磺酰苯甲酰胺类衍生物及其偶联物、其制备方法及其应用与流程

1.本披露涉及一类磺酰苯甲酰胺类衍生物及其配体-药物偶联物。具体地说，本披露涉及一种含全新结构的抗体-药物偶联物，及其制备方法，和包含所述偶联物的药物组合物以及所述偶联物或药物组合物的用途。


背景技术：

2.肿瘤细胞区别于正常细胞的一个重要特点就是细胞凋亡受到抑制，从而使得他们具有更大的生存优势。bcl-2家族蛋白是调节凋亡抑制的重要因子。
3.bcl-2家族蛋白主要存在于线粒体膜上，根据功能可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白两大类。抗凋亡蛋白包括bcl-2，bcl-xl，bcl-w和mcl-1等。促凋亡蛋白包括bax，bak以及bh3-only蛋白。bax和bak被激活的时候，会形成多聚体空洞，使细胞线粒体膜的通透性增加，促进细胞色素c等释放到细胞质中，导致细胞死亡。bh3-only蛋白只包含bh3结构域。在细胞存活的状态下，bh3-only 蛋白(如bim)与抗凋亡蛋白结合。当细胞受到外界压力时，结合的平衡被打破， bh3-only蛋白被释放出来与线粒体上bax结合，促进bax/bak形成多聚体，促进细胞色素c和smac释放到细胞质中，激活下游凋亡通路。
4.现有的临床前数据表明bcl2/bcl-xl双靶抑制剂abt263除了对血液瘤有效外对实体瘤，特别是小细胞肺癌，也有很好的抑制效果。但是abt263在临床上表现出对血小板的毒性限制了他的药效，最后导致临床试验终止。
5.目前仍然需要对bcl2/bcl-xl双靶抑制剂进行研究，以使它可作为单药或联合用药或用于adc中，以满足临床的需求。


技术实现要素：

6.本披露提供了一种具有通式(d)所示的化合物，或其可药用的盐：
7.8.其中：
9.r1选自氢原子、卤素、羟烷基、羟基、烷基、烷氧基、氘代烷基、环烷基、杂环基、-c(o)-烷基、芳基和杂芳基；所述的烷基、-c(o)-烷基、环烷基和杂环基各自独立地任选进一步被一个或多个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、烷基、氘代烷基、环烷基、羟基、-c(o)nr
11r12
、-c(o)or
13
、烷氧基、芳基和杂芳基；
10.r
11
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
11.r
12
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
12.r
13
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
13.l1选自亚烷基、亚烷基-o-c(o)-n(r
14
)-亚烷基和亚烷基-n(r
15
)-c(o)-亚烷基；
14.r
14
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
15.r
15
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
16.各个x相同或不同，各自独立地选自碳原子、氧原子、硫原子和氮原子，m 选自0，1，2和3；
17.各个r2相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、氘代烷基和烷基t1选自 1、2、3和4；
18.r3选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，
19.r4选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，
20.各个r5相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t2选自1、2、3、4和5；
21.各个r6相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t3选自1、2、3和4；
22.各个r7相同或不同，选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t4 选自1、2、3和4；
23.r8选自烷基、氨基、羟基、烷氧基和磷酸烷氧基；
24.各个r9相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t5选自1、2、3和4；
25.各个r
10
相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t6选自1至2，3，4和5。
26.在另一些实施方案中，如前所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的x为碳原子；m选自1，2和3。
27.在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的r2，r3，r4，r5，r6，r7和r9各自独立地选自氢原子或c
1-6
烷基。
28.在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其为通式(d-i)所示的化合物：
[0029][0030]
或其可药用的盐，
[0031]
其中l1，r1，r8和r
10
如通式(d)中所定义。
[0032]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(d)或通式(d-i)所示的化合物或其可药用的盐，其为通式(d-ii)或通式(d-iii)所示的化合物：
[0033][0034]
或其可药用的盐，
[0035]
其中l1，r1，r8和r
10
如通式(d)中所定义。
[0036]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(d)、通式(d-i)、通式(d-ii)或通式(d-iii)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的l1选自c
1-6
亚烷基、c
1-6
亚烷基-o-c(o)-n(r
14
)-c
1-6
亚烷基和c
1-6
亚烷基-n(r
15
)-c(o)-c
1-6
亚烷基，r
14
为氢原子或c
1-6
烷基，r
15
为氢原子；优选地，l1为c
1-6
亚烷基；更优选地，l1为
ꢀ‑
ch
2-ch
2-。
[0037]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(d)、通式(d-i)或通式(d-ii)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的r1选自氢原子、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、-c(o)
‑ꢀc1-6
烷基和苯基；所述的c
1-6
烷基、-c(o)-c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基各自独立地任选进一步被1至3个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、羟基、-c(o)nr
11r12
、-c(o)or
13
、苯基和5元至10元杂芳基；r
11
为氢原子或c
1-6
烷基；r
12
为氢原子或c
1-6
烷基；r
13
为氢原子或c
1-6
烷基；
[0038]
优选地，r1选自氢原子、c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基；所述的c
1-6
烷基任选进一步被1至3个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、c
3-6
环烷基、羟基、
ꢀ‑
c(o)nr
11r12
、-c(o)
or
13
、苯基、噻唑基和吡啶基；r
11
为氢原子或c
1-6
烷基；r
12
为氢原子或c
1-6
烷基；r
13
为氢原子或c
1-6
烷基。
[0039]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(d)、通式(d-i)、通式(d-ii)或通式(d-iii)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的r
10
为卤素或卤代c
1-6
烷基，优选为氯原子。
[0040]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(d)、通式(d-i)、通式(d-ii)或通式(d-iii)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的r8选自羟基和磷酸c
1-6
烷氧基，优选为羟基。
[0041]
在本披露的一些实施方案中，如前任一项所述的通式(d)、通式(d-i)、通式(d-ii) 或通式(d-iii)所示的化合物或其可药用的盐，包括但不限于下表：
[0042]
[0043]
[0044]
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]
[0049]
[0050]
[0051][0052]
或其可药用的盐。
[0053]
本披露还提供一种通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐：
[0054][0055]
其中：
[0056]
r1选自氢原子、卤素、羟烷基、羟基、烷基、烷氧基、氘代烷基、环烷基、杂环基、-c(o)-烷基、芳基和杂芳基；所述的烷基、-c(o)-烷基、环烷基和杂环基各自独立地任选进一步被一个或多个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、烷基、氘代烷基、环烷基、羟基、-c(o)nr
11r12
、-c(o)or
13
、烷氧基、芳基和杂芳基；
[0057]r11
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
[0058]r12
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
[0059]r13
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
[0060]
l1选自亚烷基、亚烷基-o-c(o)-n(r
14
)-亚烷基和亚烷基-n(r
15
)-c(o)-亚烷基；
[0061]r14
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
[0062]r15
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
[0063]
各个x相同或不同，各自独立地选自碳原子、氧原子、硫原子和氮原子，m 选自0，1，2和3；
[0064]
各个r2相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、氘代烷基和烷基，t1选自1、2、3和4；
[0065]
r3选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，
[0066]
r4选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，
[0067]
各个r5相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t2选自1、2、3、4和5；
[0068]
各个r6相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t3选自1、2、3和4；
[0069]
各个r7相同或不同，选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t4 选自1、2、3和4；
[0070]
r8选自烷基、氨基、羟基、烷氧基和磷酸烷氧基；
[0071]
各个r9相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t5选自1、2、3和4；
[0072]
各个r
10
相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t6选自1至2，3，4和5；
[0073]
y为约1至约10；
[0074]
pc为配体；l为接头单元。
[0075]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的x为碳原子；m选自1，2和3。
[0076]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的r2，r3，r4，r5，r6，r7和r9各自独立地选自氢原子和c
1-6
烷基。
[0077]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其为通式(pc-l-d-i)所示的化合物：
[0078][0079]
或其可药用的盐，
[0080]
其中pc，l，l1，y，r1，r8和r
10
如通式(pc-l-d)中所定义。
[0081]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)或通式(pc-l-d-i)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其为通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的化合物：
[0082][0083]
或其可药用的盐，
[0084]
其中pc，l，l1，y，r1，r8和r
10
如通式(pc-l-d)中所定义。
[0085]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的l1选自c
1-6
亚烷基、c
1-6
亚烷基-o-c(o)-n(r
14
)-c
1-6
亚烷基和c
1-6
亚烷基
ꢀ‑
n(r
15
)-c(o)-c
1-6
亚烷基，r
14
为氢原子或c
1-6
烷基，r
15
为氢原子；优选地，l1为 c
1-6
亚烷基；更优选地，l1为-ch
2-ch
2-。
[0086]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的r1选自氢原子、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、-c(o)-c
1-6
烷基和苯基；所述的c
1-6
烷基、-c(o)-c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基各自独立地任选进一步被1至3个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、羟基、-c(o)nr
11r12
、
ꢀ‑
c(o)or
13
、苯基和5元至10元杂芳基；r
11
为氢原子或c
1-6
烷基；r
12
为氢原子或 c
1-6
烷基；r
13
为氢原子或c
1-6
烷基；
[0087]
优选地，r1选自氢原子、c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基；所述的c
1-6
烷基任选进一步被1至3个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、c
3-6
环烷基、羟基、
ꢀ‑
c(o)nr
11r12
、-c(o)or
13
、苯基、噻唑基和吡啶基；r
11
为氢原子或c
1-6
烷基；r
12
为氢原子或c
1-6
烷基；r
13
为氢原子或c
1-6
烷基。
[0088]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的r
10
为卤素或卤代c
1-6
烷基，优选为氯原子。
[0089]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的r8选自羟基和磷酸c
1-6
烷氧基，优选为羟基。
[0090]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中y 为约1至约8；优选为约2至约8；更优选为约1至约4；最优选为约2至约4。
[0091]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式
(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述pc为抗体。
[0092]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的抗体选自抗her2(erbb2)抗体、抗egfr抗体、抗b7-h3抗体、抗c-met抗体、抗her3(erbb3)抗体、抗her4(erbb4)抗体、抗cd20抗体、抗cd22抗体、抗cd30抗体、抗cd33抗体、抗cd44抗体、抗cd56抗体、抗cd70抗体、抗 cd73抗体、抗cd105抗体、抗cea抗体、抗a33抗体、抗cripto抗体、抗epha2 抗体、抗g250抗体、抗mucl抗体、抗lewis y抗体、抗vegfr抗体、抗gpnmb 抗体、抗integrin抗体、抗psma抗体、抗tenascin-c抗体、抗trop-2抗体、抗 cd79b抗体、抗slc44a4抗体和抗mesothelin抗体。
[0093]
在另一些实施方案中，如前所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式 (pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中接头单元-l-为-l
a-l
b-l
c-l
d-，
[0094]
la选自自和-c(o)-w-c(o)-，其中w选自c
1-6
亚烷基和c
1-6
亚烷基-c
3-6
环烷基，其中所述的 c
1-6
亚烷基和c
1-6
亚烷基-c
3-6
环烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、氧代基、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、-ch
2-o
‑ꢀ
亚烷基-so3h和c
3-6
环烷基中的一个或多个取代基所取代；所述的rw为
ꢀ‑
o-ch2ch2so3h或-nh-c(o)-(ch2ch2o)p
0-ch3，其中p0为1至20的整数；
[0095]
lb选自-nh(ch2ch2o)p1ch2ch2c(o)-、-nh(ch2ch2o)p1ch2c(o)-、
ꢀ‑
s(ch2)p1c(o)-和化学键，其中p1为1至20的整数；
[0096]
lc为由2至7个氨基酸残基构成的肽残基，其中所述的氨基酸残基选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基，并任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、氯代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基和c
3-6
环烷基中的一个或多个取代基所取代；
[0097]
ld选自-nh-r
a-ch2o-c(o)-、-nh-ch2o-r
b-c(o)-和化学键；
[0098]
ra为苯基或6元至10元杂芳基，所述的苯基或6元至10元杂芳基任选进一步被选自卤素、氧代基、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基和-c
1-6
亚烷基-糖的一个或多个取代基所取代；
[0099]
rb选自c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基和c
3-6
杂环基，所述的c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基或 c
3-6
杂环基任选进一步被选自卤素、氧代基、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、c
3-6
杂环基、卤代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基和c
1-6
烷氧基的一个或多个取代基所取代；
[0100]
其中la的端与抗体端连接，la的*端与接头单元其它部分相连接，ld与药物端连接的。
[0101]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中la选自
[0102][0102]
其中w为-(ch2)
2-或-(ch2)
5-；rw为-o-ch2ch2so3h和
ꢀ‑
nh-c(o)-(ch2ch2o)
13-ch3；优选地，rw为-o-ch2ch2so3h；其中端与抗体相连接，*端与接头单元其它部分相连接。
[0103]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中lb为自-nh(ch2ch2o)p1ch2c(o)-或化学键；其中p1为6至12的整数。
[0104]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中lc为四肽残基或二肽残基；优选自甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸的四肽残基、缬氨酸-丙氨酸的二肽残基和缬氨酸-瓜氨酸的二肽残基。
[0105]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中ld选自如下结构式：
[0106]
其中端与接头单元其它部分相连接，*端与药物相连接。
[0107]
在另一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中接头单元-l-为-l
a-l
b-l
c-l
d-，
[0108]
la选自
[0109][0109]
其中w为-(ch2)
2-或-(ch2)
5-；rw为-o-ch2ch2so3h或
ꢀ‑
nh(co)-(ch2ch2o)
13-ch3；
[0110]
lb为-nh(ch2ch2o)p1ch2c(o)-或化学键；其中p1为6至12的整数；
[0111]
lc为四肽残基或二肽残基；优选自甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸的四肽残基、缬氨酸-丙氨酸的二肽残基和缬氨酸-瓜氨酸的二肽残基；
[0112]
ld选自如下结构式：
[0113][0114]
在一些实施方案中，如前任一项所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式 (pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中接头单元-l-选自：
[0115][0116]
其中端与抗体相连接，*端与药物相连接。
[0117]
在一些实施方案中，如前所述的通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii) 或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物，选自：
[0118]
[0119][0120]
所述的ab为抗体，优选自：
[0121]
抗b7h3抗体，其包含如seq id no:1所示的重链和如seq id no:2所示的轻链，
[0122]
抗trop2抗体，其包含如seq id no:3所示的重链和如seq id no:4所示的轻链，和
[0123]
抗b7h3抗体，其包含如seq id no:5所示的重链和如seq id no:6所示的轻链；
[0124]
y为约1至约8。
[0125]
本披露还提供一种通式(lu-d)所示的化合物或其可药用的盐：
[0126][0127]
其中：
[0128]
l
a’其中w选自c
1-6
亚烷基和c
1-6
亚烷基-c
3-6
环烷基，其中所述的c
1-6
亚烷基和c
1-6
亚烷基-c
3-6
环烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、氧代基、羟基、氰基、氨基、 c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、-ch
2-o-亚烷基-so3h和 c
3-6
环烷基中的一个或多个取代基所取代；所述的rw选自-o-ch2ch2so3h和-nh-c(o)-(ch2ch2o)p
0-ch3，其中p0为1至20的整数；
[0129]
lb选自-nh(ch2ch2o)p1ch2ch2c(o)-、-nh(ch2ch2o)p1ch2c(o)-、
ꢀ‑
s(ch2)p1c(o)-和化学键，其中p1为1至20的整数；
[0130]
lc为由2至7个氨基酸残基构成的肽残基，其中所述的氨基酸残基选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基，并任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、氯代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基和c
3-6
环烷基中的一个或多个取代基所取代；
[0131]
ld选自-nh-r
a-ch2o-c(o)-、-nh-ch2o-r
b-c(o)-和化学键；
[0132]
ra为芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自卤素、氧代基、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基和-c
1-6
亚烷基-糖的一个或多个取代基所取代；
[0133]
rb选自c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基或c
3-6
杂环基，所述的c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基或 c
3-6
杂环基任选进一步被选自卤素、氧代基、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、c
3-6
杂环基、卤代c1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基和c
1-6
烷氧基的一个或多个取代基所取代；
[0134]
r1选自氢原子、卤素、羟烷基、羟基、烷基、烷氧基、氘代烷基、环烷基、杂环基、-c(o)-烷基、芳基和杂芳基；所述的烷基、-c(o)-烷基、环烷基和杂环基各自独立地任选进一步被一个或多个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、烷基、氘代烷基、环烷基、羟基、-c(o)nr
11r12
、-c(o)or
13
、烷氧基、芳基和杂芳基；
[0135]r11
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
[0136]r12
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
[0137]r13
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
[0138]
l1选自亚烷基、亚烷基-o-c(o)-n(r
14
)-亚烷基和亚烷基-n(r
15
)-c(o)-亚烷基；
[0139]r14
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
[0140]r15
选自氢原子、氘原子、烷基或氘代烷基；
[0141]
各个x相同或不同，各自独立地选自碳原子、氧原子、硫原子和氮原子，m 选自0，1，2和3；
[0142]
各个r2相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、氘代烷基和烷基，t1选自1、2、3和4；
[0143]
r3选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，
[0144]
r4选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，
[0145]
各个r5相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t2选自1、2、3、4和5；
[0146]
各个r6相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t3选自1、2、3和4；
[0147]
各个r7相同或不同，选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t4 选自1、2、3和4；
[0148]
r8选自烷基、氨基、羟基和烷氧基；
[0149]
各个r9相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t5选自1、2、3和4；
[0150]
各个r
10
相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t6选自1至2，3，4和5。
[0151]
在一些实施方案中，如前所述的通式(lu-d)所示的化合物或其可药用的盐，其选自如下所示的化合物：
[0152]
[0153][0154]
本披露还提供如前任一项所述的如式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
[0155]
(1)用抗体与还原试剂在缓冲液中反应，得到经还原后的抗体；
[0156]
(2)用通式(lu-d)所示的连接子-药物化合物与步骤(1)中得到的经还原后的抗体在缓冲液与有机溶剂混合液中进行交联(偶联)，得到配体-药物偶联物pc-l-d。
[0157]
本披露还提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的如前任一项所述的通式 (d)、通式(d-i)、通式(d-ii)或通式(d-iii)所示的化合物、或其可药用的盐，或如前任一项所述的配体-药物偶联物或其可药用的盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0158]
本披露还提供如前任一项所述的通式(d)、通式(d-i)、通式(d-ii)或通式(d-iii) 所示的化合物、或其可药用的盐，或如前任一项所述的如通式(pc-l-d)、通式 (pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，或如前所述的药物组合物在制备bcl-2和/或bcl-xl抑制剂中的用途。
