1.本发明涉及食品检测领域，涉及一种同时检测鸡蛋或牛奶中的27种抗生素的方法，尤其涉及一种双水相萃取结合液质联用技术同时检测鸡蛋、牛奶中27种抗生素的方法。
背景技术：2.随着我国畜禽养殖业的迅速发展，养殖规模越来越大。畜禽养殖业的发展离不开抗生素，在动物饲养过程中疾病的预防、治疗以及为了减少畜禽的生长周期，抗生素起到了不可或缺的作用。然而不当或滥用抗生素造成其在动物源食品中残留，已有研究表明抗生素可以在鸡蛋、牛奶中转移和积累，残留的抗生素可能通过低剂量暴露直接引起疾病，或通过抗生素耐药性间接造成伤害，从而对人类产生不利影响，因此对动物源食品中兽药残留进行检测，对人体饮食暴露风险评估和生态风险评估具有重要的意义。
3.鸡蛋、牛奶中含有丰富的蛋白质和脂质，这些成分的存在对抗生素残留分析结果有很大的影响，因而使得提取和净化鸡蛋、牛奶中的抗生素成为一个极富挑战的难题。因此，建立一种有效的分离富集方法对准确测定鸡蛋、牛奶中的抗生素的含量尤为重要。
4.动物源食品中抗生素残留的分析方法主要包括提取和检测两个基本方面。
5.样品前处理中常用的提取方法主要有液-液萃取法、微波萃取法、加速溶剂萃取法、超临界流体萃取法和固相萃取法等。其中，液-液萃取法是抗生素残留分析中典型的提取方法，具有操作简单、用时短、成本低等特点。双水相萃取是一种较新的液-液萃取方法，基本原理同传统的液液萃取相似，即根据被分离物质在两相中不同的选择性分配来实现物质的分离。传统的液液萃取根据被分离物质在水和有机溶剂中的溶解度不同进行分配，而双水相体系中被分离物质受到离子键、氢键、疏水作用及范德华力等力的作用以及体系环境的影响，从而表现出更好的选择性，该方法之前多用于分离生物体内的多种蛋白和酶等物质。
6.双水相萃取体系主要有高聚物-高聚物双水相体系、高聚物-无机盐双水相体系、表面活性剂双水相体系、小分子有机溶剂-无机盐双水相体系。小分子有机溶剂-无机盐双水相体系是一种新型的双水相体系，其具有以下特点：(1)小分子有机溶剂的粘度比聚合物小，传质速率快，分相速度快；(2)小分子有机溶剂的毒性较低，无溶剂残留；(3)原料成本低。因此，开展小分子有机溶剂-无机盐双水相体系的研发，具有潜在的应用价值。
7.目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法(hplc)和高效液相色谱串联质谱法(hplc
–
ms/ms)。其中，hplc
–
ms/ms兼具hplc强的分离能力，同时又具有ms高灵敏度和极强的定性鉴定能力，是目前检测环境复杂基质痕量抗生素残留最有效的手段之一，具有分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快和自动化程度高等优点。可准确地定性、定量测定复杂混合物的组分。
8.目前针对鸡蛋和牛奶中多种抗生素的分离和共检测尚无一套完整可靠的分析方法，现有的方法普遍存在不稳定、干扰多、检测抗生素诉的种类和数量有限、回收率有限等
问题。因此，需要寻求一种快速、高效、灵敏、准确地检测鸡蛋和牛奶中尽可能多的抗生素残留的包括分离富集和共检测的完整可靠的分析方法，以满足日趋严格的残留限量要求。
技术实现要素：9.本发明的目的旨在：克服现有技术存在的不稳定、干扰多、检测抗生素诉的种类和数量有限、回收率有限等问题的不足。提供一种检测结果稳定、干扰小、快速、高效的同时检测鸡蛋或牛奶中残留的27种典型抗生素的方法，即一种双水相萃取结合液质联用技术同时检测鸡蛋或牛奶中27种抗生素的方法。
10.本发明的详细技术方案如下：
11.一种双水相萃取结合液质联用技术同时检测鸡蛋或、牛奶中27种抗生素的方法，其包括：
12.(1)样品处理
13.将鸡蛋或牛奶样品搅拌均匀，依次加入指示回收率的内标物、edta-2na溶液、提取溶剂和分相盐，形成双水相；
14.取上清液并吹干，所得残渣使用有机溶液重新溶解，定容；
