度的容差内给出。除非上下文另有要求，否则小数值会四舍五入到最接近的整数。除非上下文另有要求，数值范围的引用意味着可以使用该范围内的任何整数或子范围。
[0043]
术语“疾病”和“病症”同义使用，以表示对象中的正常结构或功能的任何破坏或中断。
[0044]
指示剂量应理解为包括在典型医院环境中可以测量的剂量的准确性中固有的误差范围。
[0045]
术语“分离的”或“纯化的”是指目标物种(例如肽)已经从样品中存在的污染物中纯化，所述样品为例如从含有目标物种的天然来源获得的样品。如果目标物种被分离或纯化，它是样品中存在的主要大分子(例如多肽)物种(即以摩尔计，它比组合物中的任何其他单个物种都更多)，并且优选地，目标物种包含存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔计)。通常，分离的、纯化的或基本上纯的组合物包含组合物中存在的所有大分子物质的80％至90％以上。最优选地，目标物质被纯化至基本均质(即，通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物物质)，其中组合物基本上由单一大分子物质组成。术语“分离”或“纯化”并不一定排除旨在与分离的物种组合作用的其他组分的存在。例如，内化肽可以被描述为分离的，尽管它与活性肽相连。
[0046]“肽模拟物”是指合成化合物，其具有与由天然氨基酸组成的肽基本相同的结构和/或功能特征。肽模拟物可以包含完全合成的非天然氨基酸类似物，或者可以是部分天然肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。肽模拟物还可以掺入任何量的天然氨基酸保守取代，只要这些取代也不会显著改变模拟物的结构和/或抑制或结合活性。多肽模拟组合物可以包含非天然结构组分的任意组合，其通常来自三个结构基团：a)天然酰胺键(“肽键”)以外的残基连接基团；b)非天然残基，其代替天然存在的氨基酸残基；或c)诱导二级结构模拟(即诱导或稳定二级结构)的残基，所述二级结构例如β转角、γ转角、β折叠、α螺旋构象等。在包含活性肽和内化肽的嵌合肽的肽模拟物中，活性部分或内化部分或两者可以是肽模拟物。
[0047]
术语“特异性结合”是指两个分子(例如配体和受体)之间的结合，其特征在于即使在存在许多其它不同的分子的情况下，一个分子(配体)与另一个特定分子(受体)结合的能力，即在分子的异质混合物中显示一个分子对另一个分子的优先结合。配体与受体的特异性结合也通过在过量未标记配体存在下可检测标记的配体与受体的结合减少来证明(即，结合竞争测定)。
[0048]
兴奋性毒性是神经元和周围细胞因兴奋性神经递质谷氨酸的受体的过度活化而受损和被杀死的病理过程，所述受体例如nmda受体，例如带有nmdar2b亚基的nmda受体。
[0049]
术语“对象”包括人和兽医动物，例如哺乳动物，以及实验室动物模型，例如用于临
床前研究的小鼠或大鼠。
[0050]
tat肽意指包含或由rkkrrqrrr(seq id no:13)组成的肽，其中序列内不超过5个残基被删除、取代或插入，其保留促进连接肽的摄取或促进其它药剂进入细胞的能力。优选地，任何氨基酸变化都是保守取代。优选地，聚集体中的任何取代、缺失或内部插入使肽带有净阳离子电荷，优选类似于上述序列的电荷。这可以通过例如不取代任何r或k残基，或保留相同总数的r和k残基来实现。tat肽的氨基酸可以用生物素或类似分子衍生以减少炎症反应。
[0051]
药剂的共同给药是指药剂的给药时间足够接近，以使可检测量的药剂同时存在于血浆中和/或药剂对同一疾病发作发挥治疗效果或药剂合作或协同治疗同一疾病发作。例如，当两种药剂(抗炎剂与包括tat肽的药剂)在时间上足够近地施用，以使抗炎剂可以抑制由内化肽诱导的抗炎反应时，抗炎剂与包括tat肽的药剂共同作用。
[0052]
统计学显著是指《0.05、优选《0.01和最优选《0.001的p值。
[0053]
疾病的发作是指存在疾病的体征和/或症状的时期，其两侧散布着较长的时期，其中体征和/或症状或不存在或以较小程度存在。
[0054]
术语“nmda受体”或“nmdar”是指已知与nmda相互作用的膜相关蛋白，包括下文所述的各种亚基形式。这样的受体可以是人的或非人的(例如小鼠、大鼠、兔、猴)。
[0055]
将对象称为包括指定特征的引用应被理解为替代地公开由指定特征组成或基本上由指定特征组成的对象。同样，提及由特征组成或由特征组成的对象应理解为替代地公开包括该特征或基本上由该特征组成的对象。同样地，将对象称为基本上由某特征组成，应理解为替代地公开由该特征组成或包括该特征的对象。根据惯例，基本上由
……
组成，用于指代发明的基本和新颖特征。具体描述
[0056]
i.概述
[0057]
本发明提供了先前描述的用于治疗中风的活性剂tat-nr2b9c的变体，其中c末端的四个或五个氨基酸是l氨基酸，且一个或多个剩余的氨基酸是d氨基酸。d氨基酸的加入抑制了药剂的蛋白水解降解，特别是通过纤溶酶；纤溶酶天然存在于血浆中，并由溶栓剂的给药诱导。尽管在分子的部分或全部其余部分中存在d氨基酸，但在c末端保留l氨基酸足以保留tat-nr2b9c的结合和抑制特性。所得的活性剂具有若干优点，包括增加的半衰期，以及对由共同施用或共同配制的溶栓剂诱导的纤溶酶的抗性。所得活性剂具有若干优点，包括增加的半衰期，以及对由共同施用或共同配制的溶栓剂诱导的纤溶酶的抗性。所得药剂也更适合通过静脉输注的替代途径给药，例如皮下、鼻内和肌肉内给药，因为药剂的较长半衰期可以补偿这些途径在血浆中形成治疗浓度所需的较长时间。通过这样的途径给药能允许施用更高剂量而无显著的组胺释放，并且更适合在现场(in the field)而非医疗设施中进行。本发明的活性剂的较长半衰期也使它们更适合在多剂量给药方案中长时间维持治疗浓度。此类方案可用于促进从中风导致的病理和认知缺陷中恢复，并减少初始缺陷。多剂量给药方案也可用于治疗慢性疾病，例如阿尔茨海默病和帕金森病。
[0058]
ii.活性剂
[0059]
本发明的活性剂包括与psd-95特异性结合的肽抑制剂(例如，stathakism,genomics 44(1):71-82(1997))，从而抑制其与包括nmdar2b(例如genbank id 4099612)
和/或nos(例如神经元或nnos swiss-prot p29475)在内的nmda受体2亚基的结合；所述活性剂还包括促进肽抑制剂穿过细胞膜和血脑屏障的内化肽。优选的肽抑制用于人对象中的人形式的psd-95nmdar 2b和nos。然而，抑制也可以从蛋白质的物种变体中显示出来。一些肽抑制剂在其c末端具有包含[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:3)的氨基酸序列。示例性肽包括：esdv(seq id no:14)、esev(seq id no:15)、etdv(seq id no:16)、etav(seq id no:17)、etev(seq id no:18)、dtdv(seq id no:19)和dtev(seq id no:20)作为c末端氨基酸。一些肽在其c末端处的氨基酸序列包含[i]-[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:10)。示例性肽包括：iesdv(seq id no:5)、iesev(seq id no:21)、ietdv(seq id no:22)、ietav(seq id no:23)、ietev(seq id no:24)、idtdv(seq id no:25)和idtev(seq id no:26)作为c末端氨基酸。一些抑制肽在c端具有包含x
1-[t/s]-x2v(seq id no:27)的氨基酸序列，其中[t/s]是替代的氨基酸，x1选自e、q和a或其类似物，x2选自a、q、d、n、n-me-a、n-me-q、n-me-d和n-me-n或其类似物(参见bach,j.med.chem.51,6450-6459(2008)和wo 2010/004003)。可选地，肽在p3位置(c-末端数起的第三个氨基酸，即[t/s]占据的位置)被n-烷基化。所述肽可以用环己烷或芳族取代基进行n-烷基化，并且在所述取代基和所述肽或肽类似物的末端氨基之间进一步包含间隔基团，其中所述间隔基团为烷基，优选选自亚甲基、亚乙基、丙烯和丁烯。芳族取代基可以是萘-2-基部分(moiety)或被一个或两个卤素和/或烷基取代的芳环。一些抑制肽在c末端具有包含ix
1-[t/s]-x2v(seq id no:28)的氨基酸序列。示例性抑制肽具有序列iesdv(seq id no:5)、ietdv(seq id no:22)、klssiesdv(seq id no:2)和klssietdv(seq id no:12)。抑制肽通常具有3-25个氨基酸(没有内化肽)、5-10个氨基酸的肽长度，且尤其是9个氨基酸(也没有内化肽)是优选的。
[0060]
内化肽是众所周知的一类相对短的肽，其允许许多细胞或病毒蛋白穿过膜。它们还可以促进连接肽穿过细胞膜或血脑屏障。内化肽，也称为细胞膜转导肽、蛋白质转导结构域、脑穿梭或细胞穿透肽，可以具有例如5-30个氨基酸。此类肽通常具有来自精氨酸和/或赖氨酸残基的高于正常表现(通常相对于蛋白质)的阳离子电荷，据信这有助于它们通过膜。一些这样的肽具有至少5、6、7或8个精氨酸和/或赖氨酸残基。例子包括触角蛋白(bonfanti,cancer res.57,1442-6(1997))(及其变体)、人类免疫缺陷病毒的tat蛋白、蛋白vp22、1型单纯疱疹病毒的ul49基因的产物、penetratin、synb1和3、transportan、amphipathic、gp41nls、polyarg和几种植物和细菌蛋白毒素，例如蓖麻毒素、相思豆毒蛋白、蒴莲根毒蛋白、白喉毒素、霍乱毒素、炭疽毒素、耐热毒素和铜绿假单胞菌外毒素a(eta)。其他实例描述于以下参考文献(temsamani,drug discovery today,9(23):1012-1019,2004；de coupade,biochem j.,390:407-418,2005；saalik bioconjugate chem.15:1246-1253,2004；zhao,medicinal research reviews24(1):1-12,2004；deshayes,cellular and molecular life sciences 62:1839-49,2005)；gao,acs chem.biol.2011,6,484
–