[0159]
本披露还提供如前任一项所述的通式(d)、通式(d-i)、通式(d-ii)或通式(d-iii) 所示的化合物、或其可药用的盐，或如前任一项所述的如通式(pc-l-d)、通式 (pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，或如前所述的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
[0160]
本披露还提供如前任一项所述的通式(d)、通式(d-i)、通式(d-ii)或通式(d-iii) 所示化合物或其可药用的盐，或如前任一项所述的如通式(pc-l-d)、通式 (pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，或如前所述的药物组合物，在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途，其中所述癌症黑色素瘤、肝癌、肾癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞
淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌、子宫颈癌、甲状腺癌、淋巴瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、脑瘤、骨髓瘤、星形细胞瘤和胶质瘤。
[0161]
本披露的另一方面，进一步涉及一种用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括向需要其的受试者施用治疗有效剂量的本披露如前任一项所述的通式(d)、通式 (d-i)、通式(d-ii)或通式(d-iii)所示化合物或其可药用的盐，如前任一项所述的如通式(pc-l-d)、通式(pc-l-d-i)、通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的配体
‑ꢀ
药物偶联物或化合物或其可药用的盐，或如前所述的包含其的药物组合物；其中所述癌症黑色素瘤、肝癌、肾癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌、子宫颈癌、甲状腺癌、淋巴瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、脑瘤、骨髓瘤、星形细胞瘤和胶质瘤。
[0162]
可将活性化合物(包括化合物或配体药物偶联物)制成适合于通过任何适当途径给药的形式，通过常规方法使用一种或多种药学上可接受的载体来配制本公开的组合物。因此，本公开的活性化合物可以配制成用于口服给药、注射(例如静脉内、肌肉内或皮下)给药，吸入或吹入给药的各种剂型。本公开的化合物也可以配制成持续释放剂型，例如片剂、硬或软胶囊、水性或油性混悬液、乳剂、注射液、可分散性粉末或颗粒、栓剂、锭剂或糖浆。
[0163]
作为一般性指导，活性化合物优选是以单位剂量的方式，或者是以患者可以以单剂自我给药的方式。本公开化合物或组合物的单位剂量的表达方式可以是片剂、胶囊、扁囊剂、瓶装药水、药粉、颗粒剂、锭剂、栓剂、再生药粉或液体制剂。合适的单位剂量可以是0.1～1000mg。
[0164]
本披露的药物组合物除活性化合物外，可含有一种或多种辅料，所述辅料选自以下成分：填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或赋形剂等。根据给药方法的不同，组合物可含有0.1至99重量％的活性化合物。
[0165]
含活性成分的药物组合物可以是适用于口服的形式，例如片剂、糖锭剂、锭剂、水或油混悬液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊，或糖浆剂或酏剂。可按照本领域任何已知制备药用组合物的方法制备口服组合物，此类组合物可含有粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或药学上可接受的润湿剂等，此类组合物还可以含有一种或多种选自以下的成分：甜味剂、矫味剂、着色剂和防腐剂，以提供悦目和可口的药用制剂。
[0166]
水悬浮液含有活性物质和用于混合的适宜制备水悬浮液的赋形剂。水混悬液也可以含有一种或多种防腐剂例、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂和一种或多种甜味剂。
[0167]
油混悬液可通过使活性成分悬浮于植物油中配制而成。油悬浮液可含有增稠剂。可加入上述的甜味剂和矫味剂，以提供可口的制剂。
[0168]
药物组合物还可以是用于制备水混悬液的可分散粉末和颗粒提供活性成分，通过加入水混合分散剂、湿润剂、悬浮剂或防腐剂中的一种或多种。也可加入其他赋形剂例如甜味剂、矫味剂和着色剂。通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸保存这些组合物。
[0169]
本披露的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。
[0170]
药物组合物可以是无菌注射水溶液形式。可以使用的可接受的溶媒或溶剂有水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。无菌注射制剂可以是其中活性成分溶于油相的无菌注射水包
油微乳。例如将活性成分溶于大豆油和卵磷脂的混合物中。然后将油溶液加入水和甘油的混合物中处理形成微乳。可通过局部大量注射，将注射液或微乳注入受试者的血流中。或者，最好按可保持本披露化合物恒定循环浓度的方式给予溶液和微乳。为保持这种恒定浓度，可使用连续静脉内递药装置。这种装置的实例是deltec cadd-plus.tm.5400型静脉注射泵。
[0171]
药物组合物可以是用于肌内和皮下给药的无菌注射水或油混悬液的形式。可按已知技术，用上述那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制该混悬液。无菌注射制剂也可以是在肠胃外可接受的无毒稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或混悬液。此外，可方便地用无菌固定油作为溶剂或悬浮介质。
[0172]
可按用于直肠给药的栓剂形式给予本披露化合物。可通过将药物与在普通温度下为固体但在直肠中为液体，因而在直肠中会溶化而释放药物的适宜的无刺激性赋形剂混合来制备这些药物组合物。此类物质包括可可脂、甘油明胶、氢化植物油、各种分子量的聚乙二醇和聚乙二醇的脂肪酸酯的混合物。
[0173]
如本领域技术人员所熟知的，药物的给药剂量依赖于多种因素，包括但并非限定于以下因素：所用具体化合物的活性、受试者的年龄、受试者的体重、受试者的健康状况、受试者的行为、受试者的饮食、给药时间、给药方式、排泄的速率、药物的组合、疾病的严重性等；另外，最佳的治疗方式如治疗的模式、化合物的日用量或可药用的盐的种类可以根据传统的治疗方案来验证。
[0174]
本披露涉及靶向不同癌细胞、传染病生物体的能力改进和/或用于治疗自身免 疫性疾病的偶联物，该偶联物包含靶向(结合)部分和属于药物的治疗部分。抗体 靶向部分与化合物治疗部分经由增加治疗效力的胞内可裂解的键连接。
[0175]
发明的详细说明
[0176]
除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语均与本披露所属领域普通技术人员的通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本披露，但本文描述了优选的方法和材料。描述和要求保护本披露时，依据以下定义使用下列术语。
[0177]
当本披露中使用商品名时，旨在包括该商品名产品的制剂、该商品名产品的非专利药和活性药物部分。
[0178]
术语“配体”是能识别和结合目标细胞相关的抗原或受体的大分子化合物。配体的作用是将药物呈递给与配体结合的目标细胞群，这些配体包括但不限于蛋白类激素、凝集素、生长因子、抗体或其他能与细胞结合的分子。在本披露实施方式中，配体表示为pc，可通过配体上的杂原子与连接单元形成连接键，配体优选为抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或鼠源抗体；优选为单克隆抗体。
[0179]
本披露所述的“抗体”在本文中以最广意义使用，并且包括不同的抗体结构，包括，但不限于，单克隆抗体，多克隆抗体，鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗原结合片段，只要它们显示所需的抗原结合活性和特异性即可。
[0180]
术语“鼠源抗体”在本披露中为根据本领域知识和技能用鼠制备抗体。制备时用特定抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
[0181]
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒
定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。
[0182]
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为cdr移植抗体 (cdr-grafted antibody)，是指将鼠的cdr序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共dna数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系 dna序列可以在“vbase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在kabat，e.a.等人，1991 sequencesof proteins of immunological interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本披露的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对cdr进行亲和力成熟后的人源化抗体。进一步描述参与人源化可使用小鼠抗体的方法的文献包括，例如queen等，proc.，natl.acad.sci.usa，88，2869，1991和winter及其同事的方法[jones等，nature，321，522(1986)，riechmann，等，nature，332， 323-327(1988)，verhoeyen，等，science，239，1534(1988)]。
[0183]
术语“全人源抗体”、“全人抗体”或“完全人源抗体”，也称“全人源单克隆抗体”，其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。本披露为全人源单克隆抗体。全人抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、ebv转化b淋巴细胞技术、噬菌体显示技术(phage display)、转基因小鼠抗体制备技术(transgenic mouse)和单个b细胞抗体制备技术等。
[0184]
术语“抗原结合片段”是指抗体的保持特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的二价片段，(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体的单臂的 vh和vl结构域组成的fv片段；(v)单结构域或dab片段(ward等人,(1989)nature341：544-546)，其由vh结构域组成；和(vi)分离的互补决定区 (cdr)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的cdr的组合。此外，虽然fv片段的两个结构域vl和vh由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中vl和vh区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链fv(scfv)；参见，例如，bird等人 (1988)science242:423-426；和huston等人(1988)proc.natl.acad.sciusa85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组dna技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如， igg(例如，igg1，igg2，igg3或igg4亚型)，iga1，iga2，igd，ige或igm抗体。
[0185]
通常，fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割h链的224位的氨基酸残基)处理 igg
抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中h链n端侧的约一半和整个l链通过二硫键结合在一起。
[0186]
通常，f(ab')2是通过用酶胃蛋白酶消化igg铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个fab 区的抗体片段。
[0187]
通常，fab'是通过切割上述f(ab')2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约 50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。
[0188]
此外，可以通过将编码fab'片段的dna插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达fab'来生产所述fab'。
[0189]
术语“单链抗体”、“单链fv”或“scfv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或vh)和抗体轻链可变结构域(或vl)的分子。此类scfv分子可具有一般结构：nh
2-vl-接头-vh-cooh或nh
2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的ggggs氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(holliger等人(1993)，proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448)。可用于本披露的其他接头由alfthan等人(1995)，protein eng.8:725-731，choi等人(2001)， eur.j.immuno l.31:94-106，hu等人(1996)，cancer res.56:3055-3061，kipriyanov等人(1999)，j.mol.biol.293:41-56和roovers等人(2001)，cancer immunol.描述。
[0190]
术语“cdr”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个cdr的最常用的定义之一由kabat e.a.等人，(1991)sequences ofproteins of immunological interest.nih publication91-3242)提供。
[0191]
术语“抗体框架”，是指可变结构域vl或vh的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(cdr)的支架。从本质上讲，其是不具有cdr的可变结构域。
[0192]
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗体结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13， 14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，epitope mapping protocols inmethods in molecular b iology，第66卷，g.e.morris，ed.(1996)。
[0193]
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-7
m，例如大约小于10-8
m、10-9
m或10-10
m或更小的亲和力(kd)结合。
[0194]
术语“核酸分子”是指dna分子和rna分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链dna。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
[0195]
本披露所用氨基酸三字母代码和单字母代码如j.biol.chem，243，p3558(1968) 中所述。
[0196]
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和r基
团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的r基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用的化学化合物。
[0197]
术语“肽”是指介于氨基酸和蛋白质之间的化合物片段，由2个或2个以上氨基酸分子通过肽键相互连接而成，是蛋白质的结构与功能片段。
[0198]
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。本披露所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的cdr区加上一个或多个人源 fr区。人fr种系序列可以通过比对imgt人类抗体可变区种系基因数据库和 moe软件，从lefranc，g.，the immunoglobulin factsbook，academic press 得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001isbn012441351上获得。
[0199]
本披露工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cdna序列，可以克隆并重组至表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染宿主细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在fc区的n端位点。阳性的克隆在生物反应器的培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用a或g sepharose ff柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用ph梯度法洗脱结合的抗体，用sds-page检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即，如-70℃，或者冻干。
[0200]
术语“配体-药物偶联物”，指配体通过连接单元与具有生物活性的药物相连。在本披露中“配体-药物偶联物”优选为抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate， adc)，指把单克隆抗体或者抗体片段通过连接单元与具有生物活性的毒性药物相连。
[0201]
本披露所描述的抗体或抗体片段可以通过任何方式偶联至效应分子。举例来说，抗体或抗体片段可以通过化学或重组方式附接至细胞毒性药物。制备融合物或偶联物的化学方式在本领域中是已知的并且可以用于制备免疫偶联物。用于偶联抗体或抗体片段和药物的方法必须能够连接抗体与细胞毒性药物而不会干扰抗体或抗体片段结合至标靶分子的能力。
[0202]
术语“药物”是指细胞毒性药物或免疫调节剂。细胞毒性药物能在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。本披露的一此实施方案中，药物表示为d，可以是bcl2抑制剂、bcl-xl抑制剂或bcl2/bcl-xl双靶抑制剂。
[0203]
术语“接头单元”或“连接片段”或“连接单元”是指一端与抗体或其抗原结合片段连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。
[0204]
术语接头可以包含一种或多种接头构件。示例性的接头构件包括6-马来酰亚氨基己酰基(“mc”)、马来酰亚氨基丙酰基(“mp”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“pab”)、及那样源自与接头试剂的偶联的：n-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“spp”)、n
‑ꢀ
琥珀酰亚氨基4-(n-马来酰亚氨基甲基)环
己烷-1羧酸酯(“smcc”，在本文中也称作“mcc”)和n-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“siab”)。接头可以包括延伸物、间隔物和氨基酸单元，可以通过本领域已知方法合成，诸如 us2005-0238649a1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(chari等，cancer research 52: 127-131(1992)；美国专利no.5，208，020)。
[0205]
接头组件包括但不限于：
[0206]
mc＝6-马来酰亚氨基己酰基，结构如下：
[0207][0208]
val-cit或“vc”＝缬氨酸-瓜氨酸(蛋白酶可切割接头中的示例二肽)，
[0209]
瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸，
[0210]
pab基团为对氨基苄氧羰基(“自我牺牲”接头组件的示例)，其结构如下：
[0211][0212]
me-val-cit＝n-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(其中接头肽键已经修饰以防止其受到组织蛋白酶b的切割)，
[0213]
mc(peg)6-oh＝马来酰亚氨基己酰基-聚乙二醇(可附着于抗体半胱氨酸)，
[0214]
spp＝n-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯，
[0215]
spdp＝n-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯，
[0216]
smcc＝琥珀酰亚氨基-4-(n-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，
[0217]
it＝亚氨基硫烷。
[0218]
术语“糖”包括单醣及双醣类之o-糖苷、n-糖苷、s-糖苷及c-糖苷(c-糖基) 碳水化合物衍生物，且可来源于天然存在之来源或可来源于合成。示例性地，「糖」包括衍生物，诸如(但不限于)自葡糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖及葡萄糖及其他衍生之彼等衍生物。合适的糖取代包括(但不限于)羟基、胺、羧酸、磺酸、膦酸、酯及醚。
[0219]
在一个实施方案中，抗体和细胞毒性药物都是蛋白质并且可以使用本领域中熟知的技术偶联。存在本领域中所公开的数百种交联剂，其可以偶联两种蛋白质。交联剂一般基于在抗体或细胞毒性药物上可用或插入的反应官能团来选择。另外，如果不存在反应基团，那么可以使用光可活化交联剂。在某些情况下，可能需要在抗体与细胞毒性药物之间包括间隔子。本领域中已知的交联剂包括同型双功能剂：戊二醛、二甲基己二亚酰胺化物和双(重氮基联苯胺)，以及异型双功能剂：间马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺和磺基-间马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺。
[0220]
可以用于使效应分子偶合至抗体片段的交联剂包括例如tpch(s-(2-硫代吡啶基)-l-半胱氨酸酰肼)和tpmph(s-(2-硫代吡啶基)巯基-丙酰肼)。tpch和tpmph 在先前已经通过温和高碘酸盐处理而氧化的糖蛋白的碳水化合物部分反应，由此在交联剂的酰肼部
分与高碘酸盐产生的醛之间形成腙键。异型双功能交联剂 gmbs(n-(γ-马来酰亚胺基丁酰氧基)-琥珀酰亚胺)和smcc(琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基-甲基)环己烷)与伯胺反应，由此将马来酰亚胺基引入组分上。这个马来酰亚胺基随后可以与另一种组分上的可以由交联剂引入的硫氢基反应，由此在组分之间形成稳定的硫醚键。如果组分之间的位阻干扰任一种组分的活性，那么可以使用交联剂，将长的间隔臂引入组分之间，诸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸n
‑ꢀ
琥珀酰亚胺酯(spdp)。因此，存在许多适合的交联剂，其可以被使用并且各自取决于其对最佳免疫偶联物产量的影响来选择。
[0221]
载药量，也称药物抗体比例(drug-to-antibody ratio，dar)，即adc中每个抗体所偶联的药物的平均数量。其可在例如每个抗体偶联约1至约10个药物的范围内，并且在某些实施例中，在每个抗体偶联约1至约8个药物的范围内，优选自2-8，2-7，2-6，2-5，2-4，3-4，3-5，5-6，5-7，5-8和6-8的范围。示例性的，载药量可以为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10的均值。本披露的adc通式包括前述一定范围内的抗体药物偶联物的集合。在本披露的实施方式中，载药量可表示为y，是小数或整数。可用常规方法如uv/可见光光谱法，质谱，elisa试验和 rp-hplc测定载药量。
[0222]
本披露的一个实施方式中，细胞毒性药物通过连接单元偶联在抗体的巯基上。
[0223]
可以用以下非限制性方法控制配体细胞毒性药物偶联物的载量，包括：
[0224]
(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，
[0225]
(2)控制反应时间和温度，
[0226]
(3)选择不同的反应试剂。
[0227]
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个) 碳原子的烷基，更优选为含有1至6个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、 2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、 2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4
‑ꢀ
乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、 2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、 3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自d原子、卤素、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的一个或多个取代基。
[0228]
术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其为从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11和12个)碳原子，更优选含有1至6个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括但不限于亚甲基(-ch
2-)、1,1-亚乙基(-ch(ch3)-)、1,2-亚乙基(-ch2ch2)-、 1,1-亚丙基(-ch(ch2ch3)-)、1,2-亚丙基(-ch2ch(ch3)-)、1,3-亚丙基(-ch2ch2ch
2-)、 1,4-亚丁基(-ch2ch2ch2ch
2-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自烯基、炔基、烷氧基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基。
[0229]
术语“烯基”指分子中含有碳碳双键的烷基化合物，其中烷基的定义如上所述。烯基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基。
[0230]
术语“炔基”指分子中含有碳碳三键的烷基化合物，其中烷基的定义如上所述。炔基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基中的一个或多个取代基。
[0231]
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，优选包含3至8个(例如3、4、 5、6、7和8个)碳原子，更优选包含3至6个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。
[0232]
术语“螺环烷基”指5至20元，单环之间共用一个碳原子(称螺原子)的多环基团，其可以含有一个或多个双键。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如 7、8、9或10元)。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环烷基分为单螺环烷基、双螺环烷基或多螺环烷基，优选为单螺环烷基和双螺环烷基。更优选为3元/5元、 3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺环烷基。螺环烷基的非限制性实例包括：
[0233][0234]