15.过滤后转移至进样瓶中，待测；
16.(2)超高效液相色谱串联质谱法测定样品中6类27种抗生素的含量
17.采用内标标准曲线法，在超高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的从样品中萃取到的6类27种抗生素的含量，其中，所述的6类27种抗生素为：
18.磺胺类的磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪；
19.喹诺酮类的诺氟沙星、环丙沙星、达诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、氟罗沙星、沙拉沙星；
20.四环素类的盐酸四环素、盐酸多西环素、土霉素、盐酸金霉素；
21.β-内酰胺类的头孢噻呋；
22.大环内酯类的克拉霉素、阿奇霉素、替米考星、泰乐菌素；
23.氯霉素类的氟苯尼考、甲砜霉素、氯霉素。
24.进一步的，步骤(1)中，分别加入10mg
·
l-1
的磺胺甲噁唑-d4、氧氟沙星-d3、四环素-d6、头孢噻呋-d3、氟苯尼考-d3和氯霉素-d5六种指示回收率的内标物。
25.进一步的，步骤(1)中，edta-2na溶液的浓度为0.1m。
26.进一步的，步骤(1)中，所述提取溶剂为含0.2％甲酸的乙腈溶液，加入所述提取溶剂后涡旋混匀并静置30min。
27.进一步的，步骤(1)中，所述分相盐为硫酸铵，所述分相盐与所述样品的质量比为1.4-1.6:2。
28.进一步的，步骤(1)中，取上清液后在40℃的水浴中氮气流下吹干，所得残渣使用含0.2％甲酸的甲醇水溶液重新溶解，定容；用针式过滤器过滤至进样瓶内，其中，针式过滤器选用孔径为0.22μm的尼龙滤膜。
29.进一步的，步骤(1)中，所述甲醇水溶液中，甲醇与水的体积比为9:1。
30.进一步的，步骤(2)中，氯霉素类的3种抗生素采用负离子模式进行检测，其余的24
种抗生素均采用正离子模式进行检测，其中：正离子模式模式选用waters acquity uplc iclass超高效液相色谱串联water to-xs质谱仪，负离子模式选用岛津30a超高效液相色谱串联美国ab公司的ab5500 q-trap质谱仪。
31.进一步的，正离子模式下的检测参数：
32.液相色谱检测条件为：色谱柱选用waters acquity uplc beh c18柱型号2.1mm
×
50mm，0.7μm，色谱柱柱温40℃，进样量1.5μl，流动相a为0.5％甲酸水溶液，流动相b为乙腈，流动相流速为0.35ml
·
min-1
；
33.洗脱梯度为：0.0-1.0min，90a/10b，1.2-2.5min，80a/20b，2.7-4.5min，3a/97b，4.7-7.5min，90a/10b；
34.质谱参数为：采用电喷雾离子源正离子模式esi+，扫描方式为多反应监测模式mrm，脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流量为1000l
·
hr-1
，毛细管电压为3500v，碰撞气为氩气。
35.进一步的，负离子模式下的检测参数：
36.液相色谱检测条件为：色谱柱选用waters acquity uplc beh c18柱型号2.1mm
×
100mm，色谱柱柱温40℃，进样量1.5μl，流动相a为超纯水，流动相b为乙腈，流动相流速为0.35ml
·
min-1
；
37.洗脱梯度为：0.0-1.0min，90a/10b，1.2-3min，60a/40b，3.5-5min，10a/90b，5.2-7.5min，90a/10b
38.质谱参数为：采用电喷雾离子源负离子模式esi-，扫描方式为多反应监测模式mrm，离子源温度为500℃，离子化电源电压为-4500v，气帘气cur为35psi，35psi，喷雾气gs1为50psi，辅助加热气gs2为50psi，碰撞气为氮气。