491,sg3(rlsgmnevlsfrwl(seq id no:29)),stalmansplos one 2013,8(8)e71752,1-11和补充信息；figueiredo等,iubmb life 66,182-194(2014)；copolovici等,acs nano,8,1972-94(2014)；lukanowski,biotech j.8,918-930(2013)；stockwell,chem.biol.drug des.83,507-520(2014)；stanzl等，accounts.chem.res/46,2944-2954(2013)；oller-salvia等，chemical society reviews 45：10.1039/c6cs00076b(2016)；behzad jafari等，(2019)expert opinion on drug delivery,16:6,583-605(2019)(均以
引用方式并入)。还有其它策略使用额外的方法或组合物来增强货物分子(例如psd-95抑制剂)向大脑的递送(dong,theranostics 8(6):1481
–
1493(2018))。
[0061]
优选的内化肽是来自hiv病毒的tat。先前工作中报道的tat肽包含以下或由以下组成：在hiv tat蛋白中发现的标准氨基酸序列ygrkkrrqrrr(seq id no:1)。也可以使用rkkrrqrrr(seq id no:13)和grkkrrqrrr(seq id no:11)。如果存在这种侧接tat基序的附加残基(除了药理学试剂)，残基可以是例如来自tat蛋白的、侧接该片段的天然氨基酸、通常用于连接两个肽结构域的间隔子或接头氨基酸类型(例如gly(ser)4(seq id no:30)、tgekp(seq id no:31)、ggrrgggs(seq id no:32)或lrqrdgerp(seq id no:33)(参见例如tang et al.(1996),j.biol.chem.271,15682-15686；hennecke et al.(1998),protein eng.11,405-410)))，或者可以是不显著降低无侧接残基的变体摄取能力的任何其它氨基酸。优选地，在ygrkkrrqrrr(seq id no：1)的任一侧，除了活性肽之外的侧接的氨基酸的数目不超过十个。然而，优选地，不存在侧接的氨基酸。包含侧接ygrkkrrqrrr(seq id no：1)的c末端或其它抑制肽的附加氨基酸残基的合适的tat肽是ygrkkrrqrrrpq(seq id no：34)。可以使用的其它tat肽包括grkkrrqrrrpq(seq id no:35和grkkrrqrrrp(seq id no:36)。
[0062]
wo2008/109010描述了具有降低的结合n型钙通道的能力的上述tat肽的变体。此类变体可包含氨基酸序列xgrkkrrqrrr(seq id no:37)或由其组成，其中x是除y之外的氨基酸，或可包含氨基酸序列grkkrrqrrr(seq id no:11)或由其组成。优选的tat肽具有被f取代的n末端y残基。因此，优选包含fgrkkrrqrrr(seq id no：38)或由其组成的tat肽。另一种优选的变体tat肽由grkkrrqrrr(seq id no：11)组成。另一种优选的tat肽包含以下或由以下组成：rrrqrrkkrg(seq id no：39)或rrrqrrkkrgy(seq id no：40)。其他促进药物吸收而不抑制n型钙通道的tat衍生肽包括下表1中所示的那些。表1x-fgrkkrrqrrr(f-tat)(seq id no:38)x-gkkkkkqkkk(seq id no:41)x-rkkrrqrrr(seq id no:13)x-gakkrrqrrr(seq id no:42)x-akkrrqrrr(seq id no:43)x-grkarrqrrr(seq id no:44)x-rkarrqrrr(seq id no:45)x-grkkarqrrr(seq id no:46)x-rkkarqrrr(seq id no:47)x-grkkrrqarr(seq id no:48)x-rkkrrqarr(seq id no:49)x-grkkrrqrar(seq id no:50)x-rkkrrqrar(seq id no:51)x-rrprrprrprr(seq id no:52)x-rrarrarrarr(seq id no:53)x-rrrarrrarr(seq id no:54)
x-rrrprrrprr(seq id no:55)x-rrprrprr(seq id no:56)x-rrarrarr(seq id no:57)
[0063]
x可代表游离氨基末端、一个或多个氨基酸或缀合部分。
[0064]
本发明的活性剂通常包括抑制肽和内化肽，其被配置成使得抑制肽具有游离的c-末端和与内化肽的c-末端连接的n-末端。在这样的试剂中，抑制肽的至少四个c末端残基，优选抑制肽的五个c末端残基是l氨基酸，并且抑制肽和内化肽中的剩余残基中的至少一个是d残基。可以选择包含d残基的位置，以使d残基立即出现在任何碱性残基(即精氨酸或赖氨酸)之后(即在c末端侧)。纤溶酶通过切割此类碱性残基的c末端侧的肽键而发挥作用。包含侧接切割位点的d残基，特别是在碱性残基的c末端侧，可减少或消除肽切割。碱性残基的c末端侧的任何或所有残基都可以是d残基。任何碱性残基也可以是d氨基酸。
[0065]
作为一个例子，图1显示了tat-nr2b9c中实际和潜在的纤溶酶切割位点的图谱。有七个实际位点(已检测到切割)和另外两个可能发生纤溶酶切割的潜在位点。一些活性剂在内化肽和抑制肽中都包括至少一种d氨基酸。一些活性剂包括抑制肽，包括在内化肽的每个位置的d氨基酸。一些活性剂在抑制肽的每个位置都包括d氨基酸，除了四个或五个c末端残基，其为l氨基酸。一些活性剂在内化肽的每个位置以及抑制肽的每个位置包括d氨基酸，除了最后四个或五个c末端氨基酸残基，其为l氨基酸。
[0066]
tat-nr2b9c，也称为na-1或nerinetide，具有氨基酸序列ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:58)。本发明优选的活性剂是该序列的变体，其中esdv(seq id no：14)或iesdv(seq id no：5)是l氨基酸，其余氨基酸中的至少一个是d氨基酸。在一些活性剂中，至少从c末端起第八和第九位的l或k残基，或l和k残基，是d残基。在一些活性剂中，从n末端起第6、7、8、10和11位的r、r、q、r、r残基中的至少一个是d残基。在一些活性剂中，所有这些残基都是d残基。在一些活性剂中，残基4-8和10-13中的每一个都是d氨基酸。在一些活性剂中，残基4-13或3-13中的每一个都是d氨基酸。在一些活性剂中，内化肽的十一个残基中的每一个都是d氨基酸。一些示例性活性剂包括ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:6)(也称为na-3)、ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:59)、ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:60)、ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:61)、ygrkkrrqrrrkssiesdv(seq id no:7)、ygrkkrrqrrrksiesdv(seq id no:8)或ygrkkrrqrrrkiesdv(seq id no:9)。其它活性剂包括上述序列的变体，其中从c末端起第三个位置的s被t取代：ygrkkrrqrrrklssietdv(seq id no:62)、ygrkkrrqrrrklssietdv(seq id no:63)、ygrkkrrqrrrklssietdv(seq id no:64)、ygrkkrrqrrrkssietdv(seq id no:65)、ygrkkrrqrrrksietdv(seq id no:66)和ygrkkrrqrrrkietdv(seq id no:67)，活性剂包括ygrkkrrqrrriesdv(seq id no:68)、(d-tat-l-2b5c)和ygrkkrrqrrrietdv(seq id no:69)。
[0067]
本发明还包括包含内化肽的活性剂，该内化肽例如作为融合肽与抑制肽连接，所述抑制肽抑制psd-95与nos和/或nmdar2b的结合，其中内化肽具有氨基酸序列，该氨基酸序列包含ygrkkrrqrrr(seq id no:1)、grkkrrqrrr(seq id no:11)，或rkkrrqrrr(seq id no:13)，并且抑制肽具有序列，该序列包含klssiesdv(seq id no:2)的或其变体，该变体在内化肽和抑制肽中总共有多达1、2、3、4或5个取代或缺失。在这样的活性剂中，抑制肽的至少四个或五个c末端氨基酸是l氨基酸，且包括所有r和k残基的连续氨基酸片段和紧邻最c
末端的r或k残基的c末端残基是d氨基酸。因此，在具有序列ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no：58)的肽中，从第一个r到l残基的连续区段是d氨基酸。
[0068]
允许的取代的一个例子在抑制肽的c末端处由基序[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:3)提供。例如，c末端的第三个氨基酸可以是s或t。优选地，抑制肽的五个c末端氨基酸中的每一个是l氨基酸。可选地，在活性剂ygrkkrrqrrrklssiesdv中，每隔一个氨基酸是d氨基酸，其中小写字母是d氨基酸并且大写字母是l氨基酸。
[0069]
与tat-nr2b9c或其它相同的全l活性剂相比，优选的活性剂在大鼠或人血浆中具有增强的稳定性(例如，通过半衰期体现)。可以如实施例测量稳定性。与tat-nr2b9c或其他相同的全l活性剂相比，优选的活性剂具有增强的纤溶酶抗性。可以如实施例中测量纤溶酶抗性。活性剂优选在tat-nr2b9c(全l)或其它相同的全l肽或在实验误差内具有无法区分的结合的全l肽的1.5倍、2倍、3倍或5倍范围内结合psd-95。优选的活性剂与tat-nr2b9c或肽竞争结合至少10％、25％或50％，所述肽含有nmda受体亚基2序列的最后15-20个氨基酸的肽竞争结合，该肽包含nmda受体亚基2序列的最后15-20个氨基酸，该序列包含用于与psd-95结合的pdz结合域(例如，十倍过量的活性剂会降低tat-nr2b9c结合)。竞争表明活性剂与tat-nr2b9c结合到相同或重叠的结合位点。psd-95的丙氨酸诱变也可以表明拥有相同或重叠的结合位点。如果相同或重叠残基组的诱变降低了活性剂与tat-nr2b9c的结合，则活性剂和tat-nr2b9c与psd-95上的相同或重叠位点结合。