术语“稠环烷基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对碳原子的全碳多环基团，其中一个或多个环可以含有一个或多个双键。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如7、8、9或10元)。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠环烷基，优选为双环或三环，更优选为3 元/4元、3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/4元、5元/5 元、5元/6元、6元/3元、6元/4元、6元/5元和6元/6元的双环烷基。稠环烷基的非限制性实例包括：
[0235][0236]
术语“桥环烷基”指5至20元，任意两个环共用两个不直接连接的碳原子的全碳多环基团，其可以含有一个或多个双键。优选为6至14元，更优选为7至10 元(例如7、8、9或10元)。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥环烷基，优选为双环、三环或四环，更优选为双环或三环。桥环烷基的非限制性实例包括：
[0237][0238]
所述环烷基环包括如上所述的环烷基(包括单环、螺环、稠环和桥环)稠合于芳基、杂芳基或杂环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基等；优选茚满基和四氢萘基。
[0239]
环烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的一个或多个取代基。
[0240]
术语“烷氧基”指-o-(烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自d原子、卤素、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
[0241]
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状取代基，其包含3至20 个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧、硫、s(o)或s(o)2的杂原子，但不包括-o-o-、-o-s-或-s-s-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11和12个)环原子，其中1～4个(例如1、2、3 和4个)是杂原子；更优选包含3至8个环原子(例如3、4、5、6、7和8个)，其中1-3个(例如1、2和3个)是杂原子；更优选包含3至6个环原子，其中1-3 个是杂原子；最优选包含5或6个环原子，其中1-3个是杂原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、四氢吡喃基、1,2,3,6-四氢吡啶基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
[0242]
术语“螺杂环基”指5至20元，单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环基团，其中一个或多个环原子为选自氮、氧、硫、s(o)或s(o)2的杂原子，其余环原子为碳。其可以含有一个或多个双键。优选为6至14元，更优选为7至10 元(例如7、8、9或10元)。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元
或5元/6元单螺杂环基。螺杂环基的非限制性实例包括：
[0243][0244]
术语“稠杂环基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，其中一个或多个环原子为选自氮、氧、硫、s(o)或s(o)2的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元(例如7、8、9或10元)。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为双环或三环，更优选为3元/4 元、3元/5元、3元/6元、4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/4元、5元/5元、 5元/6元、6元/3元、6元/4元、6元/5元和6元/6元双环稠杂环基。稠杂环基的非限制性实例包括：
[0245][0246]
术语“桥杂环基”指5至14元，任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环基团，其可以含有一个或多个双键，其中一个或多个环原子为选自氮、氧、硫、s(o)或s(o)2的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至 10元(例如7、8、9或10元)。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，优选为双环、三环或四环，更优选为双环或三环。桥杂环基的非限制性实例包括：
[0247][0248]
所述杂环基环包括如上所述的杂环基(包括单环、螺杂环、稠杂环和桥杂环) 稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，其非限制性实例包括：
[0249]
等。
[0250]
杂环基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接
点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的一个或多个取代基。
[0251]
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(稠合多环是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基。所述芳基环包括如上所述的芳基环稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，其非限制性实例包括：
[0252][0253]
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的一个或多个取代基。
[0254]
术语“杂芳基”指包含1至4个(例如1、2、3和4个)杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至10元(例如5、 6、7、8、9或10元)，更优选为5元或6元，例如噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、n-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基等。所述杂芳基环包括如上述的杂芳基稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，其非限制性实例包括：
[0255]
[0256][0257]
杂芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、环烷基氧基、杂环基氧基、羟基、羟烷基、氰基、氨基、硝基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基中的一个或多个取代基。
[0258]
上述环烷基、杂环基、芳基和杂芳基包括从母体环原子上除去一个氢原子所衍生的残基，或从母体的相同或两个不同的环原子上除去两个氢原子所衍生的残基，即“二价环烷基”、“二价杂环基”、“亚芳基”、“亚杂芳基”。
[0259]
术语“氨基保护基”是为了使分子其它部位进行反应时氨基保持不变，用易于脱去的基团对氨基进行保护。非限制性实施例包含(三甲基硅)乙氧基甲基、四氢吡喃基、叔丁氧羰基、乙酰基、苄基、烯丙基和对甲氧苄基等。这些基团可任选地被选自卤素、烷氧基或硝基中的1-3个取代基所取代。
[0260]
术语“羟基保护基”是本领域已知的适当的用于羟基保护的基团，参见文献 (“protective groups in organic synthesis”，5
th ed.t.w.greene&p.g.m.wuts)中的羟基保护基团。作为示例，优选地，所述的羟基保护基可以是(c
1-10
烷基或芳基)3硅烷基，例如：三乙基硅基，三异丙基硅基，叔丁基二甲基硅基，叔丁基二苯基硅基等；可以是c
1-10
烷基或取代烷基，优选烷氧基或芳基取代的烷基，更优选c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基或苯基取代的c
1-6
烷基，最优选c
1-4
烷氧基取代的c
1-4
烷基，例如：甲基，叔丁基，烯丙基，苄基，甲氧基甲基(mom)，乙氧基乙基，2-四氢吡喃基(thp)等；可以是(c
1-10
烷基或芳香基)酰基，例如：甲酰基，乙酰基，苯甲酰基、对硝基苯甲酰基等；可以是(c
1-6
烷基或c
6-10
芳基)磺酰基；也可以是(c
1-6
烷氧基或c
6-10
芳基氧基)羰基。
[0261]
术语“环烷基氧基”指环烷基-o-，其中环烷基如上所定义。
[0262]
术语“杂环基氧基”指杂环基-o-，其中杂环基如上所定义。
[0263]
术语“芳基氧基”指芳基-o-，其中芳基如上所定义。
[0264]
术语“杂芳基氧基”指杂芳基-o-，其中杂芳基如上所定义。
[0265]
术语“烷硫基”指烷基-s-，其中烷基如上所定义。
[0266]
术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。
[0267]
术语“卤代烷氧基”指烷氧基被一个或多个卤素取代，其中烷氧基如上所定义。
[0268]
术语“氘代烷基”指烷基被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。
[0269]
术语“羟烷基”指烷基被一个或多个羟基取代，其中烷基如上所定义。
[0270]
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
[0271]
术语“羟基”指-oh。
[0272]
术语“巯基”指-sh。
[0273]
术语“氨基”指-nh2。
[0274]
术语“氰基”指-cn。
[0275]
术语“硝基”指-no2。
[0276]
术语“氧代基”或“氧代”指“＝o”。
[0277]
术语“羰基”指c＝o。
[0278]
术语“羧基”指-c(o)oh。
[0279]
化学式中简称“me”为甲基。
[0280]
化学式中简称“ph”为苯基。
[0281]
术语“羧酸酯基”指-c(o)o(烷基)、-c(o)o(环烷基)、(烷基)c(o)o-或(环烷基)c(o)o-，其中烷基和环烷基如上所定义。
[0282]
本公开的化合物包含其同位素衍生物。术语“同位素衍生物”指结构不同仅在于存在一种或多种同位素富集原子的化合物。例如，具有本公开的结构，用“氘”或“氚”代替氢，或者用
18
f-氟标记(
18
f同位素)代替氟，或者用
11
c-，
13
c-，或者
14
c-富集的碳(
11
c-，
13
c-，或者
14
c-碳标记；
11
c-，
13
c-，或者
14
c-同位素)代替碳原子的化合物处于本公开的范围内。这样的化合物可用作例如生物学测定中的分析工具或探针，或者可以用作疾病的体内诊断成像示踪剂，或者作为药效学、药动学或受体研究的示踪剂。本公开的各种氘化形式的化合物是指与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的化合物。在制备氘代形式的化合物时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂包括但不限于氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。氘代物通常可以保留与未氘代的化合物相当的活性，并且当氘代在某些特定位点时可以取得更好的代谢稳定性，从而获得某些治疗优势。
[0283]“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
[0284]“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为1～5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下(通过实验或理论)确定可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
[0285]“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
[0286]“可药用盐”是指本公开化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。可以在化合物的最终分离和纯化过程中，或通过使合适的基团与合适的碱或酸反应来单独制备盐。通常用于形成药学上可接受的盐的碱包括无机碱，例如氢氧化钠和氢氧化钾，以及有机碱，例如氨。通常用于形成药学上可接受的盐的酸包括无机酸以及有机酸。
[0287]
针对药物或药理学活性剂而言，术语“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
[0288]
本文所用的术语“药学上可接受的”是指这些化合物、材料、组合物和/或剂型，在合理的医学判断范围内，适用于与患者组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，具有合理的获益/风险比，并且对预期的用途是有效。
[0289]
本文所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，反之亦然，除非上下文另外明确指出。
[0290]
当将术语“约”应用于诸如ph、浓度、温度等的参数时，表明该参数可以变化
±
10％，并且有时更优选地在
±
5％之内。如本领域技术人员将理解的，当参数不是关键的时，通常仅出于说明目的给出数字，而不是限制。
具体实施方式
[0291][0292]
以下结合实施例进一步描述本披露，但这些实施例并非限制本披露的范围。
[0293]
本披露实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
[0294]
一、抗体制备实施例
[0295]
以下抗体按抗体常规方法进行制备：如可进行载体构建后，转染真核细胞如 hek293细胞(life technologies cat.no.11625019)，纯化表达。
[0296]
以下为抗b7h3抗体1f9ds的序列：
[0297]
重链
[0298]
qvqlvqsgggvvqpgtslrlscaasgfifsssamhwvrqapgkglewvavisy dgsnkyyvdsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycarsarlyasf dywgqgalvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvsw nsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdk kvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsh edpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkey kckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfyp sdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvm healhnhytqkslslspgk
[0299]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:1
[0300]
轻链
[0301]
dtvvtqepsfsvspggtvtltcglssgsvstshypswyqqtpgqaprmliyntn trssgvpdrfsgsilgnkaaltitgaqaddesdyycaihvdrdiwvfgggtklt vlgqpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkag vettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptec
[0302]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:2
[0303]
以下为抗trop-2抗体pd3的序列：
[0304]
重链
[0305]
evqlvqsgselkkpgasvkvsckasgytftnygmnwvkqapgqglkwmgwi ntytgeptytqdfkgrfafsldtsvstaylqisslkaedtavyycarggfgssy wyfdvwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsgg
taalgclvkdyfpepvt vswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntk vdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvd vshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlng keykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkg fypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfsc svmhealhnhytqkslslspgk
[0306]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:3
[0307]
轻链
[0308]
diqltqspsslsasvgdrvsitckasqdvsiavawyqqkpgkapklliysasyry tgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedfavyycqqhyitpltfgagtkveikrtva apsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvte qdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0309]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:4
[0310]
以下为抗b7h3抗体mirzotamab的序列：
[0311]
重链
[0312]
evqlqesgpglvkpsetlsltcavtgysitsgyswhwirqfpgnglewmgyihs sgstnynpslksrisisrdtsknqfflklssvtaadtavyycagyddyfeywgq gttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgalt sgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepks cdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevk fnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsn kalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiave wesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealh nhytqkslslspgk
[0313]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:5
[0314]
轻链
[0315]
diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqnvgfnvawyqqkpgkspkaliysasyr ysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfaeyfcqqynwypftfgqgtkleikrtv aapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvt eqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
[0316]
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
seq id no:6
[0317]
二、化合物制备实施例
[0318]
化合物的结构是通过核磁共振(nmr)或/和质谱(ms)来确定的。nmr位移(δ) 以10-6
(ppm)的单位给出。nmr的测定是用bruker avance neo 500m核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(dmso-d6)、氘代氯仿(cdcl3)、氘代甲醇(cd3od)，内标为四甲基硅烷(tms)。
[0319]
ms的测定用agilent 1200/1290dad-6110/6120quadrupole ms液质联用仪 (生产商：agilent，ms型号：6110/6120quadrupole ms)、waters acquityuplc-qd/sqd(生产商：waters，ms型号：waters acquity qda detector/waters sqdetector)、thermo ultimate 3000-q exactive(生产商：thermo，ms型号： thermo q exactive)。
[0320]
高效液相色谱法(hplc)分析使用agilent hplc 1200dad、agilent hplc 1200vwd和waters hplc e2695-2489高压液相色谱仪。
[0321]
手性hplc分析测定使用agilent 1260dad高效液相色谱仪。
[0322]
高效液相制备使用waters 2545-2767、waters 2767-sq detecor2、shimadzulc-20ap和gilson gx-281制备型色谱仪。
[0323]
手性制备使用shimadzu lc-20ap制备型色谱仪。
[0324]
combiflash快速制备仪使用combiflash rf200(teledyne isco)。
[0325]
薄层层析硅胶板使用烟台黄海hsgf254或青岛gf254硅胶板，薄层色谱法 (tlc)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
[0326]
硅胶柱色谱法一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
[0327]
激酶平均抑制率及ic
50
值的测定用novostar酶标仪(德国bmg公司)。
[0328]
本披露的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自abcr gmbh&co.kg，acros organics，aldrich chemical company，韶远化学科技(accela chembio inc)、达瑞化学品等公司。
[0329]
实施例中无特殊说明，反应均能够在氩气氛或氮气氛下进行。
[0330]
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1l容积的氩气或氮气气球。
[0331]
氢气氛是指反应瓶连接一个约1l容积的氢气气球。
[0332]
加压氢化反应使用parr 3916ekx型氢化仪和清蓝ql-500型氢气发生器或 hc2-ss型氢化仪。
[0333]
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
[0334]
微波反应使用cem discover-s 908860型微波反应器。
[0335]
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
[0336]
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
[0337]
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(tlc)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：a：二氯甲烷/甲醇体系，b：正己烷/乙酸乙酯体系，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
[0338]
实施例2-1 1
[0339]
n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-氨基乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)-4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰胺1
[0340]
[0341][0342]
第一步
[0343]
(s)-2-(2-(((苄氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯1b
[0344]
将2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸甲酯(2.49g，7.53 mmol，韶远)溶解于四氢呋喃(20ml)中，冰浴冷却至0℃，滴加n,n-二异丙基氨基锂(661mg，6.17mmol)，0℃下搅拌反应1小时后，将反应体系降至-78℃，向其中滴加(s)-2-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯1a(1.00g，5.02mmol，药石)的20ml 四氢呋喃溶液，滴完后撤去干冰丙酮浴，升至室温反应12小时。加饱和氯化铵(20 ml)淬灭，乙酸乙酯(20ml
×
3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系b纯化所得残余物得到标题产物1b(1.90g, 产率：94.1％)。
[0345]
ms m/z(esi):305.0[m+h-100]。
[0346]
第二步
[0347]
(2s)-2-(2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯1c
[0348]
将1b(1.90g，4.7mmol)溶于异丙醇(50ml)中，加入钯碳(380mg，含量10％，干型)，
氢气置换3次，室温搅拌8小时。反应液用硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯 (20ml)和甲醇(20ml)淋洗，滤液浓缩，得到粗品标题产物1c(1.28g)，产品不经纯化直接进行下一步。
[0349]
第三步
[0350]
(s)-2-((s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)吡咯烷
ꢀ‑
1-羧酸叔丁酯1d
[0351]
(s)-2-((r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)吡咯烷-1
‑ꢀ
羧酸叔丁酯1e
[0352]
将粗品1c(1.28g，4.7mmol)溶于1,4-二氧六环(40ml)中，加入水(10ml)，碳酸氢钠(1.17g，14.1mmol)和芴甲氧羰酰氯(1.21g，4.7mmol)，室温下搅拌3小时。加水(30ml)淬灭，乙酸乙酯萃取(20ml
×
3)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系a纯化，得到标题产物1d(1.03g，44.2％， peak1)和1e(513mg，22.1％，peak2)。
[0353]
ms m/z(esi):495.2[m+1]。
[0354]
peak 1：uplc分析：保留时间2.77分钟(色谱柱：:acquity uplc behc18 50*2.1mm,1.7um；流动相：乙腈/水/甲酸＝10/90/0.1(v/v/v)至95/5/0.1(v/v/v)梯度淋洗)。
[0355]
peak 2：uplc分析：保留时间2.69分钟(色谱柱：:acquity uplc behc18 50*2.1mm,1.7um；流动相：乙腈/水/甲酸＝50/50/0.1(v/v/v)至95/5/0.1(v/v/v)梯度淋洗)。
[0356]
第四步
[0357]
(s)-2-((r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-羟基丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯 1f
[0358]
将1e(169mg，0.34mmol)溶于四氢呋喃(8ml)中，加入乙醇(8ml)，硼氢化钠(77mg，2.05mmol)和氯化锂(94mg，2.22mmol)，28℃下搅拌2.5小时，滴加饱和氯化铵(5ml)淬灭反应。旋干溶剂，残余物用乙酸乙酯(10ml)溶解，用水(10ml) 洗，饱和氯化钠(10ml)洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系a纯化，得到标题产物1f(125mg，78.4％)。
[0359]
ms m/z(esi):467.2[m+1]。
[0360]
第五步 (s)-2-((r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯1g
[0361]
将1f(120mg，0.26mmol)溶于甲苯(5ml)中，加入二苯基二硫醚(168mg，0.77 mmol)和三丁基膦(156mg，0.77mmol)，将反应体系用氮气保护后升温至80℃搅拌12小时。旋干溶剂，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系a纯化，得到标题产物1g(135mg，93.9％)。
[0362]
ms m/z(esi):559.2[m+1]。
[0363]
第六步
[0364]
(s)-2-((r)-2-氨基-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯1h
[0365]
将1g(135mg，0.24mmol)溶于二氯甲烷(4ml)中，加入二乙胺(4ml)，室温下搅拌4小时，反应液减压浓缩除去有机溶剂，得到标题产物1h(81.6mg)，产品不经纯化直接进行下一步。
[0366]