39.本发明的提供了一种采用双水相体系萃取结合液质联用技术同时检测鸡蛋、牛奶中的27种抗生素的方法，该方法能够实现快速、高效、灵敏、准确地同时检测鸡蛋和牛奶中6类27种抗生素，大大提高了检测效率，降低了前处理的成本，并且检测结果稳定、基质干扰小。
40.与现有技术相比，本发明存在的优势是：
41.1)本发明采用较新的液-液萃取方法，即双水相萃取，该方法萃取条件温和，提取溶剂中存在一定比例的水溶液，使蛋白质缓慢变性，减少目标物的损失，该方法传质速度快，能够较快的达到平衡状态，实现快速分离，该方法影响因素多，可通过多种方式提高萃取率；
42.2)本发明使用酸化乙腈-硫酸铵-水体系形成双水相，该方法具有双向萃取特性，将萃取与纯化相结合达到一步净化样品的目的，降低了萃取程序的复杂性。该体系中目标物提取到上层有机相中，蛋白质基质悬浮于两相中间，水溶性杂质分配到下层水相，因此能够很好消除上层有机相中的杂质，基质效应小；
43.3)本发明提供的一种同时检测鸡蛋和牛奶中27种抗生素的方法，萃取步骤非常简单，分析成本非常低，实际样品的检测过程中，回收率佳；
44.4)本方法采用内标标准曲线法对抗生素定量，测定结果线性关系好，相对偏差小，提高了分析的精密度；
45.5)本发明的方法将指示回收率的内标物加在双水相体系萃取前，能够更准确地表
示整个前处理过程中抗生素的损失，同时，考虑不同种类的抗生素在前处理过程中有不同干扰程度的损失，对结构相似的抗生素选用同种内标物指示回收率，由于内标物选用得当，使得最终检测结果更加真实可靠。
46.6)本发明采用超高效液相色谱串联质谱仪进行定量分析检测，灵敏度高，27种抗生素的仪器检测限均低于1.6μg
·
l-1
，能够满足鸡蛋和牛奶中痕量抗生素的检测要求。此外，串联三重四级杆质谱仪根据对应母离子碰撞产生的特征碎片离子进行定性分析，选择性强，排除了样品中其他杂质信号的干扰；
47.7)本发明中有机试剂使用量少，环境友好。一次进样可以检测出鸡蛋和牛奶中的27种抗生素检测过程耗时少，节约人力物力成本。
附图说明
48.图1为直接取样及使用两种不同浓度的甲醇水溶液作为重溶溶剂测得的样品中的27种抗生素的加标回收率。
具体实施方式
49.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
50.实施例1
51.1、样品前处理
52.实验前，将鸡蛋、牛奶样品均质化，其中，鸡蛋的蛋清和蛋黄应充分混匀。称取2.00g均质化后的样品于30ml玻璃离心管中，分别加入10μl浓度为10mg
·
l-1
的磺胺甲噁唑-d4、氧氟沙星-d3、四环素-d6、头孢噻呋-d3、氟苯尼考-d3和氯霉素-d5等6种内标物，充分混匀后加入1.5ml浓度为0.1m的edta-2na溶液，再加入8.5ml含0.2％甲酸的乙腈溶液，涡旋混合2min，静置30min。加入2g硫酸铵，涡旋混合2min，静置2h，溶液分层形成双水相。取上层清液5ml，在40℃水浴中氮吹吹干，残渣用1ml含0.2％甲酸的甲醇水溶液(v:v＝9:1)溶解，经0.22μm玻璃纤维滤膜过滤至进样小瓶待测。
53.2、配备标准溶液
54.准确称取100.00mg抗生素和内标物标准品，用甲醇定容至100ml，使其最终浓度为1000mg
·
l-1
，诺氟沙星用1ml 0.5mol
·
l-1
盐酸溶解后用甲醇定容。所有标准溶液转移至试剂瓶中，-20℃避光冷藏保存。
55.将27种抗生素的标准溶液配制成浓度为10mg
·
l-1
的混合标准溶液，用含0.2％甲酸的90％甲醇水溶液稀释成一系列浓度梯度标准溶液。其中：
56.27种抗生素包括：
57.磺胺类的磺胺嘧啶(sd)、磺胺甲恶唑(smx)、磺胺噻唑(st)、磺胺甲基嘧啶(sm1)、磺胺二甲异恶唑(siz)、磺胺二甲基嘧啶(sm2)、磺胺间甲氧嘧啶(smm)、磺胺氯哒嗪(scp)。