[0070]
本发明的活性剂可以含有修饰的氨基酸残基，例如n-烷基化的残基。n-末端烷基修饰可以包括例如n-甲基、n-乙基、n-丙基、n-丁基、n-环己基甲基、n-环己基乙基、n-苄基、n-苯乙基、n-苯丙基、n-(3,4-二氯苯基)丙基、n-(3,4-二氟苯基)丙基和n-(萘-2-基)乙基)。活性剂还可以包括逆式肽(retro peptides)。逆式肽具有反向氨基酸序列。肽模拟物还包括逆式肽，其中氨基酸的顺序是相反的，因此原来的c末端氨基酸出现在n末端，且d氨基酸用于代替l氨基(例如，酸vdseisslkrrrqrrkkrgy，也称为ri-na-1)。
[0071]
在本技术中描述的灵长类动物和临床试验中进行测试之前，如果需要，可以使用先前描述的中风大鼠模型来确认肽、肽模拟物或其它试剂的适当药理学活性。也可以使用例如us 20050059597中描述的测定来筛选肽或肽模拟物抑制psd-95和nmdar 2b之间相互作用的能力，该专利以引用的方式并入本文。在这种测定中，有用的肽通常具有小于50μm、25μm、10μm、0.1μm或0.01μm的ic50值。优选的肽通常具有0.001-1μm的ic50值，更优选0.001-0.05、0.05-0.5或0.05-0.1μm。当肽或其它试剂被表征为抑制一种相互作用(例如psd-95与nmdar2b的相互作用)的结合时，这种描述不排除该肽或试剂也抑制另一种相互作用，例如抑制psd-95与nnos的结合。
[0072]
诸如刚刚描述的那些肽可以任选地被衍生(例如乙酰化、磷酸化、肉豆蔻酰化、香叶基化、聚乙二醇化和/或糖基化)以提高抑制剂的结合亲和力、提高抑制剂被转运通过细胞膜的能力，或提高稳定性。作为一个具体的例子，对于其中从c末端开始的第三个残基是s或t的抑制剂，该残基可以在使用肽之前被磷酸化。
[0073]
内化肽可以通过常规方法与抑制肽连接。例如，抑制肽可以通过化学键连接到内化肽，例如通过偶联剂或缀合剂。许多这样的试剂是可商购的，且在s.s.wong,chemistry of protein conjugation and cross-linking,crc press(1991)中综述。交联剂的一些例子包括j-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(spdp)或n,n'-(1,3-亚苯基)双马来酰亚
胺；n,n'-亚乙基-双-(碘乙酰胺)或其它具有6至11个碳亚甲基桥(对巯基相对特异)的此类试剂；和1,5-二氟-2,4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基团形成不可逆的键)。其它交联剂包括p,p'-二氟-m,m'-二硝基二苯砜(与氨基和酚基形成不可逆的交联键)；己二酸二甲酯(对氨基有特异性)；苯酚-1,4-二磺酰氯(主要与氨基反应)；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或偶氮苯基-对-二异氰酸酯(主要与氨基反应)；戊二醛(与几种不同的侧链反应)和二重氮联苯胺(主要与酪氨酸和组氨酸反应)。
[0074]
接头，例如聚乙二醇接头，可用于使肽或肽模拟物的活性部分二聚化，以增强其对含有串联pdz结构域的蛋白质的亲和力和选择性。参见例如bach等,(2009)angew.chem.int.ed.48:9685-9689和wo 2010/004003。包含pl基序的肽优选通过连接两个这样的分子的n末端而二聚化，使c末端游离。bach进一步报道了来自nmdar 2b的c末端的五聚体肽iesdv(seq id no:5)在抑制nmdar 2b与psd-95的结合方面是有效的。ietdv(seq id no:22)也可以用来代替iesdv(seq id no:5)。可选地，可以串联连接约2-10个peg拷贝作为接头。可选地，接头也可以连接到内化肽或脂化以增强细胞摄取。示例性二聚体抑制剂的例子如下所示(参见bach等，pnas 109(2012)3317-3322)。可以使用本文公开的任何psd-95抑制剂代替ietdv，并且可以使用任何内化肽或脂化部分代替tat。也可以使用所示的其它接头。
[0075]
内化肽也可以作为融合肽连接到抑制肽，优选地，内化肽的c末端连接到抑制肽的n末端，使抑制肽具有游离的c末端。
[0076]
代替将肽连接到内化肽，或除了将肽连接到内化肽，这样的肽可连接至脂质(脂化)以增加缀合物相对于单独的肽的疏水性，从而促进连接的肽穿过细胞膜和/或穿过脑屏障。脂质化优选在n末端氨基酸上进行，但也可以在内部氨基酸上进行，前提是肽抑制psd-95和nmdar 2b之间相互作用的能力不降低超过50％。优选地，脂化在除了五个最c末端的氨基酸之一之外的氨基酸上进行。脂质是更易溶于醚(相对于水而言)的有机分子，包括脂肪酸、甘油酯和甾醇。合适的脂化形式包括肉豆蔻酰化、棕榈酰化或链长优选为10-20个碳的其他脂肪酸的连接，例如月桂酸和硬脂酸，以及香叶基化、香叶基香叶基化(geranylgeranylation)和异戊二烯化。优选在天然蛋白质的翻译后修饰中发生的脂质化类型。还优选的是通过与肽的n末端氨基酸的α-氨基形成酰胺键，用脂肪酸进行脂化。脂化可以通过包括预脂化氨基酸的肽合成、体外酶促或重组表达、通过肽的化学交联或化学衍生来进行。通过肉豆蔻酰化和其它脂质修饰而修饰的氨基酸是可商购的。使用脂质代替内化肽减少了提供纤溶酶切割位点的k和r残基的数量。一些示例性脂化分子包括klssiesdv(seq id no:2)、klssiesdv(seq id no:70)、lssiesdv(seq id no:71)、lssiesdv(seq id no:72)、ssiesdv(seq id no:73)、siesdv(seq id no:74)、iesdv(seq id no:5)、klssietdv(seq id no:12)、klssietdv(seq id no:75)、lssietdv(seq id no:76)、lssietdv(seq id no:77)、ssietdv(seq id no:78)、sietdv(seq id no:79)、ietdv(seq id no:22)，优选在n末端进行脂化。
[0077]
可选地与内化肽融合的抑制肽可以通过固相合成或重组方法合成。可以使用科学和专利文献中描述的各种程序和方法合成肽模拟物，例如，organic syntheses collective volumes,gilman等，(eds)john wiley&sons,inc.,ny,al-obeidi(1998)mol.biotechnol.9:205-223；hruby(1997)curr.opin.chem.biol.1:114-119；ostergaard
(1997)mol.divers.3:17-27；ostresh(1996)methods enzymol.267:220-234。
[0078]
iii.盐类
[0079]
上述类型的肽通常通过固态合成制备。因为固态合成使用三氟乙酸盐(tfa)去除保护基团或从树脂中去除肽，所以肽最初通常以三氟乙酸盐的形式生产。三氟乙酸盐可以被另一种阴离子取代，通过例如将肽结合到固体支持物(例如柱子)上，洗涤柱子以去除现有的平衡离子，用含有新平衡离子的溶液平衡柱子，然后洗脱肽，例如通过将疏水溶剂(如乙腈)引入柱中。作为常规固态合成中洗脱肽之前的最后一步，可以通过用醋酸盐洗涤来实现用醋酸盐代替三氟醋酸盐。用氯盐代替三氟乙酸盐或乙酸盐可以通过用氯化铵洗涤然后洗脱来完成。优选使用疏水性载体，特别优选制备型反相hplc用于离子交换。三氟乙酸可以直接用氯盐代替，也可以先用醋酸盐代替，再用氯盐代替醋酸盐。
[0080]
抗衡离子，无论是三氟乙酸盐、乙酸盐还是氯盐，结合到tat-nr2b9c及其d变体上的带正电原子，特别是n-末端氨基和氨基侧链的精氨酸和赖氨酸残基。尽管本发明的实践不依赖于理解tat-nr2b9c及其d变体的盐中的肽与阴离子的精确化学计量，但据信每个盐分子存在多达约9个抗衡离子分子。
[0081]
尽管一种抗衡离子被另一种置换有效地发生，但最终抗衡离子的纯度可能小于100％。因此，对本文所述的tat-nr2b9c或其d变体的氯盐的提及意指在盐的制备中，按重量(或摩尔数)计算，氯化物是盐中的聚集体中存在的所有阴离子的主要阴离子。换言之，氯化物占盐中存在的所有阴离子的重量或摩尔数的大于50％，优选大于75％、95％、99％、99.5％或99.9％。在这种由盐制备的盐或制剂中，乙酸盐和三氟乙酸盐组合及单独构成盐或制剂中阴离子的按重量或摩尔数计的小于50％、25％、5％、0.5％或0.1％。
[0082]
iv.制剂
[0083]
可以将活性剂掺入液体制剂或冻干制剂中。液体制剂可以包括缓冲剂、盐和水。优选的缓冲剂是磷酸钠。优选的盐是氯化钠。ph可以是例如ph7.0或大约生理ph。
[0084]
冻干制剂可以由包含活性剂、缓冲剂、填充剂和水的预干燥制剂制备。可以存在或不存在其它组分，例如冷冻(cryo)或冻干防腐剂(lyopreservatives)、张度剂、药学上可接受的载体等。优选的活性剂是ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no：6)的氯盐。优选的缓冲剂是组氨酸。优选的填充剂是海藻糖。海藻糖还可用作冷冻和冻干防腐剂。示例性的预干燥制剂包含活性剂、组氨酸(10-100mm、15-100mm、15-80mm、40-60mm或15-60mm，例如20mm或可选地50mm，或20-50mm))和海藻糖(50-200mm，优选80-160mm，100-140mm，更优选120mm)。ph为5.5至7.5，更优选6-7，更优选6.5。活性剂的浓度为20-200mg/ml，优选50-150mg/ml，更优选70-120mg/ml或90mg/ml。因此，示例性的预干燥制剂是20mm组氨酸、120mm海藻糖和90mg/ml活性剂的氯盐。可选地，可以包括乙酰化清除剂(例如赖氨酸，如us 10,206,878中所述)，以进一步减少制剂中任何残留的乙酸盐或三氟乙酸盐。
[0085]
冻干后，冻干制剂具有低水含量，优选约0％-5％的水，更优选以重量计低于2.5％的水。冻干制剂可以储存在冰柜(例如，-20℃或-70℃)、冰箱(0-40℃)或室温(20℃-25℃)中。
[0086]