第七步
[0367]
(s)-2-((r)-4-(苯基硫杂)-3-((4-氨基磺酰基-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨
基)丁基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯1j
[0368]
将粗品1h(81.6mg，0.24mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(5ml)中，加入4-氟
ꢀ‑
3-(三氟甲基磺酰基)苯磺酰胺1i(82mg，0.27mmol，毕得)和n,n-二异丙基乙胺(314 mg，2.4mmol)，反应体系用氮气保护后升温至50℃搅拌12小时。加水(10ml)淬灭，用乙酸乙酯(5ml
×
3)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系a纯化，得到标题产物1j(105mg， 69.3％)。
[0369]
ms m/z(esi):622.1[m-1]。
[0370]
第八步
[0371]
(s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基) 苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷
ꢀ‑
1-羧酸叔丁酯1l
[0372]
将1j(30mg，0.048mmol)溶于二氯甲烷(3ml)，加入1k(24mg，0.058mmol，参照专利“cn103153954b”中说明书第79页的中间体40提供的方法合成)，再依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(19mg，0.096mmol)和4-二甲氨基吡啶(12mg，0.096mmol)，加完后氮气保护，室温搅拌4小时，补加1k(12 mg，0.038mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(19mg，0.096mmol) 和4-二甲氨基吡啶(12mg，0.096mmol)，加完后室温搅拌过夜。反应液用水(5ml) 洗，饱和食盐水(5ml)洗，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩，所得残余物用薄层色谱法以展开剂体系a纯化，得到标题产物1l(30mg，产率：60.7％)。
[0373]
ms m/z(esi):1027.2[m+1]。
[0374]
第九步
[0375]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-(苯基硫杂)-3-((s)-吡咯烷-2-基)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺 9a
[0376]
将1l(30mg，0.029mmol)溶于二氯甲烷(2ml)中，加入4m氯化氢的1,4-二氧六环溶液(2ml)，室温搅拌20分钟，反应液减压浓缩除去有机溶剂。残余物溶于二氯甲烷，然后减压浓缩干，重复三次，所得残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相:碳酸氢铵、水、乙腈)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物9a(25mg，产率：92.3％)。
[0377]
ms m/z(esi):927.1[m+1]。
[0378]1h nmr(500mhz,cd3od)δ8.24(d,1h),8.05-8.01(m,1h),7.82(d,2h),7.60 (d,1h),7.45-7.39(m,3h),7.37(d,2h),7.34-7.28(m,3h),7.23(t,2h),7.20-7.14(m, 2h),6.80(d,2h),6.72(d,1h),4.42(d,1h),3.97(br,1h),3.84-3.74(m,1h), 3.27-3.21(m,2h),3.19-3.07(m,3h),3.06-2.97(m,1h),2.69-2.61(m,1h),2.55-2.48 (m,1h),2.16-2.00(m,5h),1.98-1.89(m,2h),1.88-1.80(m,1h),1.78-1.69(m,1h), 1.63-1.57(m,2h),1.54-1.49(m,1h),1.26-1.20(m,1h),1.15-1.04(m,1h),1.01-0.94 (m,1h)。
[0379]
第十步
[0380]
(2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯酯1n
[0381]
将9a(15mg，0.016mmol)溶于四氢呋喃(2ml)中，降至0℃后依次加入(2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(13mg，0.081mmol,购于aldrich)和三乙酰氧基硼氢化钠 (34mg，0.16mmol)，反应体系用氮气保护后升至室温反应2小时。反应液加乙酸乙酯(5ml)稀释，然后用水(5ml)洗，饱和食盐水(5ml)洗，无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩，所得残余物用薄层色谱法以展开剂体系a纯化，得到标题产物1n (12mg，产率：69.4％)。
[0382]
ms m/z(esi):1070.3[m+1]。
[0383]
第十一步
[0384]
n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-氨基乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)-4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰胺1
[0385]
将1n(12mg，0.011mmol)溶于二氯甲烷(0.5ml)中，加入4m氯化氢的1,4
‑ꢀ
二氧六环溶液(0.5ml)，室温搅拌20分钟，反应液减压浓缩除去有机溶剂。残余物溶于二氯甲烷，然后减压浓缩干，重复三次，所得残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相a：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；30分钟梯度：40％-70％，流速：30ml/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物1(6mg，产率：55.5％)。
[0386]
ms m/z(esi):970.3[m+1]。
[0387]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.04(d,1h),7.98(dd,1h),7.66(d,2h),7.58(d, 1h),7.51-7.46(m,2h),7.42(t,1h),7.36-7.26(m,7h),7.19(t,1h),7.13(d,1h),6.85 (d,1h),6.78(d,1h),6.71(d,2h),5.21(d,1h),4.30(dd,1h),4.04-3.90(m,1h),3.70 (d,1h),3.54(d,1h),3.06-3.00(m,1h),2.86-2.72(m,3h),2.58-2.54(m,1h), 2.43-2.33(m,1h),2.25-2.16(m,1h),2.10-2.03(m,1h),2.02-1.85(m,4h),1.71-1.38 (m,5h),1.34-1.20(m,3h),1.19-1.05(m,1h),1.03-0.96(m,1h),0.90-0.79(m,1h)。
[0388]
实施例2-2 2
[0389]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((r)-2-环丙基-2-羟基乙酰氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺2
[0390][0391]
将1(10mg，0.010mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(1ml)中，依次加入(r)-2
‑ꢀ
环丙基-2-羟基乙酸2a(12mg,0.10mmol,合成方法参考文献j.chem.soc.,chem. commun.,1991,326-327),三乙胺(3.1mg，0.031mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(5.9mg，0.031mmol)和1-羟基苯并三唑(4.2mg，0.031mmol)，反应体系用氮气保护后升至70℃反应12小时。反应液减压浓缩，残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相a：水(含10mmol/l 的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；30分钟梯度：40％-70％，流速：30ml/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物2(6mg，产率：54.5％)。
[0392]
ms m/z(esi):1066.1[m-1]。
[0393]1h nmr(500mhz,cd3od)δ8.23(d,1h),8.02(dd,1h),7.85-7.76(m,2h),7.60(dd, 1h),7.46-7.34(m,5h),7.34-7.27(m,3h),7.27-7.21(m,2h),7.20-7.15(m,2h), 6.84
–
6.76(m,2h),6.70(d,1h),4.42(d,1h),3.95-3.87(m,1h),3.81-3.75(m,1h), 3.64-3.53(m,2h),3.44-3.36(m,1h),3.28-3.19(m,2h),3.18-3.11(m,2h),2.83-2.74 (m,1h),2.65(td,1h),2.51(td,1h),2.47-2.39(m,1h),2.28-2.17(m,2h),2.17-2.09 (m,1h),2.09-1.93(m,3h),1.80-1.69(m,3h),1.62-1.53(m,1h),1.53-1.44(m,1h), 1.39-1.19(m,5h),1.18-1.03(m,2h),1.02-0.92(m,1h),0.51-0.44(m,2h),0.44-0.32 (m,2h).
[0394]
实施例2-3 3
(((r)-1-((r)-1-(2-((2,2-二氟-3-羟丙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺4
[0402][0403][0404]
第一步
[0405]
(r,z)-2-(2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙-1-烯-1-基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯4b
[0406]
将2-(((苄基氧基)羰基)氨基)-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸甲酯(24.9g，75.1mmol，韶远)溶解于二氯甲烷(250ml)中，冰浴冷却至0℃，滴加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(8.78mg，57.7mmol，供应商韶远)，0℃下搅拌反应40分钟后滴加(r)-2
‑ꢀ
甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯4a(10g，50.1mmol，药石)的50ml二氯甲烷溶液，滴完后撤去冰浴，升至室温反
应48小时。反应液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系b纯化所得残余物得到标题产物4b(20g,产率：98.3％)。
[0407]
ms m/z(esi):305.0[m+h-100]。
[0408]
第二步
[0409]
(r)-2-((r)-2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯4c
[0410]
tert-butyl(r)-2-((r)-2-amino-3-methoxy-3-oxopropyl)pyrrolidine-1-carboxylate
[0411]
将4b(20g，49.4mmol)溶于异丙醇(140ml)中，加入钯碳(5.3g，含量10％，干型)，氢气置换3次，室温搅拌16小时。反应液用硅藻土过滤，滤液浓缩，得到粗品标题产物4c(13g，产率：97％)。产品不经纯化直接进行下一步反应。
[0412]
ms m/z(esi):273.1[m+1]。
[0413]
第三步
[0414]
(r)-2-((r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲氧基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯4d
[0415]
将粗品4c(13g，47.7mmol)溶于1,4-二氧六环(88ml)中，加入水(22ml)，碳酸氢钠(12g，142.8mmol)和芴甲氧羰酰氯(12.3g，47.5mmol，韶远)，室温下搅拌 3小时。反应液中加入水(100ml)，用乙酸乙酯萃取(100ml
×
3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(80ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系b纯化，得到标题产物4d(4.1g, 产率：17.3％)。
[0416]
ms m/z(esi):395.1[m+h-100]。
[0417]
第四步
[0418]
(r)-2-((r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-羟基丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯 4e
[0419]
将4d(2g，4.04mmol)溶于四氢呋喃(80ml)中，加入乙醇(80ml)，依次加入硼氢化钠(921mg，24.3mmol)和氯化锂(1.12g，26.28mmol)，反应液在28℃下搅拌2.5小时。将反应液用冰浴冷却，滴加饱和氯化铵溶液(100ml)淬灭反应，加入水(100ml)，用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液 (80ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系b纯化，得到标题产物4e(1.62g，85.8％)。
[0420]
ms m/z(esi):367.1[m+h-100]。
[0421]
第五步 (r)-2-((r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯4f
[0422]
将4e(1.5g，3.21mmol)溶于甲苯(15ml)中，加入二苯基二硫醚(2.1g，9.64 mmol，adamas)和三丁基膦(1.95g，9.64mmol)，将反应体系用氮气置换3次后升温至80℃搅拌12小时。将反应液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系b纯化，得到标题产物4f(1.7g，94.6％)。
[0423]
ms m/z(esi):459.1[m+h-100]。
[0424]
第六步
[0425]
(r)-2-((r)-2-氨基-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯4g
[0426]
将4f(1.7g，3.04mmol)溶于二氯甲烷(20ml)中，加入二乙胺(20ml)，室温下搅拌3小时，反应液减压浓缩除去有机溶剂，用甲苯(5ml)带旋，得到粗品标题产物4g(1.02g)，产品不经纯化直接进行下一步。
[0427]
ms m/z(esi):337.1[m+1]。
[0428]
第七步
[0429]
(r)-2-((r)-3-(苯基硫杂)-2-((4-氨基磺酰基-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)丙基) 吡咯烷-1-羧酸叔丁酯4h
[0430]
将粗品4g(1g，2.97mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(18ml)中，加入4-氟-3-(三氟甲基磺酰基)苯磺酰胺1i(1g，3.26mmol，毕得)和n,n-二异丙基乙胺(3.84g，29.7 mmol)，反应体系用氮气置换3次后升温至50℃搅拌8小时。反应液中加入水(100 ml)，用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(1200ml) 洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系b纯化，得到标题产物4h(1.27g，68.5％)。
[0431]
ms m/z(esi):524.0[m+h-100]。
[0432]
第八步
[0433]
(r)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯4i
[0434]
将4h(1g，1.63mmol)溶于二氯甲烷(20ml)，加入1k(676mg，1.60mmol)，再加入4-二甲氨基吡啶(394.9mg，3.20mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(614.6mg，3.20mmol)，加完后氮气保护，室温搅拌4小时，补加1k(473 mg，1.12mmol)，加完后室温搅拌过夜。反应液依次用水(25ml)和饱和氯化钠溶液(25ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得残余物用薄层色谱法以展开剂体系a纯化，得到标题产物4i(1.1g，产率：66.7％)。
[0435]
ms m/z(esi):1027.0[m+1]。
[0436]
第九步
[0437]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-(苯基硫杂)-3-((r)-吡咯烷-2-基)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺 4j
[0438]
将4i(210mg，0.204mmol)溶于二氯甲烷(2ml)中，加入4m的氯化氢二氧六环溶液(2ml)，室温搅拌30分钟。反应液解压浓缩除去有机溶剂，用甲苯(5ml) 带旋，得到粗品标题产物4j(189mg)，产品不经纯化直接进行下一步。
[0439]
第十步
[0440]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((r)-1-(2-氯乙基)吡咯-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺4k
[0441]
将4j(189mg，0.203mmol)置于反应瓶中，加入四氢呋喃(10ml)溶解，加入氯乙醛(40％水溶液，400mg，2.03mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(172mg,0.815 mmol)，加完后氮气保护，室温搅拌反应24小时。反应液加入乙酸乙酯(10ml)稀释，加入饱和碳酸氢钠水溶液
(10ml)淬灭，分液，有机相用饱和氯化钠溶液(10ml) 洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，残余物用薄层硅胶色谱法以展开剂体系b纯化得到标题产物4k(160mg，79.3％)。
[0442]
ms m/z(esi):989.3[m+1]。
[0443]
第十一步
[0444]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((r)-1-(2-((2,2-二氟-3-羟丙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺4
[0445]
将4k(30mg，0.030mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(3ml)溶解，加入3-氨基-2,2-二氟丙-1-醇(50.5mg,0.454mmol，毕得)和碘化钾(15mg,0.090 mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l 的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物4(7mg，产率：21.69％)。
[0446]
ms m/z(esi):1064.2[m+1]。
[0447]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.08(d,1h),7.94(dd,1h),7.67(d,2h),7.58(d,1h), 7.51-7.47(d,2h),7.43(t,1h),7.39-7.28(m,6h),7.22(t,1h),7.14(dd,1h),6.80(br, 1h),6.72(d,2h),6.65-6.59(m,1h),5.33(t,1h),5.22(d,1h),4.33-4.29(m,1h),3.92 (s,1h),3.73(d,2h),3.65(d,3h),3.56(d,2h),3.27-3.23(m,2h),2.99(t,2h), 2.86-2.81(m,1h),2.60-2.55(m,1h),2.46-2.39(m,2h),2.04-1.95(m,3h),1.90(d, 2h),1.64-1.57(m,2h),1.50-1.41(m,1h),1.32-1.26(m,2h),1.17-1.06(m,2h),1.01 (d,1h),0.89-0.82(m,2h)。
[0448]
实施例2-5 5
[0449]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((r)-1-(2-((2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基)氨基)乙基)吡咯烷-2
‑ꢀ
基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺5
[0450]
[0451][0452]
将4k(30mg，0.030mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(3ml)溶解，加2-氨基-n,n-二甲基乙酰胺(46.5mg,0.455mmol，毕得)和碘化钾(15mg,0.090 mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l 的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物5(7mg，产率：21.88％)。
[0453]
ms m/z(esi):1055.2[m+1]。
[0454]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.06(d,1h),7.93(dd,1h),7.67(d,2h),7.59(d, 1h),7.49(d,2h),7.43(t,1h),7.38-7.34(m,3h),7.34-7.28(m,3h),7.21(t,1h),7.14 (d,1h),6.76(d,1h),6.2(d,2h),6.59(d,1h),5.33(t,1h),5.21(br,1h),4.31(d,1h), 3.93-3.89(m,1h),3.71(d,1h),3.55(d,1h),3.18-3.11(m,2h),3.11-3.03(m,2h), 3.01-2.95(m,2h),2.93(s,3h),2.89(s,3h),2.59-2.54(m,1h),2.46-2.35(m,2h), 2.15(q,1h),2.06-1.95(m,2h),1.93-1.79(m,2h),1.74-1.64(m,2h),1.63-1.57(m, 1h),1.49-1.40(m,2h),1.34-1.20(m,2h),1.17-1.07(m,1h),1.01(d,1h),0.90-0.81 (m,2h)。
[0455]
实施例2-6 6
[0456]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((r)-1-(2-((2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)氨基)乙基)吡咯烷-2
‑ꢀ
基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺6
[0457][0458]
将4k(30mg，0.030mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(3ml)溶解，加2-氨基-n-甲基乙酰胺(40.1mg,0.455mmol，韶远)和碘化钾(15mg,0.090mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物6(7mg，产率：22.17％)。
[0459]
ms m/z(esi):1041.2[m+1]。
[0460]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.19(q,1h),8.06(d,1h),7.93(dd,1h),7.67(d, 2h),7.59(d,1h),7.50(d,2h),7.43(t,1h),7.39-7.28(m,6h),7.21(t,1h),7.14(d, 1h),6.76(d,1h),6.72(d,2h),6.60(d,1h),5.33(t,1h),5.22(br,1h),4.31(d,1h), 3.89(br,1h),3.72(d,1h),3.26-3.15(m,3h),3.09-3.05(m,1h),2.97-2.92(m,1h), 2.68-2.63(m,3h),2.62-2.54(m,2h),2.47-2.36(m,3h),2.24(q,1h),2.09-1.96(m, 4h),1.93-1.83(m,2h),1.62-1.56(m,2h),1.48-1.42(m,2h),1.33-1.19(m,2h), 1.17-1.09(m,1h),1.01(d,1h),0.90-0.80(m,2h)。
[0461]
实施例2-7 7
[0462]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((r)-1-(2-((2-氟乙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基) 氨
基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺7
[0463][0464]
将2-氟乙基胺盐酸盐(45.3mg，0.45mmol，毕得)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)溶解，加入无水碳酸钾(226mg,1.36mmol)，室温下搅拌1.5小时后过滤，滤液置于反应瓶中，将4k(30mg，0.030mmol)加入反应瓶中，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化 (分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物7(7mg，产率：22.72％)。
[0465]
ms m/z(esi):1016.5[m+1]。
[0466]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.05(d,1h),7.92(dd,1h),7.67(d,2h),7.59(d, 1h),7.49(d,2h),7.43(t,1h),7.39-7.27(m,6h),7.21(t,1h),7.14(dd,1h),6.75
ꢀ‑
6.70(m,2h),6.66(br,1h),6.59(d,1h),5.33(t,1h),5.21(br,1h),4.66(s,1h),4.56 (t,1h),4.31(d,1h),3.87(s,1h),3.71(d,1h),3.54(d,2h),3.25-3.21(m,2h),3.15
‑ꢀ
3.04(m,2h),3.01-2.85(m,2h),2.59-2.54(m,1h),2.44-2.38(m,2h),2.33-2.29(m, 1h),2.20-2.13(m,1h),2.05-1.95(m,3h),1.90(d,1h),1.85-1.80(m,1h),1.74-1.64 (m,2h),1.62-1.54(m,1h),1.50-1.42(m,2h),1.32-1.28(m,1h),1.17-1.09(m,1h), 1.01(d,1h),0.89-0.82(m,1h)。
[0467]
实施例2-8 8
[0468]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((r)-1-(2-(环丙基氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺8
[0469][0470]
将4k(30mg，0.030mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(3ml)溶解，加2-环丙基胺(26mg,0.455mmol，韶远)和碘化钾(15mg,0.090mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物8(7mg，产率：22.72％)。
[0471]
ms m/z(esi):1010.1[m+1]。