58.喹诺酮类的诺氟沙星(nor)、环丙沙星(cip)、达诺沙星(dan)、恩诺沙星(enr)、氧氟沙星(ofx)、氟罗沙星(fle)、沙拉沙星(sfx)。
59.四环素类的盐酸四环素(tc)、盐酸多西环素(dox)、土霉素(otc)、盐酸金霉素(ctc)。
60.β-内酰胺类的头孢噻呋(cef)。
61.大环内酯类的克拉霉素(ccr)、阿奇霉素(cla)、替米考星(til)、泰乐菌素(afb)。
62.氯霉素类的氟苯尼考(ff)、甲砜霉素(thi)、氯霉素(chl)。
63.标准溶液中的6种内标物的浓度为100.0μg
·
l-1
。一系列浓度梯度的标准溶液中27种抗生素的浓度分别为1.37、4.12、12.35、37.04、111.11、333.33、500μg
·
l-1
。
64.3、超高效液相色谱串联质谱法测定
65.采用超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)法进行测定，分别检测样品溶液和标准溶液，将获得的样品溶液的液相色谱图与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据特征峰的相对保留时间和相对丰度比指认共有特征峰定性，再根据共有特征峰面积通过内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中27种抗生素的浓度。
66.根据目标物的性质，氯霉素类抗生素(ff、thi和chl)采用负离子模式分析，其余抗生素均采用正离子模式分析。为了保证分析的稳定性，正离子和负离子模式分别在不同的液质仪中进行检测。正离子模式选用waters acquity uplc iclass超高效液相色谱串联waters tq-xs质谱仪，负离子模式选用岛津30a超高效液相色谱串联质美国ab公司的ab 5500q-trap质谱仪。
67.优化后的液相色谱条件及质谱参数见表1和2，各抗生素和内标物的质谱检测条件见表3。
68.表1.正离子模式hplc-ms/ms检测条件
[0069][0070]
表2.负离子模式hplc-ms/ms检测条件
[0071][0072]
表3. 27种抗生素和内标的质谱检测条件
[0073]
[0074][0075]
优选的，本实施例中，将获得的样品溶液的液相色谱图与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据特征峰的相对保留时间和相对丰度比指认共有特征峰定性具体为：定性分析按照液质条件测定样品溶液和标准溶液，记录样品溶液和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，当样品溶液中检出与某标准品色谱峰保留时间一致的色谱峰(变化范围在
±
2.5％之内)，并且样品溶液色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比(k)的偏差不超过表4规定的范围，可以确定样品溶液中检出相应目标物。样品溶液中抗生素的值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围时稀释后再进行分析。
[0076]
表4.定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
[0077][0078]
优选的，本实施例中的内标标准曲线法的定量过程如下：
[0079]
1)将27种抗生素混合标准溶液用含0.2％甲酸的90％甲醇水溶液稀释成一系列浓度梯度(1.37、4.12、12.35、37.04、111.11、333.33、500μg
·
l-1
)，内标以100μg
·
l-1
的浓度添加到标准品中，用内标法以理论浓度为横坐标，响应值(响应值＝目标物峰面积/内标物峰面积)为纵坐标绘制7点标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到27种抗生素标准曲线的回归方程。