活性剂可以在水溶液中重构，优选注射用水或可选的生理盐水(0.8-1.0％盐水，优选0.9％盐水)。重构可以是与预干燥制剂相同或更小或更大的体积。优选地，重构后的体积比以前大(例如大3-6倍)。例如，3-5ml的预干燥体积可以重构为10ml、12ml、13.5ml、15ml
或20ml或10-20ml等体积。重构后，组氨酸的浓度优选为2-20mm，例如2-7mm、4.0-6.5mm、4.5mm或6mm；海藻糖的浓度优选为15-45mm或20-40mm或25-27mm或35-37mm。赖氨酸的浓度优选为100-300mm，例如150-250mm、150-170mm或210-220mm。活性剂的浓度优选为10-30mg/ml，例如15-30mg/ml、18-20mg/ml、20mg/ml的活性剂或25-30mg/ml、26-28mg/ml或27mg/ml的活性剂。重构后的示例性制剂具有4-5mm的组氨酸、26-27mm的海藻糖、150-170mm的赖氨酸和20mg/ml的活性剂(浓度四舍五入到最接近的整数)。重构后的第二个示例性制剂具有5-7mm的组氨酸、35-37mm的海藻糖、210-220mm的赖氨酸和26-28mg/ml的活性剂(浓度四舍五入到最接近的整数)。重构的制剂可以在给药前进一步稀释，例如通过添加到含有生理盐水的流体袋中稀释。
[0087]
iv.疾病
[0088]
活性剂可用于治疗多种疾病，特别是神经疾病，尤其是部分由兴奋性毒性介导的疾病。此类疾病和病症包括中风、癫痫、缺氧、蛛网膜下腔出血、与中风无关的cns外伤如外伤性脑损伤和脊髓损伤、其它脑缺血、阿尔茨海默病和帕金森病。此类病症还可以包括眼睛或耳朵的病症或疾病，包括视网膜病、与其它眼部病症相关的视网膜缺血，或耳鸣。本发明的活性剂可治疗的已知不与兴奋性毒性相关的其它神经疾病包括焦虑和疼痛(神经性或炎症性的)。
[0089]
中风是不论原因而由cns中的血流受损导致的病症。潜在原因包括栓塞、出血和血栓形成。由于血流受损，一些神经元细胞会立即死亡。这些细胞释放其成分分子，包括谷氨酸，进而激活nmda受体，提高细胞内钙水平和细胞内酶水平，导致神经元细胞进一步死亡(兴奋性毒性级联反应)。中枢神经系统组织的死亡称为梗死。梗死体积(即脑中风导致的死亡神经元细胞的体积)可用作中风导致的病理损伤程度的指标。症状的影响取决于梗死的体积和它在大脑中的位置。残疾指数可用作症状性损伤的量度，例如rankin中风结果量表(rankin,scott med j；2:200-15(1957))和barthel指数。rankin量表基于以下而直接评估患者的整体状况。
[0090]
0：完全没有症状1：尽管有症状，但没有明显的残疾；能够执行所有日常职责和活动。2：轻度残疾；不能进行以前的所有活动，但可以在没有帮助的情况下照顾自己。3：中度残疾；需要一些帮助，但能够在没有帮助的情况下行走。4：中度至重度残疾；在没有帮助的情况下无法行走，在没有帮助的情况下无法满足自己的身体需求。5：重度残疾；卧床不起，大小便失禁，需要不断的护理和关注。
[0091]
barthel指数基于一系列问题，这些问题关乎患者进行10项日常生活基本活动的能力，导致得分在0和100之间，得分越低表明残疾越严重(mahoney等，maryland state medical journal 14:56-61(1965))。
[0092]
或者，中风严重程度/结果可以使用nih中风量表来测量，该量表可在万维网ninds.nih.gov/doctors/nih stroke scalejbooklet.pdf获得。
[0093]
该量表基于患者执行11组功能的能力，这些功能包括对患者的意识水平、运动、感觉和语言功能的评估。
[0094]
缺血性中风更具体地指由流向大脑的血流阻塞引起的中风类型。这种阻塞的潜在
条件最常见的是血管壁内脂肪沉积物的发展。这种情况称为动脉粥样硬化。这些脂肪沉积物会导致两种类型的阻塞。脑血栓形成是指在血管阻塞部分形成的血栓(血凝块)。“脑栓塞”通常是指在循环系统的另一个位置(通常是心脏及上胸部和脖子的大动脉)形成的血凝块。一部分血凝块破裂，进入血液并通过大脑的血管到达太小而无法通过的血管。栓塞的第二个重要原因是心律不齐，称为动脉纤颤。它创造了凝块可以在心脏中形成、脱落并进入大脑的条件。缺血性中风的其他潜在原因是出血、血栓形成、动脉或静脉夹层、心脏骤停、包括出血在内的任何原因引起的休克，以及医源性原因，例如直接手术损伤脑血管或通向大脑的血管或心脏手术。缺血性中风约占所有中风病例的83％。
[0095]
短暂性脑缺血发作(tia)是轻微的或警告性的中风。在tia中，存在表明缺血性中风的情况，并出现典型的中风警告信号。然而，阻塞(血凝块)发生的时间很短，往往会通过正常机制自行消退。接受心脏手术的患者特别容易发生短暂性脑缺血发作。
[0096]
出血性中风占中风病例的约17％。它是由脆弱的血管的破裂并流血到周围的大脑造成的。血液积聚并压缩周围的脑组织。出血性中风的两种一般类型是脑内出血和蛛网膜下腔出血。出血性中风是由减弱的血管的破裂引起的。血管衰弱破裂的潜在原因包括高血压出血，其中高血压导致血管破裂，或血管衰弱的另一个潜在原因为如脑血管破裂畸形，包括脑动脉瘤、动静脉畸形(avm)或海绵状血管瘤。出血性中风也可能由缺血性中风的出血性转化引起，其会削弱梗死中的血管，或由包含异常弱血管的cns中的原发性或转移性肿瘤的出血引起。出血性中风也可能由医源性原因引起，例如对脑血管的直接手术损伤。动脉瘤是血管薄弱区域的膨胀。如果不及时治疗，动脉瘤会继续变弱，直到它破裂并流血到大脑中。动静脉畸形(avm)是一组异常形成的血管。海绵状血管瘤是一种静脉异常，可导致静脉结构变弱而出血。这些血管中的任何一个都可能破裂，也会导致大脑出血。出血性中风也可能由身体创伤引起。由于出血性中风中的失血导致的血不足，大脑某一部分的出血性中风可导致另一部分的缺血性中风。
[0097]
一种适合治疗的患者类别是接受外科手术的患者，该外科手术涉及或可能涉及供应脑部的血管，或脑部或cns上的血管。一些例子是接受心肺分流术、颈动脉支架置入术、大脑或主动脉弓冠状动脉的诊断性血管造影术、血管外科手术和神经外科手术的患者。此类患者的其他示例在上文第iv节中进行了讨论。患有脑动脉瘤的患者尤其适合。此类患者可以通过多种外科手术进行治疗，包括夹闭动脉瘤以切断血液，或进行血管内手术以用小线圈阻塞动脉瘤或将支架引入动脉瘤出现的血管中，或插入微导管。血管内手术比夹闭动脉瘤的侵入性更小，并且与更好的患者结果相关，但结果仍然包括小梗死的高发生率。此类患者可以用psd95与nmdar 2b相互作用的抑制剂，特别是上述药剂进行治疗。相对于进行手术的给药时间可以如上文针对临床试验所述。
[0098]
可以接受治疗的另一类患者是伴随或不伴随动脉瘤的蛛网膜下腔出血的患者(参见us 61/570,264)。另一类患者是缺血性中风患者，他们适合进行血管内血栓切除术以去除凝块，例如escape-na1试验(nct02930018)。可以在手术之前或之后施用药物以去除凝块，并且预期可以改善中风本身和与上述程序相关的任何潜在医源性中风的结果。另一个例子是那些在未使用影像学标准的情况下被诊断为潜在中风并在中风后数小时内接受治疗的人，优选在中风发作后的前3小时内，但可选在中风发作后的前6、9或12小时内接受治疗(类似于nct02315443)。
[0099]
iv.药品给药的有效方案
[0100]
活性剂的给药量、频率和给药途径能有效治愈、减少或抑制患有被治疗疾病的患者的疾病的至少一种体征或症状的进一步恶化。治疗有效量(给药前)或给药后的治疗有效血浆浓度是指在患有用本发明的药剂治疗的疾病的患者群体(或动物模型)中相对于未用该药剂治疗的患有该疾病或病症的对照患者群体(或动物模型)中的损害，足以显著治愈、减少或抑制待治疗的疾病或病症的至少一种体征或症状进一步恶化的活性剂的量或水平。如果单独接受治疗的患者获得比对照群体(未通过本发明方法治疗的可比患者)的平均结果更有利的结果，则该量或水平也被认为是治疗有效的。治疗有效方案涉及以实现预期目的所需的给药频率和途径，以治疗有效剂量给药。
[0101]
对于患有中风或其他缺血性病症的患者，活性剂以包括有效减少中风或其他缺血性病症的破坏作用的量、频率和给药途径的方案给药。当需要治疗的病症是中风时，结果可以通过梗死体积或残疾指数来确定，如果个体接受治疗的患者在rankin量表上显示出2或更少的残疾和在barthel量表上显示75或更多的残疾，或者如果接受治疗的患者群体在残疾量表上的评分分布相比可比较的未治疗人群而言显著得到改善(即残疾程度较低)，则认为剂量是治疗有效的；请参见lees等，l,n engl j med 2006；354:588-600。单剂量的药物足以治疗中风。
[0102]
本发明还提供一种治疗患有疾病或有疾病风险的对象中预防该疾病的方法和制剂。通常这样的对象相对于对照群体具有增加的发生病症(例如病症、疾病、障碍或疾病)的可能性。例如，对照人群可以包括从普通人群中随机选择的一个或多个个体(例如，通过年龄、性别、种族和/或民族匹配)，这些个体尚未被诊断或具有该病症的家族史。如果发现与该疾病相关的“风险因素”与该对象相关，则可以认为该对象处于该疾病的风险中。风险因素可以包括与给定病症相关的任何活动、特征、事件或性质，例如，通过对对象群体的统计或流行病学研究。因此，即使确定潜在风险因素的研究并未具体包括对象，对象也可以被归类为处于疾病风险中。例如，接受心脏手术的对象有短暂性脑缺血发作的风险，因为与未接受过心脏手术的对象群体相比，经历过心脏手术的对象群体中短暂性脑缺血发作的频率增加。
[0103]
中风的其它常见风险因素包括年龄、家族史、性别、中风的先前发病率、短暂性脑缺血发作或心脏病发作、高血压、吸烟、糖尿病、颈动脉或其他动脉疾病、心房颤动、其它心脏病，例如心脏病、心力衰竭、扩张型心肌病、心脏瓣膜病和/或先天性心脏缺陷；高血胆固醇，以及高饱和脂肪、反式脂肪或胆固醇的饮食。
[0104]
在预防中，以足以预防、延迟或抑制疾病的至少一种体征或症状的发展的量、频率和途径向处于疾病风险但尚未患有疾病的患者施用活性剂。给药前的预防有效量或给药后的治疗有效血浆浓度是指在具有有用本发明的药剂治疗的疾病的风险的患者群体(或动物模型)中，相对于未用本药剂治疗的具有该疾病风险的对照患者群体(或动物模型)，足以显著预防、抑制或延迟该疾病的至少一种体征或症状的药剂的量或水平。如果单独治疗的患者获得的结果比对照群体(未通过本发明的方法治疗的可比患者)的平均结果更有利，则该量或水平也被认为是预防有效的。预防有效方案涉及以实现预期目的所需的给药频率和给药途径，以预防有效剂量给药。对于为即将发生中风的患者(例如正在接受心脏手术的患者)预防中风，单剂量的药物通常就足够了。
[0105]
根据药剂，给药可以是肠胃外的、静脉内的、肺内的、鼻内的、口服的、皮下的、动脉内的、颅内的、鞘内的、腹膜内的、外用的、鼻内的或肌肉内的。