[0472]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.04(d,1h),7.91(dd,1h),7.67(d,2h),7.59 (dd,1h),7.51-7.47(m,2h),7.43(t,1h),7.39-.27(m,6h),7.24-7.17(m,1h),7.14(dd, 1h),6.75-6.69(m,2h),6.65(br,1h),6.59(d,1h),5.33(t,1h),5.21(br,1h),4.31(d, 1h),3.85(q,1h),3.71(d,1h),3.55(d,1h),3.26-3.20(m,2h),3.08-3.01(m,1h), 2.92-2.83(m,2h),2.76(s,1h),2.60-2.54(m,1h),2.44-2.38(m,1h),2.37-2.31(m, 1h),2.21-2.17(m,1h),2.09(q,1h),2.04-1.86(m,3h),1.82-1.73(m,1h),1.70-1.56 (m,3h),1.49-1.35(m,2h),1.32-1.27(m,1h),1.17-1.08(m,1h),1.04-0.97(m,1h), 0.91-0.80(m,2h),0.48-0.30(m,4h)。
[0473]
实施例2-9 9
[0474]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((3
‑ꢀ
羟丙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基) 苯基)磺酰基)苯甲酰胺9
[0475][0476]
第一步
[0477]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-氯乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)
[0478]
苯甲酰胺9b
[0479]
将9a(270mg，0.29mmol)置于反应瓶中，加入四氢呋喃(10ml)溶解，加入氯乙醛(40％水溶液，573mg，2.92mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(185mg,0.87mmol)，加完后氮气保护，室温搅拌反应24小时。反应液加乙酸乙酯(10ml)稀释后，用饱和碳酸氢钠水溶液(10ml)洗一遍，饱和氯化钠水溶液(10ml)洗一遍，无水硫酸钠干燥后滤去干燥剂旋干，残余物用薄层硅胶色谱法以展开剂体系b纯化得到标题产物9b(260mg，90.2％)。
[0480]
ms m/z(esi):989.1[m+1]。
[0481]
第二步
[0482]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((3
‑ꢀ
羟丙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基) 苯基)磺酰基)苯甲酰胺9
[0483]
将9b(14mg，0.014mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入
正丙醇胺(21mg,0.28mmol)和碘化钾(7mg,0.042mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物9(4.0mg，产率：27.5％)。
[0484]
ms m/z(esi):1028.2[m+1]
[0485]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.05(d,1h),7.98(dd,1h),7.66(d,2h),7.58(d, 1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.38-7.25(m,6h),7.20(t,1h),7.13(d,1h),6.85(d, 1h),6.78(d,1h),6.71(d,2h),5.32(t,1h),5.21(d,1h),4.37-4.27(m,1h),4.00-3.92 (m,1h),3.70(d,1h),3.54-3.48(m,2h),3.08-3.02(m,1h),2.99-2.89(m,4h), 2.88-2.79(m,1h),2.44-2.36(m,2h),2.26-2.19(m,1h),2.06(q,1h),2.03-1.85(m, 4h),1.77-1.64(m,4h),1.67-1.55(m,1h),1.59-1.38(m,2h),1.34-1.20(m,3h), 1.18-1.06(m,1h),1.00(d,1h),0.92-0.79(m,2h)。
[0486]
实施例2-10 10
[0487]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((2
‑ꢀ
羟乙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基) 苯基)磺酰基)苯甲酰胺10
[0488][0489][0490]
将9b(14mg，0.014mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入乙醇胺(17mg,0.28mmol)和碘化钾(7mg,0.042mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：
30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物10(4.0mg，产率：27.9％)。
[0491]
ms m/z(esi):1014.2[m+1]。
[0492]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.05(d,1h),7.98(dd,1h),7.66(d,2h),7.58(d, 1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.38-7.26(m,6h),7.20(t,1h),7.13(d,1h),6.85(d, 1h),6.79(d,1h),6.71(d,2h),5.31(t,1h),5.26-5.13(m,2h),4.36-4.27(m,1h), 4.02-3.90(m,1h),3.69(d,1h),3.60(s,2h),3.54-3.50(m,2h),3.09-3.02(m,1h), 3.00-2.87(m,4h),2.46-2.33(m,4h),2.28-2.19(m,1h),2.10-2.04(m,1h),2.03-1.84 (m,5h),1.72-1.40(m,5h),1.34-1.21(m,2h),1.18-1.60(m,1h),1.00(d,1h), 0.92-0.78(m,2h)。
[0493]
实施例2-11 11
[0494]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((2-(二甲基氨基)-2-氧代乙基)氨基)乙基)吡咯烷-2
‑ꢀ
基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺11
[0495][0496][0497]
将9b(15mg，0.015mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入n,n-二甲基甘氨酰胺(24mg,0.23mmol，毕得)和碘化钾(7.5mg,0.045 mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l 的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物11(4.0mg，产率：25.0％)。
[0498]
ms m/z(esi):1055.2[m+1]。
[0499]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.06(s,1h),7.98(dd,1h),7.66(d,2h),7.58(d, 1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.39-7.25(m,6h),7.19(t,1h),7.13(d,1h),6.87(d, 1h),6.78(d,1h),6.71(d,2h),5.21(br,1h),4.31(d,1h),4.05-3.93(m,1h), 3.91-3.81(m,2h),3.71(d,1h),3.54(d,1h),3.08-2.90(m,4h),2.89(s,3h),2.85(s, 3h),2.45-2.29(m,3h),2.16(q,1h),2.09-1.85(m,4h),1.75-1.64(m,2h),1.63-1.42 (m,3h),1.35-1.20(m,2h),1.18-1.05(m,1h),1.00(d,1h),0.91-0.79(m,2h)。
[0500]
实施例2-12 12
[0501]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((3,3-二氟环丁基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂) 丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺12
[0502][0503][0504]
将3,3-二氟环丁胺盐酸盐(33mg，0.23mmol，购于ark)置于反应瓶中，加入 n,n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入无水碳酸钾(42mg,0.30mmol)，室温下搅拌 1.5小时后过滤，滤液置于反应瓶中，加入9b(15mg，0.015mmol)和碘化钾(7.5mg, 0.045mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10 mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物12(5.0mg，产率：31.1％)。
[0505]
ms m/z(esi):1060.2[m+1]
[0506]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.07(d,1h),7.99(dd,1h),7.67(d,2h),7.58(d, 1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.38-7.26(m,6h),7.19(t,1h),7.13(d,1h),6.89(d, 1h),6.76(d,1h),6.72(d,2h),5.31(t,1h),5.21(br,1h),4.31(d,1h),4.10-3.95(m, 1h),3.71(d,
1h),3.54-3.49(m,2h),3.06-2.88(m,2h),2.85-2.68(m,4h),2.65-2.31 (m,6h),2.17-2.08(m,1h),2.06-1.94(m,2h),1.90(d,1h),1.84-1.68(m,3h), 1.65-1.52(m,2h),1.33-1.21(m,2h),1.16-1.05(m,2h),1.00(d,1h),0.89-0.81(m, 2h)。
[0507]
实施例2-13 13
[0508]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((2-(甲基氨基)-2-氧代乙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺13
[0509][0510][0511]
将9b(15mg，0.015mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入2-氨基-n-甲基乙酰胺(20mg,0.23mmol，购于毕得)和碘化钾(7.5mg,0.045 mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l 的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物13(5.0mg，产率：31.7％)。
[0512]
ms m/z(esi):1041.2[m+1]。
[0513]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.19(q,1h),8.06(d,1h),7.99(dd,1h),7.67(d, 2h),7.58(d,1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.39
–
7.23(m,6h),7.19(t,1h),7.13(d, 1h),6.89(d,1h),6.79(d,1h),6.72(d,2h),5.21(br,1h),4.31(d,1h),3.99(q,1h), 3.72(d,1h),3.55(d,1h),3.22
–
3.09(m,2h),3.01
–
2.84(m,3h),2.63(d,3h),2.62
ꢀ–
2.53(m,2h),2.50
–
(((r)-1-(苯基硫杂)-3-((s)-1-(2-((吡啶-2-基甲基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基) 磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺15
[0522][0523]
将9b(15mg，0.015mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入3-氨甲基吡啶(25mg,0.23mmol，购于伊诺凯)和碘化钾(7.5mg,0.045 mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l 的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物15(6.0mg，产率：37.3％)。
[0524]
ms m/z(esi):1061.2[m+1]。
[0525]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.53(dd,1h),8.06(d,1h),7.97(dd,1h),7.80 (td,1h),7.66(d,2h),7.58(d,1h),7.51
–
7.47(m,2h),7.42(t,2h),7.38
–
7.25(m, 7h),7.18(t,1h),7.13(dd,1h),6.83(d,1h),6.78(d,1h),6.70(d,2h),5.21(br,1h), 4.31(d,1h),4.11(s,2h),3.96(q,1h),3.70(d,1h),3.54(d,1h),3.30
–
3.20(m,3h), 3.08
–
3.02(m,1h),2.97
–
2.85(m,3h),2.59
–
2.51(m,1h),2.45
–
2.36(m,1h),2.34
ꢀ–
2.28(m,1h),2.14(q,1h),2.05
–
1.97(m,2h),1.95
–
1.86(m,2h),1.72
–
1.63(m, 2h),1.63
–
1.50(m,2h),1.49
–
1.41(m,1h),1.32
–
1.87(m,1h),1.17
–
1.05(m,1h), 1.00(d,1h),0.90
–
0.82(m,2h)。
[0526]
实施例2-16 16
[0527]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((2
‑ꢀ
氟乙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基) 苯基)磺酰基)苯甲酰胺16
[0528][0529]
将3-氟乙胺盐酸盐(23mg，0.23mmol，购于ark)置于反应瓶中，加入n,n
‑ꢀ
二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入无水碳酸钾(42mg,0.30mmol)，室温下搅拌1.5 小时后过滤，滤液置于反应瓶中，加入9b(15mg，0.015mmol)和碘化钾(7.5mg, 0.045mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10 mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物16(5.0mg，产率：32.5％)。
[0530]
ms m/z(esi):1014.1[m-1]。
[0531]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.06(d,1h),7.99(dd,1h),7.66(d,2h),7.58(d, 1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.38
–
7.26(m,6h),7.20(t,1h),7.13(d,1h),6.86(d, 1h),6.78(d,1h),6.71(d,2h),5.21(br,1h),4.68(t,1h),4.58(t,1h),4.31(d,1h), 3.98(q,1h),3.71(d,1h),3.55(d,1h),3.37
–
3.21(m,3h),3.21
–
3.06(m,3h),3.01
ꢀ–
2.90(m,3h),2.64
–
2.54(m,2h),2.45
–
2.33(m,2h),2.23(q,1h),2.07
–
1.85(m, 3h),1.78
–
1.64(m,2h),1.63
–
1.54(m,2h),1.53
–
1.43(m,1h),1.32
–
1.24(m,1h), 1.16
–
1.10(m,1h),1.00(d,1h),0.92
–
0.80(m,1h)。
[0532]
实施例2-17 17
[0533]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((2,2-二氟乙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙
ꢀ‑
2-基)
氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺17
[0534][0535]
将9b(15mg，0.015mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入2,2-二氟乙胺(18.5mg,0.23mmol，购于伊诺凯)和碘化钾(7.5mg,0.045 mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l 的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物17(4.0mg，产率：25.5％)。
[0536]
ms m/z(esi):1032.1[m-1]。
[0537]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.07(d,1h),7.99(dd,1h),7.67(d,2h),7.58(d, 1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.37
–
7.25(m,6h),7.19(t,1h),7.13(d,1h),6.90(d, 1h),6.75(d,1h),6.72(d,2h),5.21(d,1h),4.31(dd,1h),4.08
–
3.98(m,1h),3.72(d, 1h),3.55(d,1h),3.31
–
3.23(m,5h),3.15
–
3.07(m,2h),2.98
–
2.87(m,2h),2.86
–ꢀ
2.73(m,2h),2.61
–
2.53(m,1h),2.46
–
2.40(m,1h),2.24
–
2.15(m,1h),2.09
–
1.94 (m,2h),1.93
–
1.76(m,3h),1.69
–
1.54(m,2h),1.33
–
1.21(m,1h),1.16
–
1.06(m, 1h),1.00(d,1h),0.90
–
0.78(m,2h)。
[0538]
实施例2-18 18
[0539]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(环丙基氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基) 磺酰基)苯甲酰胺18
[0540][0541]
将9b(15mg，0.015mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入环丙胺(13mg,0.23mmol，购于韶远)和碘化钾(7.5mg,0.045mmol)，加完后氮气保护，升至50℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物18(4.0mg，产率：26.1％)。
[0542]
ms m/z(esi):1010.2[m+1]。
[0543]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.05(d,1h),7.98(dd,1h),7.66(d,2h),7.58 (dd,1h),7.51
–
7.46(m,2h),7.42(q,1h),7.37
–
7.24(m,6h),7.22
–
7.17(m,1h), 7.13(dd,1h),6.86(d,1h),6.77(d,1h),6.71(d,2h),5.21(br,1h),4.31(d,1h),3.98 (q,1h),3.71(d,1h),3.55(d,1h),3.34
–
3.22(m,2h),3.15
–
3.11(m,1h),2.99
–ꢀ
2.88(m,3h),2.66
–
2.60(m,1h),2.55(q,1h),2.46
–
2.34(m,3h),2.29(q,1h),2.06
ꢀ–
1.87(m,4h),1.77
–
1.67(m,2h),1.64
–
1.55(m,2h),1.55
–
1.44(m,1h),1.32
–ꢀ
1.23(m,1h),1.17
–
1.07(m,1h),1.04
–
0.97(m,1h),0.89
–
0.80(m,2h),0.65
–
0.51 (m,4h)。
[0544]
实施例2-19 19
[0545]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(甲基氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基) 磺酰基)苯甲酰胺19
[0546][0547]
第一步
[0548]
(2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1
‑ꢀ
基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯19b
[0549]
将9a(18mg，0.02mmol)置于反应瓶中，加入四氢呋喃(2ml)溶解，加入甲基 (2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯19a(34mg，0.20mmol，采用专利申请“wo2013/68552,2013,a1中说明书第53页的中间体34”公开的方法制备而得) 和三乙酰氧基硼氢化钠(41mg,0.19mmol)，加完后氮气保护，室温搅拌反应6小时。反应液中加入水(5ml)，用乙酸乙酯萃取(5ml
×
3)，合并有机相，用氯化钠溶液(10ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用薄层色谱法以展开剂体系a 纯化所得残余物，得到标题产物19b(12mg，产率：57.0％)。
[0550]
ms m/z(esi):1084.2[m+1]
[0551]
第二步
[0552]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(甲基氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺19
[0553]
将19b(12mg，0.011mmol)溶于二氯甲烷(0.5ml)中，加入4m氯化氢的1,4
‑ꢀ
二氧六环溶液(2ml)，搅拌反应1小时。反应液减压浓缩，用高效液相色谱法纯化所得残余物(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集其相应组分，得到标题产物19(2.5mg，产率：22.9％)。
6.68(m,3h),5.32(t,1h),5.22(s,1h),4.31(d,1h),4.12(q,2h), 4.04-3.99(m,1h),3.71(d,2h),3.53(s,2h),3.12-3.06(m,1h),3.02-2.94(m,1h), 2.87-2.80(m,2h),2.60-2.64(m,2h),2.43-2.34(m,2h),2.19-2.13(m,1h),2.06-1.95 (m,3h),1.90(d,1h),1.84-1.73(m,3h),1.65-1.56(m,2h),1.45(t,1h),1.32-1.27(m, 1h),1.19(t,3h),1.15-1.08(m,1h),1.00(d,1h),0.90-0.81(m,2h)。
[0562]
实施例2-21 21
[0563]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(苯基氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基) 磺酰基)苯甲酰胺21
[0564][0565]
将9b(15mg，0.015mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入苯胺(21mg,0.23mmol，购于国药)，碘化钾(7.5mg,0.045mmol)和无水碳酸钾(6.2mg，0.045mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物21(5.0mg，产率：31.5％)。
[0566]
ms m/z(esi):1046.2[m+1]。
[0567]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.08(d,1h),7.97(d,1h),7.67(d,2h),7.58(dd, 1h),7.53-7.45(m,2h),7.42(q,1h),7.38-7.24(m,6h),7.22-7.05(m,4h),6.73(d, 2h),6.67-6.52(m,3h),5.32(t,1h),5.22(d,1h),4.31(dd,1h),4.07-3.98(m,1h), 3.73(d,1h),3.58-3.54(m,2h),3.41-3.25(m,6h),2.65-2.54(m,2h),2.52-2.40(m, 4h),2.04-1.95(m,
2h),1.90(d,2h),1.64-1.55(m,1h),1.48-1.42(m,1h),1.31-1.23 (m,2h),1.17-1.06(m,2h),1.00(d,1h),0.89-0.80(m,2h)。
[0568]
实施例2-22 22
[0569]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-(苯基硫杂)-3-((s)-1-(2-((2,2,2-三氟乙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺22
[0570][0571]
将9b(19mg，0.019mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2.0ml)溶解，加入2,2,2-三氟乙胺(21mg,0.23mmol，购于adamas)，碘化钾(9.6mg,0.058 mmol)和无水碳酸钾(8.0mg，0.058mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-tprep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度： 44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物22(5.0mg，产率：24.8％)。
[0572]
ms m/z(esi):1052.2[m+1]。
[0573]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.08(d,1h),8.00(d,1h),7.67(d,2h),7.59(dd, 1h),7.55
–
7.47(m,2h),7.43(t,1h),7.39
–
7.26(m,6h),7.19(t,1h),7.14(dd,1h), 6.93(br,1h),6.73(d,2h),5.22(d,1h),4.31(dd,1h),4.05(br,1h),3.73(d,1h),3.57 (d,1h),3.18
–
2.74(m,6h),2.67
–
2.35(m,6h),2.31
–
2.04(m,3h),2.04
–
1.80(m, 4h),1.78
–
1.57(m,3h),1.31
–
1.18(m,1h),1.18
–
1.06(m,1h),1.01(d,1h),0.93
–ꢀ
0.79(m,2h)。
[0574]
实施例2-23 23
[0575]
2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲
基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1
‑ꢀ
基)乙基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯23
[0576][0577][0578]
第一步
[0579]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-羟乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺23a
[0580]
将9a(15mg，0.016mmol)溶于乙腈(2ml)中，依次加入三乙胺(16mg，0.16 mmol)和溴乙醇(20mg，0.16mmol)，反应体系用氮气保护后升至70℃反应12小时。用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相:碳酸氢铵、水、乙腈)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物23a(10mg，产率： 63.4％)。
[0581]
ms m/z(esi):971.2[m+1]。
[0582]
第二步
[0583]
叔丁基(2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)