[0080]
2)将样品溶液进行高效液相色谱质谱联用法分析，将获得的27种抗生素与内标的色谱峰面积比，代入到相应抗生素的标准工作曲线的回归方程，并根据内标的已知浓度，计算得到样品溶液中27种抗生素的浓度。
[0081]
实施例2
[0082]
为了实现鸡蛋和牛奶中多种抗生素提取效率的最大化，本发明采用单因素实验进一步优化提取过程，按实施例1中的步骤1获得的样品，设立两组用于对比实验的样品，一组
为标准样品组，另一组为空白样品组，每组设3个平行样。
[0083]
(1)提取溶剂优化
[0084]
四环素类十分容易与蛋白质和金属离子配合，从而影响提取效率。本发明将双水相体系中的纯水换成0.1m的edta-2na溶液进行加标回收率实验，以减少配合作用。结果表明，四环素类抗生素的回收率有明显提高，从49.0-87.4％提高到58.8-99.0％，其他抗生素未受太大影响。因此，在鸡蛋和牛奶的实际检测中，选用0.1m的edta-2na溶液作为水相。
[0085]
(2)重溶溶剂
[0086]
不同的重溶溶剂可能对于目标抗生素的溶解能力不同，去基质能力不同。本发明共测试了3种条件，分别为1、取上层清液1ml直接检测；1、取上清液5ml，氮吹吹干，用含0.2％fa甲醇水(v:v＝7:3)重溶；3、取上清液5ml，氮吹吹干，用含0.2％fa甲醇水(v:v＝9:1)重溶。
[0087]
测得鸡蛋中27种抗生素的加标回收率如图1所示，直接取样时，大环内酯类的ccr、til和afb回收率明显偏高，可能受基质的影响，内标无法有效指示其回收率。氮吹重溶后进样，各类抗生素的加标回收率趋于稳定，用含0.2％fa甲醇水(v:v＝7:3)重溶时，ctc和afb的回收率仍然偏低，将甲醇含量增加至90％时，回收率明显提高，说明高有机溶剂含量更有利于目标抗生素的溶解。
[0088]
本发明考虑到蛋清和蛋黄的基质存在差异，将两者分开进行加标回收率实验，结果表明两者的回收率相差不大，故在实际检测中将蛋清和蛋黄混合后进行分析。
[0089]
实施例3
[0090]
将一系列浓度梯度的27种抗生素的混合标准溶液(1.37、4.12、12.35、37.04、111.11、333.33、500μg
·
l-1
)，用液质联用法进行分析。用内标法以理论浓度为横坐标，响应值(响应值＝目标物峰面积/内标物峰面积)为纵坐标绘制7点标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到27种抗生素标准曲线的回归方程。采用信噪比法(s/n)确定仪器的检出限和定量限，以3倍信噪比估算检出限(lod)，10倍信噪比估算定量限(loq)。
[0091]
27种抗生素的标准曲线、相关系数、检出限和定量限如表5所示。由表5可知，27种抗生素的具有良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.99，仪器定量限范围在0.2483-2.1373μg
·
l-1
，能够满足检测要求。
[0092]
表5.27种抗生素的标准曲线、相关系数、检出限和定量限
[0093][0094]
实施例4
[0095]
按实施例1的步骤1和3，对鸡蛋和牛奶样品进行加标回收率实验。设置两组加标浓度，分别为20和100μg
·
kg-1
，每组做3个平行样，计算加标回收率(re)和相对标准偏差(rsd)。
[0096]
加标回收率(re％)的计算公式如下：
[0097][0098]
其中：
[0099]
c0为混合标准溶液的浓度，μg
·
l-1
；
[0100]
c1为未加入混合标准溶液样品的检测浓度，μg
·
l-1
；
[0101]
c2为加入混合标准溶液样品的检测浓度，μg
·
l-1
；
[0102]v0
为混合标准溶液的体积，l；