[0106]
tat-nr2b9c之前已经通过单剂量静脉内输注以2.6mg/kg给予人类。当通过诸如皮下、鼻内或肌肉内等非静脉内途径给药时，本发明的活性剂可以实现比tat-nr2b9c更大的cmax和auc，因为它们更长的半衰期补偿了活性剂到达血浆所需的额外时间。通过这种非静脉内途径给药还允许给药更高的剂量，而不会由于肥大细胞脱颗粒而释放大量组胺。例如，可以使用高达约10mg/kg的剂量而不会释放显著的组胺，甚至高达25mg/kg的剂量会释放可检测到的组胺，但比静脉内施用相同剂量的剂量要少得多。
[0107]
因此，根据给药途径以及是否共同给药抗炎药以减少组胺释放或其下游效应，可以以一定范围的剂量给药。对于静脉内给药，要求保护的药剂可以以与tat-nr2b9c相似的剂量给药(不伴随抗炎药)，例如高达3mg/kg、0.1-3mg/kg、2-3mg/kg或2.6mg/kg，或以更高的剂量给药(伴随抗炎药)，例如至少5、10、15、20或25mg/kg。对于皮下、鼻内、肺内或肌肉内等途径，剂量(不伴随抗炎药)可高达10、15或20mg/kg，或在伴随抗炎药的情况下超过10、15、20、25或50mg/kg。可替代地通过在较长时间段内施用活性剂来减少或消除对较高剂量的消炎药的需要(例如，在少于1分钟、1-10分钟和大于10分钟的给药构成了替代方案，其中对于恒定剂量的组胺释放和对抗炎药的需求随着时间的增加而减少或消除)。
[0108]
活性剂可以单剂量或多剂量方案给药。单剂量方案可用于治疗急性病症，例如急性缺血性中风，以减少梗死和认知缺陷。如果病症的时间是可预测的，例如对于正在接受神经血管手术的对象，可以在病症发作之前施用这样的剂量；或者在病症发展后的窗口内(例如，长达1、3、6或12小时)可以施用这样的剂量。
[0109]
可以设计多剂量方案以在延长的时间段内将血浆中的活性剂维持在可检测的水平，所述延长的时间段位例如至少1、3、5或10天，或至少一个月，三个月、六个月或无限期。例如，可以每小时、每天2、3、4、6或12次、每天、每隔一天、每周等施用活性剂。就单剂量给药而言，这样的方案可以减少急性病症的初始缺陷，然后促进从仍在发展的这种缺陷中的恢复。这种方案也可用于治疗慢性病，例如阿尔茨海默病和帕金森病。有时将活性剂掺入控释制剂中以用于多剂量方案。
[0110]
活性剂可以与保护化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，例如受控制剂或包衣。此类载体(也称为改良、延迟、延长或缓释或胃滞留剂型，例如depomed gr
tm
系统，其中药剂被聚合物包裹，在胃中膨胀并保留约8小时，足够每天许多药物的剂量)。控释系统包括微囊化递送系统、植入物和可生物降解的生物相容性聚合物例如胶原蛋白、乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸、基质控释装置、渗透控释装置、多颗粒控释装置、离子交换树脂、肠溶包衣、多层包衣、微球、纳米颗粒、脂质体及其组合。活性剂的释放速率也可以通过改变活性剂的粒度来改变：改变释放的例子包括，例如，美国专利no.3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；5,639,480；5,733,566；5,739,108；5,891,474；5,922,356；5,972,891；5,980,945；5,993,855；6,045,830；6,087,324；6,113,943；6,197,350；6,248,363；6,264,970；6,267,981；6,376,461；6,419,961；6,589,548；6,613,358；和6,699,500中所描述的。
[0111]
v.与抗炎药共同给药
[0112]
根据给药的剂量和途径，本发明的活性剂可以诱导以肥大细胞脱颗粒和组胺释放及其后遗症为特征的炎症反应。例如，对于静脉给药，至少3mg/kg的剂量与组胺释放相关，而对于其他途径，至少10mg/kg的剂量与组胺释放相关。
[0113]
多种抗炎剂可容易地用于抑制炎症反应的一个或多个方面。一类优选的抗炎剂是肥大细胞脱颗粒抑制剂。此类化合物包括色甘酸5,5'-((2-羟基丙-1,3-二基)双(氧基)双(4-氧代-4h-苯并吡喃2-羧酸)(也称为色甘酸)和2-羧基色酮-5'-基-2-羟基丙烷(2-carboxylatochromon-5'-yl-2-hydroxypropane)衍生物，例如双(乙酰氧基甲基)、色甘酸二钠、奈多罗米(9-乙基-4,6-二氧代-10-丙基-6,9-二氢-4h-吡喃[3,2-g]喹啉-2,8-二羧酸)和曲尼司特(2-{[(2e)-3-(3,4-二甲氧基苯基)丙-2-烯酰基]氨基})和洛度沙(2[2-氯-5-氰基-3-(草酰氨基)苯胺]-2-氧代乙酸)。对具体化合物的提及包括该化合物的药学上可接受的盐。色甘酸很容易以鼻、口服、吸入或静脉内给药的制剂形式获得。尽管本发明的实施不依赖于对机制的理解，但据信这些药剂在由内化肽诱导的炎症反应的早期阶段起作用，因此在抑制其后遗症的发展(包括血压的短暂降低)方面最有效。下面讨论的其他类型的抗炎剂用于抑制由肥大细胞脱颗粒引起的一种或多种下游事件，例如抑制组胺与h1或h2受体结合，但可能不会抑制肥大细胞脱颗粒的所有后遗症，或可能需要更高的剂量或组合使用才能这样做。下表2总结了可用于本发明的几种肥大细胞脱颗粒抑制剂的名称、化学配方和fda状态。表2
[0114]
另一类抗炎剂是抗组胺化合物。此类药剂抑制组胺与其受体的相互作用，从而抑制上述炎症的后遗症。许多抗组胺药是市售的，有些是非处方药。抗组胺药的例子是氮杂他定、氮卓斯汀、burfroline、西替利嗪、赛庚啶、多沙曲唑、依托屈嗪、毛喉素、羟嗪、酮替芬、奥沙胺、哌唑替芬、普罗克罗米、n,n'-取代哌嗪或特非那定。抗组胺药在阻断cns和外周受体中的抗组胺的能力上有所不同，第二代和第三代抗组胺药对外周受体具有选择性。阿克伐斯汀、阿司咪唑、西替利嗪、氯雷他定、咪唑斯汀、左西替利嗪、地氯雷他定和非索非那定是第二代和第三代抗组胺药的例子。抗组胺药广泛存在于口服和外用制剂中。一些其他可以使用的抗组胺药总结在下表3中。表3
[0115]
另一类可用于抑制炎症反应的抗炎剂是皮质类固醇。这些化合物是转录调节剂，并且是由肥大细胞脱颗粒引起的组胺和其他化合物的释放引起的炎症症状的强大抑制剂。皮质类固醇的例子是可的松、氢化可的松(cortef)、泼尼松(deltasone、meticorten、
orasone)、泼尼松龙(delta-cortef、pediapred、prelone)、曲安西龙(aristocort、kenacort)、甲基泼尼松龙(medrol)、地塞米松(decadron、dexone、hexadrol)和倍他米松(celestone)。皮质类固醇广泛用于口服、静脉内和外用制剂。
[0116]
也可以使用非甾体抗炎药(nsaid)。此类药物包括阿司匹林化合物(乙酰水杨酸盐)、非阿司匹林水杨酸盐、双氯芬酸、双氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、消炎痛、酮洛芬、甲氯芬酸、萘普生、萘普生钠、保泰松、舒林酸和托美丁。然而，此类药物的抗炎作用不如抗组胺药或皮质类固醇有效。也可以使用更强的抗炎药，例如硫唑嘌呤、环磷酰胺、留可然(leukeran)和环孢菌素，但不优选，因为它们作用较慢和/或与副作用相关。也可以使用生物抗炎剂，例如或但出于同样的原因，不推荐使用。
[0117]
不同类别的药物可以组合使用以抑制炎症反应。优选的组合是肥大细胞脱颗粒抑制剂和抗组胺剂。
[0118]
在与内化肽连接的药理学试剂与抗炎剂一起施用的方法中，两种实体在时间上足够近地施用，使得抗炎剂可以抑制由内化肽诱导的炎症反应。抗炎剂可以在药剂之前、同时或之后给药。优选的时间部分取决于抗炎剂的药代动力学和药效学。抗炎剂可以在药剂之前的一定时间间隔施用，使得在施用药剂时抗炎剂接近最大血清浓度。通常，抗炎剂在药剂之前6小时和之后1小时之间施用。例如，抗炎剂可以在药剂之前1小时和之后30分钟之间施用。优选地，抗炎剂在药剂之前30分钟和之后15分钟之间施用，更优选地在药剂之前15分钟内和与药剂同时施用。在一些方法中，在给药前15、10或5分钟的时间段内，在给药之前先给药抗炎剂。在一些方法中，药剂在药剂前1-15、1-10或1-5分钟施用。
[0119]
当药剂的施用不是即时的时(例如静脉输注)，如果抗炎剂和药剂的施用期是共同延伸的或重叠的，则认为它们是同时施用的。给药前的给药时间从给药开始算起。给药后的时间段从给药结束开始。涉及抗炎剂给药的时间段是指其给药的开始。
[0120]
当抗炎剂被认为能够抑制与内化肽连接的药物的炎症反应时，其意思是这两种药物的给药时间足够接近，使得如果这种反应发生在特定患者中，抗炎剂将抑制由与内化肽连接的药物诱导的炎症反应，并且不一定暗示这种反应发生在该患者中。在受控的对照临床或非临床试验中，一些患者接受一定剂量的药物治疗，该药物与内化肽连接，而该内化肽与统计学显著数量的患者的炎症反应相关。可以合理地假设，尽管不一定全部这样，患者中的很大一部分都对与内化肽连接的药物产生抗炎反应。在一些患者中，检测到或可检测到对与内化肽连接的药剂的炎症反应的体征或症状。
[0121]
在个体患者的临床治疗中，通常不可能比较在存在和不存在抗炎剂的情况下的来自与内化肽连接的药剂的炎症反应。然而，如果在受控临床或临床前试验中在相同或相似的共同给药条件下观察到显著抑制，则可以合理地得出抗炎剂抑制肽诱导的抗炎反应的结论。患者中的结果(例如血压、心率、荨麻疹)也可以与临床试验中对照组的典型结果进行比较，作为个体患者是否发生抑制的指标。通常，抗炎剂在给药后一小时内的某个时间点以可检测的血清浓度存在。许多抗炎剂的药代动力学是众所周知的，并且可以相应地调整抗炎剂的相对给药时间。抗炎剂通常在外周给药，即通过血脑屏障与大脑隔离。例如，取决于所讨论的药剂，抗炎剂可以口服、经鼻、静脉内或外用给药。如果抗炎剂与药物同时给药，则两者可以作为组合制剂或单独给药。
[0122]
在一些方法中，抗炎剂是一种在口服或静脉内给药时不穿过血脑屏障的抗炎剂，其量至少足以在脑中发挥可检测的药理学活性。这样的药剂可以抑制因在外周施用活性剂而导致的肥大细胞脱颗粒及其后遗症，而其本身不会在脑中发挥任何可检测的治疗效果。在一些方法中，抗炎剂在没有任何联合治疗的情况下施用以增加血脑屏障的渗透性或衍生或配制抗炎剂以增加其穿过血脑屏障的能力。然而，在其他方法中，抗炎剂根据其性质、衍生化、制剂或给药途径，可通过进入脑或以其他方式影响脑中的炎症，发挥两种效应：抑制由于内化肽而导致的肥大细胞脱颗粒和/或其在外围的后遗症及抑制大脑炎症。strbian等，wo 04/071531报道了一种肥大细胞脱颗粒抑制剂，色甘酸盐，通过i.c.v.而非静脉内给药，在动物模型中具有抑制梗塞的直接活性。但在动物模型中没有静脉内直接抑制梗塞的活性。