(羟基)甲基)哌啶
ꢀ‑
1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基) 吡咯烷-1-基)乙基)乙烷-1,2-二基二氨基甲酸酯23b
[0584]
将23a(21mg，0.022mmol)置于反应瓶中，加入二氯甲烷(2ml)溶解，加入二 (对硝基苯)碳酸酯(9.9mg，0.032mmol，购于韶远)和4-二甲氨基吡啶(7.9mg，0.065 mmol)，加完后氮气保护，室温下反应2小时后，加入吡啶(8.5mg，0.11mmol)和 (2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(17mg，0.11mmol，购于韶远)，加完后氮气保护，室温下搅拌16小时，加饱和氯化铵水溶液(2ml)淬灭反应，水相用二氯甲烷(2 ml
×
3)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系b纯化，得到标题产物23b(10mg，产率：40.0％)。
[0585]
ms m/z(esi):1155.2[m-1]。
[0586]
第三步
[0587]
2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基) 苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷
ꢀ‑
1-基)乙基(2-氨乙基)氨基甲酸酯23
[0588]
将23b(10mg，0.086mmol)置于反应瓶中，加入二氯甲烷(0.5ml)溶解，加入 4m的氯化氢二氧六环溶液(0.5ml)，室温搅拌1小时，旋干溶剂，所得残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10 mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物23(3.0mg，产率：32.8％)。
[0589]
ms m/z(esi):1057.2[m+1]。
[0590]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.03(d,1h),7.98
–
7.94(dd,1h),7.77
–
7.64 (m,3h),7.58(dd,1h),7.52
–
7.47(m,2h),7.42(t,1h),7.37
–
7.26(m,6h),7.23
–ꢀ
7.16(m,2h),7.13(dd,1h),6.79(d,1h),6.72(d,1h),5.76(s,2h),5.32(td,1h),5.21 (d,1h),4.31(dd,1h),4.09(dd,1h),4.02
–
3.89(m,3h),3.72(d,1h),3.55(d,1h), 3.27
–
3.19(m,3h),3.17(s,1h),3.16(s,1h),3.00(br,1h),2.84(t,2h),2.59
–
2.40 (m,2h),2.02
–
1.95(m,3h),1.92
–
1.85(m,2h),1.69
–
1.50(m,2h),1.45(t,1h), 1.33
–
1.23(m,1h),1.17
–
1.08(m,1h),1.00(d,1h),0.89
–
0.80(m,2h)。
[0591]
实施例2-24 24
[0592]
2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1
‑ꢀ
基)乙基甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸酯24
[0593][0594][0595]
第一步
[0596]
叔丁基(2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基) 哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)乙烷-1,2-二基二(甲基氨基甲酸酯)24a
[0597]
将23a(21mg，0.022mmol)置于反应瓶中，加入二氯甲烷(2ml)溶解，加入二 (对硝基苯)碳酸酯(7.1mg，0.023mmol，购于韶远)和4-二甲氨基吡啶(3.9mg，0.032 mmol)，加完后氮气保护，室温下反应2小时后，加入吡啶(8.5mg，0.11mmol)和 n-甲基-n-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(20mg，0.11mmol，购于书亚)，加完后氮气保护，室温下搅拌16小时，加饱和氯化铵水溶液(2ml)淬灭反应，水相用二氯甲烷(2ml
×
3)萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系b纯化，得到标题产物24a(11mg，产率：43.7％)。
[0598]
ms m/z(esi):1185.2[m+1]。
[0599]
第二步
[0600]
2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基) 苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷
ꢀ‑
1-基)乙基甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸酯24
[0601]
将24a(11mg，0.093mmol)置于反应瓶中，加入二氯甲烷(0.5ml)溶解，加入 4m的氯化氢二氧六环溶液(0.5ml)，室温搅拌1小时，旋干溶剂，所得残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10 mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物24(3.5mg，产率：34.8％)。
[0602]
ms m/z(esi):1085.2[m+1]。
[0603]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.38(br,1h),8.05(d,1h),7.94(dd,1h),7.66 (d,2h),7.58(d,1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.39
–
7.23(m,6h),7.19(t,1h),7.13 (d,1h),7.07(d,2h),6.85
–
6.74(m,2h),6.70(t,3h),5.21(d,1h),4.31(dd,1h),3.97
ꢀ–
3.89(m,1h),3.70(d,1h),3.54(d,1h),3.30
–
3.18(m,4h),3.01(br,1h),2.64
–ꢀ
2.46(m,4h),2.46
–
2.35(m,2h),2.19
–
1.95(m,4h),1.90(d,2h),1.75
–
1.55(m, 3h),1.51
–
1.41(m,1h),1.32
–
1.20(m,1h),1.16
–
1.07(m,3h),1.00(d,1h),0.93
–
0.73(m,2h)。
[0604]
实施例2-25 25
[0605]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(((s)-3,4-二羟基丁基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺25
[0606][0607]
第一步
[0608]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((2-((s)-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊-4-基)乙基)氨基)乙基) 吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺25b
[0609]
将9b(60mg，0.060mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(3ml)溶解，加(s)-2-(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊-4-基)乙-1-胺25a(87.99mg,0.606mmol,采用专利申请“us2011/86854,2011,a1中说明书第13页的实施例4”公开的方法制备而得)和碳酸钾(25.12mg，0.181mmol)，碘化钾(30.1mg,0.181mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，加水(5ml)淬灭，加乙酸乙酯萃取(10 ml
×
2)，有机相用饱和氯化钠(2ml
×
2)
洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩后残余物用薄层硅胶色谱法以展开剂体系a纯化得到标题产物25b(11mg，产率：16.5％)。
[0610]
ms m/z(esi):1098.3[m+1]。
[0611]
第二步
[0612]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(((s)-3,4-二羟基丁基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺25
[0613]
将25b(11mg，0.010mmol)置于反应瓶中，加入乙腈(5ml)溶解，加三氟甲磺酸镱(20mg,0.032mmol)，氮气保护，升至70℃反应过夜，降至室温，浓缩后残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水 (含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速： 30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物25(3mg，产率：28.3％)。
[0614]
ms m/z(esi):1058.2[m+1]。
[0615]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.24(s,1h),8.07(d,1h),7.82(dd,2h),7.62(d,1h), 7.48-7.30(m,7h),7.30-7.23(m,2h),7.22-7.17(m,2h),6.82(d,2h),6.77(d,2h), 5.40-5.33(m,2h),4.43(d,1h),3.84-3.73(m,4h),3.66-3.60(m,2h),3.49-3.46(m, 2h),3.22-3.15(m,3h),3.08-3.03(m,1h),2.91-2.83(m,2h),2.71-2.62(m,2h), 2.56-2.49(m,2h),2.39(d,2h),2.25-2.18(m,3h),2.09-2.01(m,2h),1.83-1.77(m, 2h),1.64-1.56(m,2h),1.27-1.21(m,2h),1.17-1.10(m,1h),0.95-0.89(m,2h)。
[0616]
实施例2-26 26
[0617]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((2
‑ꢀ
羟乙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基) 苯基)磺酰基)苯甲酰胺26
[0618][0619]
将9b(14mg，0.014mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶解，加入2-氨基乙醇(19mg,0.28mmol，adamas)和碘化钾(7mg,0.042mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物26(4.0mg，产率：27.9％)。
[0620]
ms m/z(esi):1014.3[m+1]。
[0621]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.05(d,1h),7.98(dd,1h),7.66(d,2h),7.58(d, 1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.38
–
7.26(m,6h),7.20(t,1h),7.13(d,1h),6.85(d, 1h),6.79(d,1h),6.71(d,2h),5.26
–
5.13(m,2h),4.31(dd,1h),3.96(q,1h),3.69(d, 1h),3.61(s,1h),3.54(d,1h),3.08
–
3.02(m,1h),3.01
–
2.87(m,4h),2.65
–
2.33(m, 2h),2.29
–
2.20(m,1h),2.10
–
2.04(m,1h),2.03
–
1.84(m,5h),1.72
–
1.40(m,6h), 1.35
–
1.18(m,2h),1.17
–
1.06(m,1h),1.00(d,1h),0.90
–
0.80(m,2h)。
[0622]
实施例2-27 27
[0623]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((环丙基甲基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2
‑ꢀ
基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺27
[0624][0625]
将9b(20mg，0.020mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)溶解，加入环丙基甲基胺(22mg,0.31mmol)和碘化钾(10mg,0.060mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物27(5.0mg，产率：24.1％)。
[0626]
ms m/z(esi):1024.3[m+1]。
[0627]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.04(s,1h),7.94(d,1h),7.66(d,2h),7.58(d, 1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.39
–
7.23(m,5h),7.19(t,1h),7.13(d,1h),6.80(d, 2h),6.70(d,2h),5.21(d,1h),4.31(dd,1h),3.95(q,1h),3.70(d,1h),3.53(d,1h), 3.02
–
2.96(m,1h),2.78
–
2.66(m,3h),2.63(s,1h),2.45
–
2.33(m,3h),2.15(q,1h), 2.11
–
1.82(m,6h),1.69
–
1.54(m,3h),1.54
–
1.36(m,3h),1.31
–
1.18(m,2h),1.17
ꢀ–
1.06(m,1h),1.00(d,1h),0.92
–
0.76(m,3h),0.41(d,2h),0.12(d,2h)。
[0628]
实施例2-28 28
[0629]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(异丙基氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基) 磺酰基)苯甲酰胺28
[0630][0631]
将9b(20mg，0.020mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)溶解，加入异丙胺(20mg,0.34mmol)和碘化钾(10mg,0.060mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物28(5.0mg，产率：24.4％)。
[0632]
ms m/z(esi):1012.2[m+1]。
[0633]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.04(d,1h),7.98(dd,1h),7.66(d,2h),7.58(d, 1h),7.49(d,1h),7.42(t,1h),7.39
–
7.26(m,5h),7.20(t,1h),7.13(d,1h),6.84(d, 1h),6.79(d,1h),6.71(d,2h),5.21(d,1h),4.31(dd,1h),3.97(q,1h),3.70(d,1h), 3.54(d,1h),3.23
–
3.16(m,2h),3.06
–
2.99(m,2h),2.97
–
2.87(m,2h),2.86
–
2.78 (m,1h),2.59
–
2.34(m,3h),2.27
–
2.20(m,1h),2.13
–
2.06(m,1h),2.04
–
1.85(m, 4h),1.74
–
1.40(m,5h),1.33
–
1.20(m,5h),1.18
–
1.06(m,5h),1.00(d,1h),0.91
–ꢀ
0.79(m,1h)。
[0634]
实施例2-29 29
[0635]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-((2,2-二氟-3-羟丙基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺29
[0636][0637]
将9b(20mg，0.020mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)溶解，加入3-氨基-2,2-二氟丙烷-1-醇(34mg,0.31mmol)和碘化钾(10mg,0.060mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物29(3.0mg，产率：13.9％)。
[0638]
ms m/z(esi):1064.3[m+1]。
[0639]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.07(s,1h),7.98(d,1h),7.67(d,2h),7.58(d, 1h),7.49(d,2h),7.42(t,1h),7.40
–
7.25(m,5h),7.19(q,2h),7.13(d,2h),6.91(d, 1h),6.79
–
6.69(m,3h),5.22(d,1h),4.31(dd,1h),4.04(q,1h),3.72(d,1h),3.62(t, 1h),3.55(d,1h),3.18
–
3.09(m,1h),2.97(t,2h),2.82(br,2h),2.63
–
2.34(m,3h), 2.27
–
2.13(m,1h),2.11
–
1.95(m,2h),1.95
–
1.78(m,3h),1.72
–
1.52(m,2h),1.46 (q,1h),1.37
–
1.19(m,4h),1.16
–
1.05(m,1h),1.00(d,1h),0.92
–
0.78(m,2h)。
[0640]
实施例2-30 30
[0641]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(环丁基氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基) 磺酰基)苯甲酰胺30
[0642][0643]
将9b(35mg，0.035mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)溶解，加入3-环丁胺(50mg,0.71mmol)和碘化钾(18mg,0.11mmol)，加完后氮气保护，升至70℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物30(8.0mg，产率：22.1％)。
[0644]
ms m/z(esi):1024.3[m+1]。
[0645]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.05(d,1h),7.98(dd,1h),7.66(d,2h),7.58 (dd,1h),7.53
–
7.45(m,2h),7.42(td,1h),7.39
–
7.26(m,5h),7.20(t,1h),7.13(dd, 1h),6.84(d,1h),6.78(d,1h),6.70(d,2h),6.65(br,1h),5.21(d,1h),4.31(dd,1h), 3.96(q,1h),3.70(d,1h),3.54(d,1h),3.07
–
3.00(m,1h),2.78(s,2h),2.58
–
2.49 (m,2h),2.45
–
2.34(m,2h),2.25
–
2.16(m,1h),2.15
–
1.84(m,7h),1.79
–
1.40(m, 7h),1.34
–
1.18(m,4h),1.17
–
1.05(m,1h),1.00(d,1h),0.93
–
0.78(m,2h)。
[0646]
实施例2-31 31
[0647]
(2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)甘氨酸异丙酯31
(((r)-1-((s)-1-(2-(2-(环丙基氨基)乙酰氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺33
[0660][0661]
第一步
[0662]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(2
‑ꢀ
氯乙酰氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺33a
[0663]
将1(181mg，0.186mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(10ml)溶解，加入2-氯乙酸(36mg，0.381mmol)，加入o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n
′
,n
′‑ꢀ
四甲基脲六氟磷酸酯(221mg，0.581mmol)和n,n-二异丙基乙胺(100mg,0.775 mmol)，加完后氮气保护，室温搅拌反应16小时。反应液加入水(10ml)，用乙酸乙酯萃取(10ml
×
3)，有机相用饱和氯化钠溶液(10ml
×
1)洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，残余物用薄层硅胶色谱法以展开剂体系b纯化得到标题产物33a(170 mg，87.1％)。
[0664]
ms m/z(esi):1044.1[m-1]。
[0665]
第二步
[0666]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(2-(环丙基氨基)乙酰氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺33
[0667]
将33a(72mg，0.069mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(5ml)溶解，加环丙基胺(59mg,1.03mmol)和碳酸钾(37mg,0.272mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：
30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物33(15mg，产率：20.4％)。
[0668]
ms m/z(esi):1065.2[m-1]。
[0669]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.08-8.04(m,1h),7.99(d,1h),7.68(d,2h), 7.59(d,1h),7.49(d,2h),7.43(t,1h),7.38-7.25(m,6h),7.22-7.17(m,1h),7.14(d, 1h),6.87(d,1h),6.81(d,1h),6.74(d,2h),5.33(t,1h),5.22(d,1h),4.33-4.29(m, 1h),4.01(s,1h),3.74(d,2h),3.58(d,2h),2.86-2.74(m,1h),2.66-2.55(m,3h), 2.43-2.34(m,4h),2.09(s,1h),2.06-1.94(m,4h),1.90(d,2h),1.78-1.57(m,4h), 1.49-1.40(m,2h),1.32-1.27(m,2h),1.17-1.08(m,2h),1.01(d,1h),0.90-0.81(m, 2h)。
[0670]
实施例2-34 34
[0671]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(2-((2,2-二氟乙基)氨基)乙酰氨基)乙基)吡咯烷-2-基
ꢀ‑
3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺34
[0672][0673]
将33a(20mg，0.019mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)溶解，加2,2-二氟乙胺(23.2mg,0.287mmol，供应商韶远)和碳酸钾(10.4mg,0.076 mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l 的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物34(4mg，产率：19.1％)。
[0674]
ms m/z(esi):1091.4[m+1]。
[0675]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.08(s,1h),7.98(d,1h),7.68(d,2h),7.59(d, 1h),7.49(d,2h),7.43(t,1h),7.38-7.25(m,6h),7.22-7.17(m,1h),7.14(d,1h), 6.94-6.87(br,1h),6.84-6.78(br,1h),6.74(d,2h),6.66(br,1h),5.33(t,1h),5.22(d, 1h),4.33-4.29(m,1h),4.07-3.95(m,1h),3.74(d,1h),3.77-3.71(m,1h),3.61-3.53 (m,1h),3.22-3.13(m,2h),2.92-2.83(m,2h),2.66-2.56(m,3h),2.43-2.34(m,4h), 2.09(s,1h),2.04-1.95(m,3h),1.90(d,2h),1.64-1.55(m,2h),1.50-1.42(m,2h), 1.33-1.28(m,2h),1.17-1.08(m,2h),1.01(d,1h),0.88-0.82(m,2h)。
[0676]
实施例2-35 35
[0677]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(2-((2-氟乙基)氨基)乙酰氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺35
[0678][0679]
将2-氟乙基胺盐酸盐(28.5mg，0.28mmol，毕得)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)溶解，加入无水碳酸钾(118.5mg,0.85mmol)，室温下搅拌1.5小时后过滤，滤液置于反应瓶中，将33a(20mg，0.019mmol)加入反应瓶中，加入 n,n-二甲基甲酰胺(1ml)溶解，计入碳酸钾(10.4mg,0.076mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物35(4mg，产率：19.5％)。
[0680]
ms m/z(esi):1071.4[m-1]。
[0681]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.11(br,1h),8.06(s,1h),7.99(d,1h),7.68(d, 2h),7.59(d,1h),7.49(d,2h),7.43(t,1h),7.38-7.25(m,6h),7.22-7.17(m,1h),7.14 (d,1h),6.86(d,1h),6.81(d,1h),6.74(d,2h),6.66(br,1h),5.33(t,1h),5.22(d,1h), 4.33-4.29(m,1h),4.04-3.97(m,1h),3.74(d,2h),3.61-3.53(m,1h),3.08-2.96(m, 2h),2.86-2.71(m,2h),2.65-2.55(m,3h),2.43-2.34(m,3h),2.09(s,1h),2.06-1.88 (m,5h),1.78-1.58(m,2h),1.51-1.43(m,2h),1.34-1.28(m,2h),1.17-1.06(m,2h), 1.01(d,1h),0.89-0.81(m,2h)。
[0682]
实施例2-36 36
[0683]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(2-(甲基氨基)乙酰氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂) 丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺36
[0684][0685]
将33a(20mg，0.019mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)溶解，加入甲胺的四氢呋喃溶液(2m，0.14ml，0.28mmol)和碳酸钾(10.4mg,0.076 mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l 的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物36(6mg，产率：30.1％)。
[0686]
ms m/z(esi):1041.3[m+1]。