[0103]v1
为未加入混合标准溶液样品的上机前定容体积，l；
[0104]v2
为加入混合标准溶液样品的上机前定容体积，l。
[0105]
本发明考察了鸡蛋和牛奶中27种抗生素在不同浓度下的加标回收率，结果如6表所示。鸡蛋和牛奶中各抗生素的加标回收率分别为63.1-122.8％和70.9-122.2％，相对标准偏差均低于15.4％，鸡蛋和牛奶的加标回收率结果相似，说明这两种样品的基质影响类似，不同种类抗生素的加标回收率存在差异，说明不同抗生素存在不同基质干扰，通过添加
内标物校正过程损失，一定程度上降低了基质干扰带来的影响。
[0106]
表6.鸡蛋、牛奶中不同加标浓度抗生素的加标回收率及相对标准偏差
[0107][0108][0109]
实施例5
[0110]
鸡蛋和牛奶样品购于上海市某市场的市售产品，按实施例1的步骤1对样品进行处理后，按实施例1的步骤3对样品中目标物的实际浓度进行检测分析，以考察本发明对牛奶、鸡蛋样品的适用性。
[0111]
实际检测得到的鸡蛋和牛奶样品中抗生素的残留情况如表7所示。结果表明，本发明适用于鸡蛋和牛奶中多种抗生素含量的测定，具有良好的适用性。
[0112]
表7.鸡蛋、牛奶样品中27种抗生素的含量
[0113][0114][0115]
上文对本发明进行了足够详细的具有一定特殊性的描述。所属领域内的普通技术人员应该理解，实施例中的描述仅仅是示例性的，在不偏离本发明的真实精神和范围的前提下做出所有改变都应该属于本发明的保护范围。本发明所要求保护的范围是由所述的权利要求书进行限定的，而不是由实施例中的上述描述来限定的。
技术特征：7.5min，90a/10b质谱参数为：采用电喷雾离子源正离子模式esi+，扫描方式为多反应监测模式mrm，脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流量为1000l
·
hr-1
，毛细管电压为3500v，碰撞气为氩气。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，负离子模式下的检测参数：液相色谱检测条件为：色谱柱选用waters acquity uplc beh c18柱型号2.1mm
×
100mm，色谱柱柱温40℃，进样量1.5μl，流动相a为超纯水，流动相b为乙腈，流动相流速为0.35ml
·
min-1
；洗脱梯度为：0.0-1.0min，90a/10b，1.2-3min，60a/40b，3.5-5min，10a/90b，5.2-7.5min，90a/10b；质谱参数为：采用电喷雾离子源负离子模式esi-，扫描方式为多反应监测模式mrm，离子源温度为500℃，离子化电源电压为-4500v，气帘气cur为35psi，35psi，喷雾气gs1为50psi，辅助加热气gs2为50psi，碰撞气为氮气。
技术总结本发明提供了一种双水相萃取结合液质联用技术同时检测鸡蛋或牛奶中27种抗生素的方法，包括：(1)样品处理：将鸡蛋或牛奶样品搅拌均匀，依次加入指示回收率的内标物、EDTA-2Na溶液、提取溶剂和分相盐，形成双水相；取上清液吹干，所得残渣用有机溶液重新溶解定容；过滤后转移至进样瓶中，待测；(2)超高效液相色谱串联质谱法测定样品中6类27种抗生素的含量：采用内标标准曲线法，在超高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的从样品中萃取到的6类27种抗生素的含量。本发明能够实现快速、高效、灵敏、准确地同时检测鸡蛋和牛奶中6类27种抗生素，大大提高了检测效率，降低了前处理的成本，且检测结果稳定、基质干扰小。基质干扰小。基质干扰小。
技术研发人员：张洪昌 李贞金 胡双庆 沈根祥 朱英 郭文宏 张红霞 周萌萌
受保护的技术使用者：上海市环境科学研究院
技术研发日：2022.06.14
技术公布日：2022/11/1