[0123]
在一些方法中，在与活性剂共同给药之前和/或之后的一天、一周或一个月内，患者也不使用与活性剂共同给药的相同抗炎剂进行治疗。在一些方法中，如果患者正在其他情况下以重复的用药方案，使用与活性剂共同施用的相同抗炎剂进行治疗(例如，相同的量、递送途径、给药频率、给药日的时机)，抗炎剂与活性剂的共同给药在量、递送途径、给药频率或给药日的时机的任何或所有方面不符合重复的用药方案。在一些方法中，不知道患者患有需要与本方法中的活性剂共同施用的抗炎剂的炎性疾病或病症。在一些方法中，患者未患有可用肥大细胞脱颗粒抑制剂治疗的哮喘或过敏性疾病。在一些方法中，每次疾病发作时，在如上定义的窗口内，抗炎剂和活性剂各自施用一次且仅施用一次。一次发作是一个相对较短的时期，其中出现疾病症状，其侧接症状不存在或减轻的较长时期。
[0124]
在不存在抗炎剂的情况下已知发生这种炎症反应的条件下，以有效抑制对内化肽的炎症反应的量、频率和途径的方案施用抗炎剂。如果抗炎剂导致炎症体征或症状有任何减轻，则该炎症反应被抑制。炎症反应的症状可能包括发红、皮疹(如荨麻疹)、发热、肿胀、疼痛、刺痛感、瘙痒、恶心、皮疹、口干、麻木、气道阻塞。炎症反应也可以通过测量血压或心率等体征来监测。或者，可以通过测量由肥大细胞脱颗粒释放的抗组胺或其他化合物的血浆浓度来评估炎症反应。肥大细胞脱颗粒释放的组胺或其他化合物的水平升高、血压降低、荨麻疹等皮疹，或心率降低是肥大细胞脱颗粒的指标。实际上，以上讨论的大多数抗炎剂的剂量、方案和给药途径可在医师案头参考(physicians'desk reference)和/或制造商处获得，并且此类抗炎剂可与一般指导一致地用于本方法。
[0125]
vi.与溶栓剂合用
[0126]
引起局部缺血的斑块和血凝块(也称为栓子)可以通过药理学和物理手段溶解、去除或绕过。溶解、去除斑块和血凝块以及随之而来的血流恢复被称为再灌注。一类药剂通过溶栓而作用。溶栓剂通过促进纤溶酶的产生起作用。纤溶酶清除交联的纤维蛋白网(血凝块的骨架)，使血凝块可溶，并受到其他酶的进一步蛋白水解，并恢复闭塞血管中的血流。溶栓剂的实例包括组织纤溶酶原激活剂t-pa、阿替普酶(activase)、瑞替普酶(retavase)、替奈普酶(tnkase)、阿尼替普酶(eminase)、链激酶(kabikinase、streptase)和尿激酶(abbokinase)。
[0127]
可用于再灌注的另一类药物是血管扩张剂。这些药物通过放松和打开血管起作用，从而使血液在阻塞周围流动。血管扩张剂类型的一些例子：α-肾上腺素受体拮抗剂(α受体阻滞剂)、血管紧张素受体阻滞剂(arb)、β2-肾上腺素受体激动剂(β2-激动剂)、钙通道阻
滞剂(ccb)、中枢作用的交感神经药、直接作用的血管扩张剂、内皮素受体拮抗剂、神经节阻滞剂、硝基扩张剂、磷酸二酯酶抑制剂、钾通道开放剂和肾素抑制剂。
[0128]
另一类可用于再灌注的药物是高血压药物(即提高血压的药物)，例如肾上腺素、去氧肾上腺素、伪麻黄碱、去甲肾上腺素；去甲麻黄碱；特布他林；沙丁胺醇；和甲基麻黄碱。增加的灌注压可以增加阻塞周围的血流。
[0129]
再灌注的机械方法包括血管成形术、导管插入术和动脉旁路移植手术、支架植入术、栓子切除术或动脉内膜切除术。这种程序通过机械去除斑块来恢复斑块流动，使血管保持开放，因此血液可以在斑块周围流动或绕过斑块。
[0130]
再灌注的其他机械方法包括使用将血流从身体的其他区域转移到大脑的装置。一个例子是部分阻塞主动脉的导管，例如coaxianeuroflo
tm
导管装置，该装置最近接受了一项随机试验，并可能获得fda批准用于中风治疗。该装置已用于缺血发作后14小时内出现中风的对象。
[0131]
包括d氨基酸的本发明的活性剂可以与任何形式的再灌注疗法一起施用于适合治疗的对象。然而，本发明的活性剂特别有利于与溶栓剂一起给药，因为在活性剂中包含一种或多种d氨基酸降低了活性剂对由溶栓剂诱导的纤溶酶裂解的敏感性。因此，包括一种或多种d氨基酸的活性剂可以与溶栓剂在其中的方案中共同施用，否则会导致由溶栓剂诱导的活性剂的裂解。例如，溶栓剂可以在活性剂之前60、30或15分钟的窗口内施用。在一些方法中，活性剂与溶栓剂同时给药。活性剂和溶栓剂可以共同配方或分开给药。在一些方法中，溶栓剂在活性剂之前给药，并且当活性剂给药时以可检测的水平在血清中持续存在。
[0132]
对于不能提前预测的局部缺血的治疗，可以在局部缺血发作后尽快或切实可行地施用活性剂。例如，活性剂可以在局部缺血发作后0.5、1、2、3、4、5、6、9、12或24小时内施用。对于可以提前预测的局部缺血，可以在局部缺血发作之前、同时或之后施用活性剂。例如，对于由手术引起的局部缺血，pds-95抑制剂有时从手术开始前30分钟开始到手术后1、2、3、4、5、6、9、12或24小时结束的期间内常规地给药，而不考虑缺血是否已经或将要发展。因为活性剂没有严重的副作用，所以可以在没有根据本领域公认的标准做出诊断的情况下在怀疑中风或其他缺血性病症时施用它们。例如，可以在中风发生的位置(例如在患者家中)或在将对象运送到医院的救护车中施用活性剂。活性剂也可以安全地施用于在发病前有中风或其他缺血性病症风险的对象，该对象可能或可能不会实际发展该病症。
[0133]
在施用活性剂之后或有时在施用活性剂之前，可以对呈现局部缺血的体征和/或症状的对象进行进一步的诊断评估，以确定对象是否具有局部缺血或以其他方式影响cns，并确定对象是否患有或易患出血。尤其是在出现中风症状的对象中进行测试，以试图区分中风是出血还是局部缺血的结果，出血约占中风的17％。诊断测试可以包括对一个或多个器官的扫描，例如cat扫描、mri或pet成像扫描，或对表明已发生中风的生物标志物的血液测试。已知与中风相关的几种生物标志物包括b型神经营养生长因子、血管性血友病因子、基质金属蛋白酶-9，和单核细胞趋化蛋白1(参见reynolds等，clinical chemistry 49：1733-1739(2003))。扫描的器官包括任何疑似缺血部位(例如脑、心脏、四肢、脊柱、肺、肾、视网膜)以及任何其他怀疑是出血源的器官。脑部扫描是区分缺血性和出血性中风的常用方法。诊断评估还可以包括获取或查看对象的病史和进行其他测试。单独或组合存在以下任何因素可用于评估再灌注治疗是否存在不可接受的风险：对象的症状轻微或迅速改善、
对象在中风发作时癫痫发作、对象在过去3个月内再次发生中风或严重的头部外伤、对象在过去14天内进行过大手术、对象已知有颅内出血史、对象持续收缩压》185mmhg、对象持续舒张压》110mmhg、需要积极治疗以降低对象的血压、对象有提示蛛网膜下腔出血的症状、对象在过去21天内有胃肠道或泌尿道出血、对象在过去7天内在不可压缩部位进行了动脉穿刺、对象在过去48小时内接受过肝素治疗且ptt升高、对象的凝血酶原时间(pt)》15秒、对象的血小板计数《100,000/μl、对象的血清葡萄糖《50mg/dl或》400mg/dl、对象为血友病患者或有其他凝血缺陷。
[0134]
进一步的诊断调查确定对象是否根据公认的标准或至少以比调查之前更大的概率患有缺血性病症，及确定对象是否出血，是否具有不可接受的出血风险，或是否由于不可接受的副作用风险而被排除接受再灌注治疗。然后，确认诊断为在中枢神经系统内或可能影响中枢神经系统的缺血状况且没有不可接受的副作用风险的对象可以接受再灌注治疗。在完成任何诊断程序后，可以尽快进行再灌注治疗。
[0135]
使用活性剂的治疗和再灌注治疗都独立地具有减少因缺血引起的梗塞大小和功能缺陷的能力。当根据本发明的方法联合使用时，梗塞大小和/或功能缺陷的减少优选大于在除组合(即合作)之外的可比较的方案下单独使用任一种药剂单独给药。更优选地，梗塞侧和/或功能缺陷的减少至少是相加的，或者优选地大于在除组合之外的可比方案下单独使用药剂实现的减少的相加(即协同)。在一些方案中，再灌注治疗在缺血发作后(例如，超过4.5小时)有效地减少梗塞面积和/或功能时间，而如果同时或之前给予psd-95抑制剂则无效。换而言之，当给对象施用活性剂和再灌注疗法时，再灌注疗法优选地至少与在没有活性剂的较早时间施用时一样有效。因此，活性剂通过在再灌注疗法生效之前或之后减少缺血的一种或多种破坏作用而有效地增加再灌注疗法的功效。因此，活性剂可以补偿实施再灌注治疗的延迟，无论延迟是由于对象认识到他或她的初始症状的危险的延迟、将对象运送到医院或其他医疗机构的延迟或执行确定存在缺血和/或不存在出血或其不可接受的风险的诊断程序的延迟。可以在临床试验中的群体之间或临床前工作中的动物模型群体之间证明活性剂和再灌注疗法的统计学显著的组合效应，包括相加或协同效应。
[0136]
尽管为了清楚理解的目的已经详细描述了本发明，但是可以在所附权利要求的范围内实施某些修改。本技术中引用的所有出版物、登录号(accession number)和专利文件出于所有目在此以通过引用的方式整体并入本文，就好像每一个单独表示一样。在多于一个序列在不同时间与登录号相关联的情况下，指的是截至本技术的有效申请日与登录号相关联的序列。有效申请日是最早披露相关登录号的优先权申请日期。除非从上下文中另外明显看出，本发明的任何元件、实施例、步骤、特征或方面可以与任何其它组合来执行。实施例
[0137]
实施例涉及具有以下名称和序列的肽。小写字母表示d氨基酸，大写字母表示l氨基酸。na-1(又名tat-nr2b9c或nerinetide)ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:58)d-tat-l-2b9c ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:80)na-3ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:6)d-na-1ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:81)
[0138]
1.na-1中的纤溶酶切割位点
[0139]
纤溶酶是由溶栓剂(如tpa)诱导的血清蛋白酶。纤溶酶切割位点可出现在由l氨基酸形成的肽中的碱性氨基酸残基的c末端侧。
[0140]
na-1用纤溶酶消化，产物通过质谱分析。检测到以下裂解产物：
[0141]
ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:58)(全长na-1，未消化的)
[0142]
rrqrrrklssiesdv(seq id no:82)
[0143]