[0687]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.26(br,1h),8.02(s,1h),7.99(d,1h),7.68(d, 2h),7.59(d,1h),7.50(d,2h),7.43(t,1h),7.38-7.27(m,6h),7.22-7.17(m,1h),7.14 (d,1h),6.83-6.76(m,2h),6.73(d,2h),6.66(br,1h),5.33(t,1h),5.22(d,1h), 4.34-4.29(m,1h),4.00-3.95(m,1h),3.73(d,1h),3.66-3.53(m,4h),3.09-2.99(m, 2h),2.65-2.55(m,2h),2.44-2.36(m,2h),2.22-2.14(m,2h),2.09(s,1h),2.04-1.96 (m,2h),1.94-1.85(m,2h),1.70-1.52(m,2h),1.48-1.37(m,2h),1.33-1.28(m,2h), 1.17-1.09(m,2h),1.01(d,1h),0.88-0.83(m,2h)。
[0688]
实施例2-37 37
[0689]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1
‑ꢀ
基)-n-((4-(((r)-1-((s)-1-(2-(2-(乙氨基)乙酰氨基)乙基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙
ꢀ‑
2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺37
[0690][0691]
将33a(20mg，0.019mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)溶解，加入乙胺的四氢呋喃溶液(2m,0.14ml,0.28mmol)和碳酸钾(10.4mg,0.076mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物37(6mg，产率：29.8％)。
[0692]
ms m/z(esi):1053.3[m-1]。
[0693]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.22(br,1h),8.02-7.98(m,2h),7.68(d,2h), 7.59(d,
1h),7.49(d,2h),7.43(t,1h),7.38-7.27(m,6h),7.20(t,1h),7.14(d,1h), 6.81-6.75(m,2h),6.73(d,2h),6.66(br,1h),5.33(t,1h),5.22(d,1h),4.34-4.29(m, 1h),4.00-3.96(m,1h),3.72(d,1h),3.66-3.53(m,4h),3.05-3.01(m,1h),2.93-2.85 (m,2h),2.65-2.55(m,2h),2.47-2.36(m,3h),2.19-2.13(m,1h),2.09(s,1h), 2.04-1.95(m,2h),1.93-1.85(m,2h),1.70-1.59(m,2h),1.49-1.37(m,2h),1.31-1.27 (m,2h),1.15-1.09(m,3h),1.01(d,1h),0.88-0.83(m,2h)。
[0694]
实施例2-38 38
[0695]
4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)-n-((4-(((r)-1-(苯基硫杂)-3-((s)-1-(2-((噻唑-2-基甲基)氨基)乙基)吡咯烷-2-基)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基) 磺酰基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺38
[0696][0697]
将9b(20mg，0.020mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(4ml)溶解，加噻唑-2-基甲胺(46mg,0.402mmol，韶远)和碘化钾(10mg,0.060mmol)，加完后氮气保护，升至60℃反应16小时，降至室温，过滤，滤液用高效液相色谱法纯化 (分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物38(3mg，产率：13.9％)。
[0698]
ms m/z(esi):1067.3[m+1]。
[0699]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.07(s,1h),7.98(d,2h),7.74(d,1h),7.67(d, 2h),
7.63(s,1h),7.59(d,1h),7.49(d,2h),7.43(t,1h),7.38-7.25(m,6h),7.22-7.17 (m,1h),7.14(d,1h),6.87(d,1h),6.77(d,1h),6.72(d,2h),5.33(t,1h),5.22(d,1h), 4.31(d,1h),4.13-4.08(m,1h),4.02-3.98(m,1h),3.71(d,2h),3.55(d,2h), 2.84-2.79(m,1h),2.66-2.56(m,2h),2.45-2.36(m,3h),2.19-2.11(m,1h),2.05-1.95 (m,3h),1.91(d,2h),1.78-1.74(m,1h),1.64-1.56(m,1h),1.48-1.44(m,1h), 1.38-1.28(m,2h),1.17-1.09(m,1h),1.04-0.97(m,1h),0.91-0.83(m,2h)。
[0700]
实施例3-1ld-1
[0701]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2
‑ꢀ
基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰)氧基)甲基)-5-((s)-2-((s)-2-(2-((3s,5s)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-5-((2
‑ꢀ
磺酸基乙氧基)甲基)吡咯烷-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰胺基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2-羧酸ld-1
[0702]
[0703][0704]
第一步
[0705]
2-((3s,5s)-5-((2-((4-((叔丁基二苯基硅基)氧基)-2,2-二甲基丁氧基)磺酰基)乙氧基)甲基)-3-(二苄基氨基)-2-氧代吡咯烷-1-基)乙酸叔丁酯ld-1c
[0706]
将2-((3s,5s)-3-(二苄基氨基)-5-(羟基甲基)-2-氧代吡咯烷-1-基)乙酸叔丁酯ld-1a(2.38g,5.61mmol,采用专利申请“wo2017214335a1中说明书第637页的实施例2.119.10”公开的方法制备而得)溶于无水乙醚(50ml)中，冷却至-40℃，加入4-((叔丁基二苯基硅基)氧基)-2,2-二甲基丁基乙烯基磺酸酯ld-1b(5.76g, 12.90mmol,溶于3ml无水乙醚，采用公知的方法“organic and biomolecularchemistry,2007,vol.5,#1,132-138”制备而得)，分批缓慢加入叔丁醇钾(1.26g, 11.23mmol)，加毕，-40℃下继续搅拌一小时。加入饱和氯化铵水溶液(50ml)，搅拌2分钟后静置分层，保留有机相，水相用乙酸乙酯萃取(30ml
×
3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液(50ml
×
2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系b纯化所得残余物得到标题产物ld-1c (2.49g，产率：50.9％)。
[0707]
ms m/z(esi):871.3[m+1]。
[0708]
第二步
[0709]
2-((3s,5s)-3-氨基-5-((2-((4-((叔丁基二苯基硅基)氧基)-2,2-二甲基丁氧基)磺酰基)乙氧基)甲基)-2-氧代吡咯烷-1-基)乙酸叔丁酯ld-1d
[0710]
将ld-1c(2.48g，2.85mmol)溶于冰乙酸(40ml)中，加入钯碳(740mg，含量 10％)，氢气置换三次，加热至60℃，搅拌反应24小时。反应液用油滤纸过滤，滤饼用无水四氢呋喃(50ml)淋洗，滤液减压浓缩，油泵拉干。所得粗品溶于乙酸乙酯(30ml)中，加入饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)，搅拌2分钟后静置分层，保留有机相，水相用乙酸乙酯萃取(30ml
×
3)，合并有机相，有机相用饱和氯化钠溶液 (50ml
×
2)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，滤液减压浓缩，得到粗品标题产物ld-1d(1.83g，产率：93.0％)。产品不经纯化直接用于下一步反应。
[0711]
ms m/z(esi):691.3[m+1]。
[0712]
第三步
[0713]
2-(((2s,4s)-4-氨基-1-(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-5-氧代吡咯烷-2-基)甲氧基)乙烷-1-磺酸ld-1e
[0714]
将ld-1d(1.58g，2.29mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(12ml)和叔丁醇(4ml) 中，加入无水氟化钾(797mg，13.72mmol)，氮气保护，加热至70℃，搅拌72小时。冷却至室温，反应液用硅藻土过滤，滤饼用无水四氢呋喃(50ml)淋洗，滤液减压浓缩，油泵拉干。所得粗品加入30ml正己烷打浆，倾倒出上层正己烷保留固体，重复三次，减压浓缩得到粗品标题产物ld-1e(1.18g)，产品不经纯化直接用于下一步反应。
[0715]
ms m/z(esi):353.0[m+1]。
[0716]
第四步
[0717]
2-((3s,5s)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-5-((2-磺酸基乙氧基) 甲基)吡咯烷-1-基)乙酸ld-1f
[0718]
将粗品ld-1e(1.18g)置于烧瓶中，冰水浴冷却，加入饱和碳酸氢钠水溶液(10 ml)，搅拌下加入n-甲氧基羰基顺丁烯二酰亚胺(545mg，3.51mmol，cas 55750-48-6，药明康德)，冰浴下继续搅拌30分钟。反应液过滤后所得水溶液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含0.1％的三氟乙酸)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：0％-10％，流速：30ml/min)，收集其相应组分，减压浓缩得到标题产物ld-1f(265mg，三步产率：24.9％)。
[0719]
ms m/z(esi):377.2[m+1]。
[0720]
第五步
[0721]
(2s,3s,4r,5s,6s)-2-(5-((s)-2-((s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)-2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯乙基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯ld-1h
[0722]
将化合物1(14mg,0.014mmol)和(2s,3s,4r,5s,6s)-2-(5-((s)-2-((s)-2-((((9h-芴
ꢀ‑
9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基) 甲基)苯乙基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯ld-1g
(21mg, 0.021mmol,采用专利申请“wo2017214335a1第646页实施例2.123.19”公开的方法制备而得)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1ml)溶解，加入n,n-二异丙基乙胺(9mg,0.070mmol)和1-羟基苯并三氮唑(1.9mg,0.014mmol，购于韶远)，氮气保护后，在室温下反应过夜。将反应瓶置于冰水浴中，加饱和碳酸氢钠水溶液(3ml)，加乙酸乙酯(5ml)稀释，两相分离后有机相用饱和氯化钠水溶液洗(2 ml*3),用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干，所得残余物用薄层硅胶色谱法以洗脱剂体系b纯化，得到标题产物ld-1h(16mg，产率：62.0％)。
[0723]
ms m/z(esi):1855.5[m+1]。
[0724]
第六步
[0725]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(5-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)-2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶
ꢀ‑
1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基) 吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2羧酸ld-1i
[0726]
将ld-1h(8mg,0.0043mmol)置于反应瓶中，加入四氢呋喃(0.3ml)，叔丁醇 (0.1ml)，水(0.1ml)，加入氢氧化锂一水合物(1.8mg,0.043mmol)，室温下反应1 小时，旋干溶剂，所得残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-tprep c18；流动相：水(含10mmol/l的乙酸铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度： 44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物ld-1i(4.0mg，产率：62.1％)。
[0727]
ms m/z(esi):1493.5[m+1]。
[0728]
第七步
[0729]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2
‑ꢀ
基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-5-((s)-2-((s)-2-(2-((3s,5s)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-5-((2
‑ꢀ
磺酸基乙氧基)甲基)吡咯烷-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2-羧酸ld-1
[0730]
将ld-1f(3.0mg,0.008mmol)置于反应瓶中，加n,n-二甲基甲酰胺(0.5ml)溶解，加n,n-二异丙基乙胺(5.1mg,0.040mmol)，2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(2.4mg,0.008mmol)，氮气保护后室温下搅拌2小时，加入2-((3s,5s)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-5-((2-磺酸基乙氧基)甲基) 吡咯烷-1-基)乙酸ld-1i(4.0mg,0.0027mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(0.5ml)溶液，氮气保护后搅拌过夜。旋干溶剂，所得残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的乙酸铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物ld-1(0.5mg，产率：10.1％)。
[0731]
ms m/z(esi):1851.5[m+1]。
[0732]
实施例3-2ld-2
[0733]
n-((4-(((r)-1-((s)-1-((39s,47r)-39-苄基-47-环丙基-1-((1r,4r)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢
ꢀ‑
1h-吡咯-1-基)甲基)环己基)-1,31,34,37,40,43,48-七氧代
ꢀ‑
5,8,
11,14,17,20,23,26,29,46-十氧杂-2,32,35,38,41,44,49-七氮杂五十一烷-51-基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)-4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰胺ld-2
[0734][0735]
第一步
[0736]
(9h-芴-9-基)甲基((5r,13s)-13-苄基-1-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)-5-环丙基-4,9,12,15,18-五氧代-6-氧杂
ꢀ‑
3,8,11,14,17-七氮杂十九烷-19-基)氨基甲酸酯ld-2b
[0737]
将1(15mg,0.015mmol)置于反应瓶中，加二氯甲烷(1.0ml)和甲醇(0.1ml)溶解，降至0℃后加(11s,19r)-11-苄基-19-环丙基-1-(9h-芴-9-基)-3,6,9,12,15-五氧代
ꢀ‑
2,18-二氧杂-4,7,10,13,16-五氮杂二十-20-酸ld-2a(13mg,0.019mmol，参照专利“wo2020063676”中说明书第80页的实施例18提供的方法合成)，三乙胺(7.0mg, 0.070mmol)和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(6.8mg,0.023mmol, 购于韶远)，氮气保护后，升至室温搅拌30分钟，旋干浓缩，所得残余物用薄层硅胶色谱法以洗脱剂体系b纯化，得到标题产物ld-2b(14mg，产率：55.3％)。
[0738]
ms m/z(esi):1637.5[m+1]。
[0739]
第二步
[0740]
n-((4-(((r)-1-((s)-1-((39s,47r)-39-苄基-47-环丙基-1-((1r,4r)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢
ꢀ‑
1h-吡咯-1-基)甲基)环己基)-1,31,34,37,40,43,48-七氧代
ꢀ‑
5,8,
11,14,17,20,23,26,29,46-十氧杂-2,32,35,38,41,44,49-七氮杂五十一烷-51-基)吡咯烷-2-基)-3-(苯基硫杂)丙-2-基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯基)磺酰基)-4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰胺ld-2
[0741]
将ld-2b(14mg,0.0085mmol)置于反应瓶中，加入二氯甲烷(0.8ml)和乙二胺 (0.4ml)溶解，氮气保护后在室温下搅拌45分钟，旋干溶剂，用石油醚(1ml*4) 打浆，倒去上清液，所得混合物旋干后，加n,n-二甲基甲酰胺(1ml)溶解，降至0℃后加1-((1r,4r)-4-((2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)甲基)环己基)-1-氧代
ꢀ‑
5,8,11,14,17,20,23,26,29-九氧杂-2-氮杂三十一-31-酸ld-2c(8.9mg,0.013mmol，参照专利“wo2020063676”中说明书第76页的实施例17提供的方法合成)，加 4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(3.8mg,0.013mmol,购于韶远)，加完氮气保护，升至室温反应30分钟。旋干溶剂，所得残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物ld-2(5.0mg，产率：28.0％)。
[0742]
ms m/z(esi):1044.5[m/2+1]。
[0743]
实施例3-3ld-3
[0744]
2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1
‑ꢀ
基)乙基(4-((s)-2-((s)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基)乙烷-1,2-二基二(甲基氨基甲酸酯)ld-3
[0745][0746]
将24(10mg,0.0092mmol)置于反应瓶中，加n,n-二甲基甲酰胺(1ml)和吡啶 (0.2ml)溶解，加4-((s)-2-((s)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)已酰氨基)-3
‑ꢀ
甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰氨基)苄基4-硝基苯甲酸酯ld-3a(8.5mg,0.012mmol, 皓元)，加1-羟基苯并三唑(3.6mg,0.027mmol)，加完后氮气保护，室温下反应过夜。旋干溶剂，所得残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-tprep c18；流动相：水(含10mmol/l的碳酸氢铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度： 44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物ld-3(5.0mg，产率：33.3％)。
[0747]
ms m/z(esi):1683.6[m+1]。
[0748]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.97(s,1h),8.14-8.02(m,2h),7.98(d,1h), 7.79(d,1h),7.67(d,2h),7.58(dd,3h),7.47(d,2h),7.42(td,1h),7.37-7.20(m,6h), 7.19-7.10(m,2h),6.99(s,2h),6.92(br,1h),6.75(d,2h),5.97(t,1h),5.40(s,2h), 5.21(d,1h),5.00-4.90(m,2h),4.37(q,1h),4.30(dd,1h),4.18(t,1h),4.13-3.88(m, 4h),3.76(d,1h),3.59(d,1h),3.34-3.12(m,4h),3.05-2.99(m,1h),2.95-2.90(m, 1h),2.88-2.68(m,6h),2.66-2.57(m,2h),2.24-2.05(m,4h),2.03-1.79(m,5h), 1.73-1.55(m,4h),1.52-1.04(m,16h),1.00(d,1h),0.82(dd,7h)。
[0749]
实施例3-4ld-4
[0750]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2
‑ꢀ
基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)(环丙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-5-((s)-2-((s)-2-(2-((3s,5s)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-5-((2
‑ꢀ
磺酸基乙氧基)甲基)吡咯烷-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2-羧酸ld-4
[0751][0752]
第一步
[0753]
(2s,3s,4r,5s,6s)-2-(5-((s)-2-((s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)-2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)(环丙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯乙基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯ld-4a
[0754]
将化合物18(19mg,0.019mmol)和ld-1g(21mg,0.021mmol)置于反应瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)溶解，加入n,n-二异丙基乙胺(7.3mg,0.056mmol) 和n-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(0.5mg,0.0037mmol，购于韶远)，氮气保护后，在室温下反应过夜。将反应瓶置
于冰水浴中，加饱和碳酸氢钠水溶液(3ml)，加乙酸乙酯(5ml)稀释，两相分离后有机相用饱和氯化钠水溶液洗(2ml*3),用无水硫酸钠干燥，过滤后将滤液旋干，所得残余物用硅胶柱色谱法以洗脱剂体系b纯化，得到标题产物ld-4a(21mg，产率：58.9％)。
[0755]
ms m/z(esi):1895.6[m+1]。
[0756]
第二步
[0757]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(5-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)-2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶
ꢀ‑
1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基) 吡咯烷-1-基)乙基)(环丙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2-羧酸ld-4b
[0758]
将ld-4a(21mg,0.011mmol)置于反应瓶中，加入四氢呋喃(1.2ml)，叔丁醇 (0.4ml)，水(0.4ml)，加入氢氧化锂一水合物(5.0mg,0.12mmol)，室温下反应1 小时，旋干溶剂，所得残余物用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-tprep c18；流动相：水(含10mmol/l的乙酸铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度： 44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，减压浓缩得到标题产物ld-4b(8.0 mg，产率：47.1％)。
[0759]
ms m/z(esi):1533.5[m+1]。
[0760]
第三步
[0761]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2
‑ꢀ
基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)(环丙基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-5-((s)-2-((s)-2-(2-((3s,5s)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-5-((2
‑ꢀ
磺酸基乙氧基)甲基)吡咯烷-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2-羧酸ld-4
[0762]
将ld-1f(5.2mg,0.014mmol)置于反应瓶中，加n,n-二甲基甲酰胺(0.5ml)溶解，加n,n-二异丙基乙胺(5.4mg,0.042mmol)，2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(4.1mg,0.014mmol)，氮气保护后室温下搅拌2小时，将上述反应液加入到ld-4b(7.5mg,0.0046mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(0.5ml)溶液中，氮气保护后搅拌过夜。反应液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prepc18；流动相：水(含10mmol/l的乙酸铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，得到标题产物ld-4(4.8mg，产率：55.6％)。
[0763]
ms m/z(esi):946.4[m/2+1]。
[0764]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ12.00(br,1h),9.94(s,1h),9.39(br,1h),8.28 (d,1h),8.15(s,1h),8.01(dd,1h),7.79(d,1h),7.67(d,2h),7.57(d,1h),7.53
–
7.38 (m,5h),7.37
–
7.17(m,8h),7.17
–
7.07(m,3h),7.06(s,1h),7.01(br,1h),6.99(s, 1h),6.82(d,2h),6.65(br,1h),5.23(d,1h),5.18(br,1h),5.11
–
4.95(m,3h),4.39
–ꢀ
4.32(m,1h),4.28(dd,1h),4.24
–
4.10(m,2h),4.05(d,1h),3.92(d,1h),3.89
–
3.77 (m,2h),3.75
–
3.60(m,3h),3.59
–
3.45(m,4h),3.18
–
2.90(m,6h),2.85
–
2.55(m, 7h),2.39
–
2.28(m,2h),2.21
–
1.77(m,9h),1.76
–
1.40(m,5h),1.36
–
1.18(m,6h), 1.16(t,1h),1.12
–
0.95(m,3h),0.93
–
0.78(m,5h),0.76
–
0.67(m,2h),0.60(d, 3h)。