rqrrrklssiesdv(seq id no:83)
[0144]
qrrrklssiesdv(seq id no:84)
[0145]
rrklssiesdv(seq id no:85)
[0146]
rklssiesdv(seq id no:86)
[0147]
klssiesdv(seq id no:2)
[0148]
lssiesdv(seq id no:87)
[0149]
这些切割产物暗示na-1在如图1所示的九个潜在位点中的七个处受切割。然而，在其他两个位点的切割可能以较小程度发生。
[0150]
2.与tpa同时给药的na-1在大鼠或人血浆中的降解用单独的na-1或用以下浓度的重组tpa处理大鼠或人血浆：-单独的na-1[65ug/ml](n＝4)-na-1[65ug/ml]+rt-pa[22.5ug/ml](n＝4)-na-1[65ug/ml]+rt-pa[67.5ug/ml](n＝4)-na-1[65ug/ml]+rt-pa[135ug/ml](n＝4)
[0151]
在6个不同的时间点收集样品。
[0152]
图2和图3示出：与单独使用na-1和体外大鼠血浆或体外人血浆相比，共同施用tpa时na-1含量衰减得更快。图4示出了在给大鼠施用na-1和tpa并收集血浆以确定不同时间点后的na-1水平后，cmax和auc的类似降低。因此，当在体外或体内同时施用这两种物质时，tpa会诱导大鼠或人血浆中na-1的裂解。tpa和tnk都不直接在磷酸盐缓冲盐水中直接切割na-1(数据未显示)。因此，na-1的裂解是在动物血浆或血液中纤溶酶原激活的结果。
[0153]
3.包括d氨基酸在内的肽的降解
[0154]
图5比较了na-1和d-tat-l-2b9c(也称为d-tat-l-na-1)单独或与tpa同时在大鼠血浆中体外给药。用tpa处理的na-1在约15分钟内衰减为零，而d-tat-l-2b9c在与tpa共同给药时仅显示可忽略不计的降解。图6示出了人血浆与大鼠血浆相似的结果。所发生的这种降解随着tpa的剂量而增加。
[0155]
使用tnk-组织纤溶酶原激活剂代替tpa，重复所述实验。tnk组织纤溶酶原激活剂是tpa的生物工程变体，具有更长的半衰期。用tnk作为tpa获得了类似的结果。na-1显示出与tnk共同给药的快速降解，而d-tat-l-2b9c是稳定的(图7和8)。
[0156]
图9示出了用pbs中的纤溶酶处理na-1或d-tat-l-2b9c的类似结果。na-1迅速降解，而d-tat-l-2b9c在有或没有纤溶酶的情况下表现出相似的稳定性。在pbs缓冲液(无血浆)中用tpa进行的对照处理显示na-1或d-tat-l-2b9c没有降解，因为在不提供血浆的情况下，tpa不会产生纤溶酶。
[0157]
4.d-tat-l-nr2b9c破坏psd-95:nr2b9c复合物
[0158]
对sprague-dawley大鼠进行三个软脑膜血管模型(3pvo)。大鼠在中风发作后1小
时服用安慰剂、na-1或d-tat-l-2b9c，每种剂量为7.6mg/kg。在中风发作后2小时收获大脑。收集皮质中风区域用于分析。用抗psd-95或抗nmdar2b进行免疫沉淀。通过蛋白质印迹分析样品中psd-95和nmdar2b的量。psd-95-nmdar2b复合物形成的减少通过安慰剂vs治疗的倍数减少来评估。图10示出了na-1和d-tat-l-2b9c都能够解离预先形成的nmdar2b:psd-95复合物并在体内有效地发挥作用。
[0159]
5.对psd-95的结合亲和力
[0160]
用竞争性elisa测定评估结合。用50mm碳酸氢盐缓冲液中的1ug/ml的psd95
pdz2
在4℃下涂覆板并过夜。在室温下，将板在pbst(0.05％)中的2％bsa中封闭2小时。然后，我们将板与150ng/ml的生物素化-na-1和浓度从120ug/ml开始的不同测试化合物的混合物在4℃下孵育过夜；在用pbs-t适当洗涤后，将板与(1:3000)sa-hrp一起孵育30分钟。再次洗涤孔，然后用tmb溶液孵育10分钟。用100ul h2so4终止反应。使用synergy h1读数器在450nm处测定吸光度。
[0161]
图12示出生物素化的na-1、d-tat-l-2b9c和d-tat-l-iesdv(seq id no:6)各自与psd-95结构域2结合并显示na-1、d-tat-l-2b9c和d-na-1的ec50。na-1和d-tat-l-2b9c的ec50在实验误差范围内大致相同，而d-na-1的ec50低约10倍。该结果提供证据表明，将最负责与psd-95结合的na-1的c末端残基转化为d氨基酸会降低结合亲和力。d-tat-l-2b9c和d-tat-l-iesdv(seq id no:6)以剂量依赖性方式有效结合靶蛋白ps95
pdz2
。两种测试肽的ic
50
值均《5um(图11)。图11显示ic
50
彼此在因素2以内(within a factor of two)，这在实验的误差范围内。
[0162]
6.药代动力学分析
[0163]
大鼠在仰卧位被麻醉(异氟醚1.5-％)并允许在0.5l/min o2中自主呼吸。左股动脉插管用于采血。
[0164]
以稳定浓度在赋形剂的总体积中制备测试剂。用连接到1cc注射器的14g导管通过插管进行肺滴注，测试剂将通过导管输送。将皮下(sq或sc)注射剂注射到左侧区域，每个部位的总体积不超过2ml。
[0165]
测试了以下化合物：na-1、d-tat-l-na1、d-tat-l-iesdv(seq id no:6)和d-na-1。每种给药策略在3只大鼠中评估每个剂量。计划的剂量水平和途径如下表3所示。对于第一个实验，评估两种不同的给药途径(sq和pi)，在8个不同的时间点收集血样：给药(250ul/样品)前和给药后的另外7次(1、2.5、5、10、15、30、60分钟)给药后。对于24小时pk曲线实验，在11个时间点采集血样：给药前、2.5分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、3小时、6小时、12小时和24小时。表4给药方法化合物剂量(mg/kg)皮下na-125 d-tat-nr2b9c25 na-325,8.3,2.8 d-na-125
ꢀꢀꢀ
肺滴注na-125
ꢀ
d-tat-nr2b9c25 na-325 d-na-125
[0166]
hplc定量：血浆从血液中分离出来并储存在-80℃直至使用。通过在》80℃下添加1m hcl(10ul/100ul样品)沉淀每个样品，离心(12,000rpm
×
15分钟)并收集沉淀物。用具有0.1％tfa的10％乙腈在40℃下平衡5cm c
‑‑‑
18rp-hplc色谱柱，进样样品并在agilent 1260infinity quaternary液相色谱系统中运行(30分钟，1.5ml/min；梯度：10％-35％的具有0.1％tfa的乙腈；在220nm处检测到吸光度)。hplc的标准曲线是从掺有已知量测试试剂的血浆样品中生成的。
[0167]
图13示出了皮下na-1具有比相同剂量的静脉内na-1低得多的cmax和稍低的auc，但具有更长的半衰期。与静脉内na相比，肌内na-1具有较低的cmax、稍高的auc和较高的半衰期。
[0168]
图14示出了与皮下na-1相比，皮下d-tat-l-iesdv(seq id no:6)(na-3)增加了cmax和auc。相对于皮下na-1，皮下d-tat-l-2b9c和d-na也增加了cmax和auc，但与d-tat-l-iesdv(seq id no:6)的程度不同。图15a-b示出皮下d-tat-l-iesdv(seq id no：6)的cmax和auc是剂量依赖性的，随剂量线性增加。
[0169]
图16示出d-tat-l-iesdv(seq id no:6)的肺滴注导致比na-1或d-tat-l-2b9c更高的cmax。
[0170]
7.肽对组胺释放的影响
[0171]
在来自大鼠的血浆样品中测试了d-tat-l-iesdv(seq id no:6)注射对组胺释放的影响，这些大鼠经受了三种不同剂量的na-3[sq]给药。在11个时间点收集血样：给药前、2.5分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、3小时、6小时、12小时和24小时。通过使用市售的组胺elisa测定试剂盒(组胺elisa-h1531-k01，eagle bioscience)对组胺水平进行量化。将板用血浆样品(50ul/孔)包被，在中频的定轨振荡器上室温孵育60分钟。然后向孔中加入100ul酶结合物，并在室温下孵育20分钟。再次洗涤样品，然后在室温下用tmb溶液孵育25分钟。用100ul h2so4终止反应。在elisa读板机上测定450nm处的吸光度。
[0172]
在注射前和给药后0、1、2.5、5、10、15、30和60分钟采集血样，并使用可商购的试剂盒对组胺水平进行定量。该采样期涵盖了在大鼠样品(n＝3只动物/组)中静脉注射后，对于na-1观察到的组胺升高的时期。
[0173]
图17示出了以8.3mg/kg或2.8m mg/kg的剂量皮下施用d-tat-l-iesdv(seq id no:6)不会导致显著的组胺释放。静脉注射7.6mg/kg的d-tat-l-na1确实导致组胺显著释放。25mg/kg sq给药的d-tat-l-iesdv(seq id no:6)导致组胺释放，但仍远低于7.6mg/kg iv给药。由7.6mg/kg iv给药的d-tat-l-2b9c诱导的组胺通过与洛度沙胺共同给药被消除(图18)。
[0174]
因此，包括d氨基酸的活性剂的皮下给药导致组胺释放减少且剂量高于静脉内给药。
[0175]
8.d-tat-l-2b9c在栓塞mca闭塞模型(embolic mca occlusion model)中作为神经保护剂的功效
[0176]
用异氟醚麻醉动物(5％用于诱导，2％用于手术，1.5％用于维持。股静脉和动脉用
95抑制而言是有效的。此外，当皮下给药时，增加的稳定性可能有助于提高相较于nerinetide的疗效。在25mg/kg剂量的nerinetide和7.6mg/kg剂量的na-3之间观察到等效的神经保护作用(减死梗塞体积)，表明3倍更低剂量的na-3也同样有效。
[0181]
与实现神经保护需要低得多的剂量的大鼠中风瞬时模型不同，3个软脑膜血管闭塞中风模型中的神经保护似乎需要2ug/ml(或摩尔当量)或以上的nerinetide血浆浓度。图22显示了先前模型中的动物在给药后15分钟的na-3和nerinetide的血浆浓度(图21)。尽管血浆水平在大约3小时内继续增加然后下降，但重要的是要在血液和大脑中实现快速蓄积，以应对中风等紧急情况。这表明，皮下施用本文呈现的结构的psd-95抑制剂可以在快速的时间范围内达到治疗浓度。对于药代动力学样品分析，通过将1μl的适当的储备液加入100μl血浆中制备浓度0、2.5、5、10、15、20和40ug/ml的nerinetide的校准标准样品。对于药代动力学样品分析的na-3标准曲线，通过将1μl的适当的储备液加入100μl血浆中制备浓度0、2.5、5、10、15、20和40ug/ml的na-3的校准标准样品。在皮下给予25mg/kg的nerinetide(n＝6)、7.6mg/kg的nerinetide(n＝8)、2.5mg/kg的nerinetide(n＝4)或25mg/kg na-3(n＝7)、7.6mg/kg的na-3(n＝9)、2.5mg/kg的na-3(n＝9)和安慰剂(n＝8)后15分钟收集血样。数据表示为平均值
±
sd。该图显示了单次皮下施用nerinetide或na-3后治疗剂量与cmax之间的剂量比例。与相同剂量的nerinetide相比，na-3在血浆中的稳定性更高，给药后15分钟的浓度更高。
[0182]
为确认血浆水平等于或大于来自人类研究的已知有效浓度(2.6mg/kg剂量的约10ug/ml血浆浓度)，将25mg/kg或7.6mg/kg na-3以皮下注射剂的形式施用于非人灵长类动物(食蟹猴)，血浆样品在不同时间点进行测试(图23)。两种浓度都能达到高于对人体有效的血浆浓度，并且高于2.6mg/kg na-1的静脉内剂量(hill,lancet 2020)。图24显示了测试的注射水平的药代动力学曲线。所有值均以平均值
±
sd表示；与单独的nerinetide相比的统计学显著性表示为*(具有事后土耳其校正的单向anova，*p《0.01)。(c
max
：基于外推的时间零值的最大血浆浓度；t
1/2
：终末期的半衰期；t
max
：达到cmax的时间；auc
0-t
：从0到最后一次测量的值的浓度-时间曲线下面积；auc
0-inf
：浓度-时间曲线下面积的从0到无穷大的外推面积；cl：总清除率)。数据表示为每组三至四只动物的平均值
±
sd。(-)表示由于外推auc
0-inf
大于20％和r2小于0.9而未报告的数据。
技术特征：1.一种活性剂，包含与抑制肽连接的内化肽，所述抑制肽抑制psd-95与nos和/或nmdar2b的结合，其中所述内化肽具有包含ygrkkrrqrrr(seq id no:1)的氨基酸序列，并且所述抑制肽具有包含klssiesdv(seq id no：2)或其变体的序列，在所述内化肽和抑制肽中总共具有最多五个取代或缺失，其中所述抑制肽的至少四个c末端氨基酸是l氨基酸，且包括所有r和k残基的连续的氨基酸片段是d氨基酸。2.根据权利要求1所述的活性剂，其中紧邻最c末端的r或k残基的c末端残基也是d残基。3.根据权利要求1或2所述的活性剂，其中作为融合肽的所述内化肽的c末端与所述抑制肽的n末端连接。4.根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂，其中所述抑制肽在c末端包含[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:3)。5.根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂，其中所述抑制肽在c末端包含i-e-[s/t]-d-v(seq id no:4)。6.根据权利要求1所述的活性剂，其中所述抑制肽在c末端包含iesdv(seq id no：5)。7.根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂，其中所述抑制肽的五个c末端氨基酸中的每一个都是l氨基酸。8.根据权利要求7所述的活性剂，其中所述活性剂的每隔一个的残基是d氨基酸。9.根据权利要求1所述的活性剂，具有氨基酸序列ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no:6)、ygrkkrrqrrrkssiesdv(seq id no:7)、ygrkkrrqrrrksiesdv(seq id no:8)或ygrkkrrqrrrkiesdv(seq id no:9)。10.根据权利要求1所述的活性剂，具有氨基酸序列ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no：6)，其中小写字母是d氨基酸，大写字母是l氨基酸。11.根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂，其与tat-nr2b9c相比在血浆中具有增强的稳定性。12.根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂，其与tat-nr2b9c相比具有增强的纤溶酶抗性。13.根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂，其对psd-95的结合亲和力在tat-nr2b9c的2倍以内。14.根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂，其抑制psd-95与nmdar2b结合的ic
50
在tat-nr2b9c的2倍以内。15.根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂，其与tat-nr2b9c竞争结合psd-95。16.根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂，其为氯盐。17.根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂的制剂，还包含组氨酸和海藻糖。18.根据权利要求1-16中的任意一项所述的活性剂的制剂，还包含磷酸盐缓冲剂。19.一种包含前述权利要求中的任意一项所述的活性剂和抗炎剂的复合制剂。20.根据权利要求19所述的复合制剂，其中所述抗炎剂是肥大细胞脱颗粒抑制剂或抗组胺。21.一种包含根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂和溶栓剂的复合制剂。22.一种治疗患有疾病或处于疾病风险中的对象的方法，所述疾病选自中风、脑缺血、
中枢神经系统外伤、蛛网膜下腔出血、疼痛、焦虑、癫痫，所述方法包括将根据前述权利要求中的任意一项所述的活性剂的有效方案施用至所述对象。23.一种治疗患有中风或有中风风险的对象中的缺血性中风的方法，包括向所述对象施用有效方案的活性剂，其中向所述对象共同施用溶栓剂，其中所述活性剂包含与抑制肽连接的内化肽，所述抑制剂抑制psd-95与nos和/或nmdar2b的结合，其中所述抑制肽的至少四个c末端氨基酸是l氨基酸，并且所述活性剂的剩余的氨基酸中的至少一个是d氨基酸，其中所述活性剂和溶栓剂的给药时间足够接近，以通过包含至少一个d氨基酸而减少所述溶栓剂诱导的活性剂的裂解。24.根据权利要求23所述的方法，其中作为融合肽的所述内化肽在n末端与所述抑制肽的c末端连接。25.根据权利要求23所述的方法，其中所述抑制肽包含[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no：3)作为最后四个残基。26.根据权利要求23所述的方法，其中所述抑制肽包含[i]-[e/d/n/q]-[s/t]-[d/e/q/n]-[v/l](seq id no:10)作为最后五个残基，其每一个都是l氨基酸。27.根据权利要求23所述的方法，其中所述内化肽是tat肽。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述tat肽的至少8个残基是d氨基酸。29.根据权利要求27所述的方法，其中所述tat肽的每个残基都是d氨基酸。30.根据权利要求23所述的方法，包含作为所述内化肽的ygrkkrrqrrr(seq id no：1)在其n末端连接至作为所述抑制肽的klssiesdv(seq id no：2)或klssiesdv(seq id no：12)，形成融合蛋白。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述活性剂包含d残基的连续片段，包括k残基和r残基中的每一个。32.根据权利要求23所述的方法，其中所述活性剂包括ygrkkrrqrrrklssiesdv(seq id no：6)，其中小写字母代表d氨基酸，大写字母代表l氨基酸。33.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中所述溶栓剂在所述活性剂前的60、30或15分钟的窗口内给药。34.根据前述权利要求中的任意一项所述的方法，其中所述活性剂和溶栓剂同时给药。35.一种向有需要的对象递送活性剂的方法，包括通过非静脉途径施用根据前述权利要求中的任意一项所定义的活性剂，其中所述活性剂以治疗水平递送至血浆。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述活性剂经皮下给药。37.根据权利要求35所述的方法，其中所述活性剂经肌肉内给药。38.根据权利要求35所述的方法，其中所述活性剂经鼻内或肺内给药。39.根据权利要求35所述的方法，其中所述剂量大于3mg/kg。40.根据权利要求35所述的方法，其中所述剂量大于10mg/kg。41.根据权利要求35所述的方法，其中所述剂量大于20mg/kg。42.根据权利要求35所述的方法，其中所述剂量小于10mg/kg，并且所述活性剂在不联合施用肥大细胞脱颗粒抑制剂或抗组胺的情况下施用。43.根据权利要求35所述的方法，其中所述剂量大于10mg/kg，并且施用所述活性剂。44.根据权利要求35所述的方法，其中所述对象患有疾病或处于疾病风险中，所述疾病
选自中风、脑缺血、中枢神经系统外伤、疼痛、焦虑、癫痫、蛛网膜下腔出血、阿尔茨海默病或帕金森病。
技术总结本发明提供了先前描述的用于治疗中风的活性剂Tat-NR2B9c的变体，其中通过在C末端包含L氨基酸而保留靶结合特征并且通过在别处包含D氨基酸赋予纤溶酶抗性。示例性试剂具有序列ygrkkrrqrrrklssIETDV(SEQ IDNO：62)。所得活性剂具有几个优点，包括与溶栓剂同时给药，而不会因纤溶酶消化而显着丧失活性。所得药剂还更适合通过静脉输注的替代途径给药，例如皮下、鼻内和肌肉内，以及用于治疗慢性病的多剂量给药方案。量给药方案。量给药方案。
技术研发人员：迈克尔
受保护的技术使用者：诺诺公司
技术研发日：2021.01.08
技术公布日：2022/11/1