3.59(m,5h),3.56-3.45(m,5h),3.17-3.05(m,4h),2.96-2.89(m,2h), 2.80-2.69(m,3h),2.66-2.58(m,3h),2.41-2.32(m,2h),2.16(t,2h),2.07-1.92(m, 5h),1.92-1.85(m,2h),1.69-1.49(m,4h),1.48-1.43(m,2h),1.34-1.26(m,4h), 1.16-1.05(m,2h),1.00(d,2h),0.94-0.78(m,6h)。
[0782]
实施例3-6ld-6
[0783]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2
‑ꢀ
基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)(3,3-二氟环丁基)氨基羰基)氧基)甲基)-5-((s)-2-((s)-2-(2-((3s,5s)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-5-((2
‑ꢀ
磺酸基乙氧基)甲基)吡咯-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯乙基)-3,4,5
‑ꢀ
三羟基四氢-2h-吡喃-2-羧酸ld-6
[0784][0785]
第一步
[0786]
(2s,3s,4r,5s,6s)-2-(5-((s)-2-((s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)-2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基) 甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰
基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)(3,3-二氟环丁基)氨基羰基)氧基)甲基)苯乙基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯ld-6a
[0787]
将化合物12(35mg,0.033mmol)和ld-1g(68mg,0.066mmol)置于反应瓶中，加入3ml n-甲基吡咯烷酮溶解，加入吡啶(8mg,0.10mmol)和n-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(0.9mg,0.007mmol)，搅拌反应16小时后补加吡啶(8mg,0.10mmol)和n
‑ꢀ
羟基-7-氮杂苯并三氮(0.9mg,0.007mmol)，每隔8小时加入n-羟基-7-氮杂苯并三氮(0.9mg,0.008mmol)，共反应40小时。反应液中加入水(50ml)，用乙酸乙酯萃取(8ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(10ml
×
3),有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，所得残余物用薄层色谱法以洗脱剂体系a纯化，得到标题产物ld-6a(50mg，产率：77.8％)。
[0788]
ms m/z(esi):1945.8[m+1]。
[0789]
第二步
[0790]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(5-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)-2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶
ꢀ‑
1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基) 吡咯烷-1-基)乙基)(3,3-二氟环丁基)氨基羰基)氧基)甲基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢
ꢀ‑
2h-吡喃-2-羧酸ld-6b
[0791]
将ld-6a(50mg,0.026mmol)溶于四氢呋喃(1.2ml)中，加入叔丁醇(0.4ml) 和水(0.4ml)，加入氢氧化锂一水合物(21mg,0.51mmol)，搅拌反应1小时，反应液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含 10mmol/l的乙酸铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，得到标题产物ld-6b(20mg，产率：49.1％)。
[0792]
ms m/z(esi):1583.2[m+1]。
[0793]
第三步
[0794]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2
‑ꢀ
基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)(3,3-二氟环丁基)氨基羰基)氧基)甲基)-5-((s)-2-((s)-2-(2-((3s,5s)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-5-((2
‑ꢀ
磺酸基乙氧基)甲基)吡咯烷-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2-羧酸ld-6
[0795]
将ld-1f(15.8mg,0.042mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(1ml)中，加入n,n-二异丙基乙胺(27mg,0.21mmol)，将2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(11 mg,0.038mmol)分两批加入，两批间隔30分钟，搅拌反应2小时。将上述反应液加入到ld-6b(20mg,0.013mmol)和n,n-二异丙基乙胺(8mg,0.063mmol)的n,n
‑ꢀ
二甲基甲酰胺(1ml)溶液中，搅拌反应16小时。反应液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的乙酸铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，得到标题产物ld-6(10mg，产率：40.8％)。
[0796]
ms m/z(esi):1941.7[m+1]。
[0797]1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.96(s,1h),8.29(d,1h),8.10(s,1h),7.99(d, 1h),7.78(d,1h),7.67(d,2h),7.58(d,1h),7.53-7.38(m,4h),7.36-7.27(m,3h), 7.26-7.16
(m,3h),7.16-7.11(m,2h),7.07(s,1h),6.98(br,1h),6.82-6.72(m,2h), 6.65(br,1h),5.75(s,1h),5.37-5.28(m,2h),5.22(d,1h),5.10-4.97(m,3h),4.78(t, 2h),4.36(t,1h),4.32-4.27(m,1h),4.21(t,1h),4.13-3.98(m,3h),3.91(d,1h), 3.87-3.73(m,2h),3.72-3.57(m,3h),3.57-3.44(m,6h),3.19-3.02(m,5h),2.98-2.89 (m,2h),2.85-2.69(m,5h),2.67-2.58(m,3h),2.41-2.30(m,3h),2.15(t,2h),2.07(d, 1h),2.05-1.93(m,5h),1.92-1.85(m,2h),1.69-1.50(m,4h),1.49-1.40(m,2h), 1.34-1.27(m,4h),1.17-1.05(m,2h),1.00(d,2h),0.92-0.77(m,6h)。
[0798]
实施例3-7ld-7
[0799]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2
‑ꢀ
基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)(2-异丙氧基-2-氧代乙基)氨基羰基)氧基) 甲基)-5-((s)-2-((s)-2-(2-((3s,5s)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代
ꢀ‑
5-((2-磺酸基乙氧基)甲基)吡咯烷-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2-羧酸ld-7
[0800][0801]
第一步
[0802]
(2s,3s,4r,5s,6s)-2-(5-((s)-2-((s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)-2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基) 甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)(2-异丙氧基-2-氧代乙基)氨基羰基)氧基)甲基)苯乙基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯ld-7a
[0803]
将化合物31(25mg,0.023mmol)和ld-1g(36mg,0.035mmol)置于反应瓶中，加入2ml n-甲基吡咯烷酮溶解，加入n,n-二异丙基乙胺(9mg,0.07mmol)和n-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(0.6mg,0.005mmol)，搅拌反应16小时。反应液中加入水(50 ml)，用乙酸乙酯萃取(8ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(10ml
×
3), 有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，所得残余物用薄层色谱法以洗脱剂体系a 纯化，得到标题产物ld-7a(40mg，产率：87.5％)。
[0804]
ms m/z(esi):1955.3[m+1]。
[0805]
第二步
[0806]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(5-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)-2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2-基)(羟基)甲基)哌啶
ꢀ‑
1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基) 吡咯烷-1-基)乙基)(2-异丙氧基-2-氧代乙基)氨基羰基)氧基)甲基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2-羧酸ld-7b
[0807]
将ld-7a(30mg,0.015mmol)溶于四氢呋喃(1ml)中，加入水(0.5ml)，加入氢氧化锂一水合物(6mg,0.15mmol)，搅拌反应1小时，反应液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的乙酸铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，得到标题产物ld-7b(2.7mg，产率：11.0％)。
[0808]
ms m/z(esi):1593.2[m+1]。
[0809]
第三步
[0810]
(2s,3s,4r,5r,6s)-6-(2-((((2-((s)-2-((r)-2-((4-(n-(4-(4-((r)-(4'-氯-[1,1'-联苯基]-2
‑ꢀ
基)(羟基)甲基)哌啶-1-基)苯甲酰基)氨基磺酰基)-2-((三氟甲基)磺酰基)苯基)氨基)-3-(苯基硫杂)丙基)吡咯烷-1-基)乙基)(2-异丙氧基-2-氧代乙基)氨基羰基)氧基) 甲基)-5-((s)-2-((s)-2-(2-((3s,5s)-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代
ꢀ‑
5-((2-磺酸基乙氧基)甲基)吡咯烷-1-基)乙酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苯乙基)-3,4,5-三羟基四氢-2h-吡喃-2-羧酸ld-7
[0811]
将ld-1f(2.1mg,0.006mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺(0.3ml)中，加入n,n-二异丙基乙胺(3.6mg,0.028mmol)，将2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯 (1.5mg,0.005mmol)分两批加入，两批间隔30分钟，搅拌反应2小时。将上述反应液加入到ld-7b(2.7mg,0.002mmol)和n,n-二异丙基乙胺(1mg,0.008mmol)的 n,n-二甲基甲酰胺(0.3ml)溶液中，搅拌反应16小时。反应液用高效液相色谱法纯化(分离条件：色谱柱：sharpsil-t prep c18；流动相：水(含10mmol/l的乙酸铵)；流动相b：乙腈；20分钟梯度：44％-64％，流速：30ml/min)，收集相应组分，得到标题产物ld-7(1mg，产率：30.2％)。
[0812]
ms m/z(esi):1951.5[m+1]。
[0813]
三、adc制备实施例
[0814]
adc载药量测定
[0815]
用反相高效液相色谱(rp-hplc)测定adc的载药量。
[0816]
1、测定方法：
[0817]
裸抗和待测样品adc(浓度为1mg/ml)，加入4μlddt(sigma)还原，37℃水浴1小时，结束后取出到内插管中。使用高效液相色谱仪agilent 1200进行检测，色谱柱选用agilent plrp-s 1000a 8μm 4.6*250mm，柱温：80℃；dad检测器波长280nm；流速：1ml/分钟；进样量为：40μl；之后通过样品与裸抗的谱图比对，区分出轻重链的位置，然后对检测样品的谱图进行积分，计算出dar值。
[0818]
2、溶液配制
[0819]
1)0.25m dtt溶液：
[0820]
2)流动相a(0.1％tfa水溶液)：
[0821]
3)流动相b(0.1％tfa乙腈溶液)：
[0822]
3、数据分析
[0823]
通过样品与裸抗的谱图比对，区分出轻重链的位置，然后对检测样品的谱图进行积分，计算出载药量dar值。
[0824]
计算公式如下：
[0825]
名称连接药物数lc0lc+12hc0hc+12hc+24hc+36
[0826]
lc峰面积总和＝lc峰面积+lc+1峰面积
[0827]
hc峰面积总和＝hc峰面积+hc+1峰面积+hc+2峰面积+hc+3峰面积
[0828]
lc dar＝σ(连接药物数*峰面积百分比)/lc峰面积总和
[0829]
hc dar＝σ(连接药物数*峰面积百分比)/hc峰面积总和
[0830]
dar＝lc dar+hc dar
[0831]
实施例4-1 adc-1
[0832][0833]
在37℃条件下，向抗体1f9ds的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的pbs 缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.5ml，33.8nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，5.4μl，54nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
[0834]
将化合物ld-1(0.5mg，270.2nmol)溶解于20μl dmso中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用sephadexg25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m 的edta)，得到通式tm-4-1的示例性产物adc-1的pbs缓冲液(0.39mg/ml，10.3 ml)，于4℃储存。
[0835]
rp-hplc计算平均值：y＝3.0。
[0836]
实施例4-2 adc-2
[0837][0838]
在37℃条件下，向抗体1f9ds的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的pbs 缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.43ml，28.8nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，7.6μl，76nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
[0839]
将化合物ld-2(0.6mg，287.7nmol)溶解于20μl dmso中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用sephadexg25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m 的edta)，得到通式tm-4-2的示例性产物adc-2的pbs缓冲液(0.31mg/ml，11.4 ml)，于4℃储存。
[0840]
rp-hplc计算平均值：y＝2.17。
[0841]
实施例4-3 adc-3
[0842][0843]
在37℃条件下，向抗体1f9ds的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的pbs 缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.25ml，16.9nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，5.9μl，59nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
[0844]
将化合物ld-3(0.5mg，297.2nmol)溶解于15μl dmso中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应24小时，停止反应。将反应液用 sephadex g25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m的edta)，得到通式tm-4-3的示例性产物adc-3的pbs缓冲液(6.24 mg/ml，0.33ml)，于4℃储存。
[0845]
rp-hplc计算平均值：y＝0.79。
[0846]
实施例4-4 adc-4
[0847][0848]
在37℃条件下，向抗体pd3的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的pbs 缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.55ml，37.2nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，6μl，60nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
[0849]
将化合物ld-4(0.56mg，296.2nmol)溶解于25μl dmso中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用 sephadex g25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m的edta)，得到通式tm-4-4的示例性产物adc-4的pbs缓冲液(0.53 mg/ml，10.8ml)，于4℃储存。
[0850]
ms计算平均值：y＝1.49。
[0851]
实施例4-5 adc-5
[0852][0853]
在37℃条件下，向抗体pd3的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的pbs 缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.54ml，36.5nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，6.6μl，66nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃，使用0.2mol/l的盐酸调节ph至5.0。
[0854]
将化合物ld-4(0.55mg，290.9nmol)溶解于30μl dmso中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用 sephadex g25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m的edta)，得到通式tm-4-4的示例性产物adc-5的pbs缓冲液(5.73 mg/ml，0.95ml)，于4℃储存。
[0855]
ms计算平均值：y＝1.77。
[0856]
实施例4-6 adc-6
[0857][0858]
在37℃条件下，向抗体1f9ds的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的pbs 缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.7ml，47.3nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，8.5μl，85nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
[0859]
将化合物ld-5(0.7mg，365.6nmol)溶解于35μl dmso中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用sephadexg25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m 的edta)，得到通式tm-4-5的示例性产物adc-6的pbs缓冲液(2.21mg/ml，1.3 ml)，于4℃储存。
[0860]
ms计算平均值：y＝2.35。
[0861]
实施例4-7 adc-7
[0862][0863]
在37℃条件下，向抗体pd3的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的pbs 缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.7ml，47.3nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，8.5μl，85nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
[0864]
将化合物ld-5(0.7mg，365.6nmol)溶解于35μl dmso中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用sephadexg25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m 的edta)，得到通式tm-4-6的示例性产物adc-7的pbs缓冲液(4.69mg/ml，1.1 ml)，于4℃储存。
[0865]
ms计算平均值：y＝1.92。
[0866]
实施例4-8 adc-8
[0867][0868]
在37℃条件下，向抗体pd3的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的pbs 缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.6ml，40.5nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，7.3μl，73nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃，使用0.2mol/l的盐酸调节ph至5.5。
[0869]
将化合物ld-5(0.59mg，308.2nmol)溶解于30μl dmso中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用 sephadex g25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m的edta)，得到通式tm-4-6的示例性产物adc-8的pbs缓冲液(2.42 mg/ml，1.86ml)，于4℃储存。
[0870]
ms计算平均值：y＝1.9。
[0871]
实施例4-9 adc-9
[0872][0873]
在37℃条件下，向抗体mirzotamab的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的 pbs缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.65ml，43.9nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基) 膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，8.5μl，85nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
[0874]
将化合物ld-4(0.66mg，349.1nmol)溶解于30μl dmso中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用 sephadex g25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m的edta)，得到通式tm-4-7的示例性产物adc-9的pbs缓冲液(0.56 mg/ml，11.5ml)，于4℃储存。
[0875]
ms计算平均值：y＝1.84。
[0876]
实施例4-10 adc-10
[0877][0878]
在37℃条件下，向抗体mirzotamab的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的 pbs缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.7ml，47.3nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，8.5μl，85nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
[0879]
将化合物ld-5(0.7mg，365.6nmol)溶解于35μl dmso中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用sephadexg25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m 的edta)，得到通式tm-4-8的示例性产物adc-10的pbs缓冲液(1.97mg/ml，1.7ml)，于4℃储存。
[0880]
ms计算平均值：y＝2.26。
[0881]
实施例4-11 adc-11
[0882][0883]
在37℃条件下，向抗体1f9ds的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的pbs 缓冲水溶液；10.0mg/ml，0.33ml，22.3nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，5.9μl，59nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
[0884]
将化合物ld-5(0.34mg，177.6nmol)溶解于15μl dmso中，均分为2份间隔5分钟加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用sephadex g25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相：ph为6.5的0.05m 的pbs缓冲水溶液，含0.001m的edta)，得到通式tm-4-5的示例性产物adc-11 的pbs缓冲液(0.16mg/ml，10.5ml)，于4℃储存。
[0885]
ms计算平均值：y＝3.86。
[0886]
实施例4-12adc-12
[0887][0888]
在37℃条件下，向抗体1f9ds的pbs缓冲水溶液(ph＝6.5的0.05m的pbs 缓冲水溶液；10.0mg/ml，1.1ml，74.3nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep-hcl)的水溶液(10mm，13.4μl，134nmol)，置于水浴振荡器，于37℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用水浴降温至25℃。
[0889]
将化合物ld-6(0.54mg，278.3nmol)溶解于50μl dmso中，均分为2份间隔5分钟加入到上述反应液中，加入到上述反应液中，置于水浴振荡器，于25℃下振荡反应3小时，停止反应。将反应液用sephadex g25凝胶柱脱盐纯化(洗脱相： ph为6.5的0.05m的pbs缓冲水溶液，含0.001m的edta)，得到通式tm-4-9 的示例性产物adc-12的pbs缓冲液(0.94mg/ml，10.8ml)，于4℃储存。
[0890]
ms计算平均值：y＝2.0。
[0891]
生物学评价
[0892]
测试例1、本披露化合物对bcl-xl结合活性的测定
[0893]
体外bcl-xl结合活性通过以下的方法进行测试。
[0894]
本实验使用的试剂：his标签bcl-xl蛋白(r&d，货号894-bx-050)；生物素标记的bim蛋白(r&d，货号3526/1)；结合缓冲液(cisbio，货号62dlbddf)；检测缓冲液(cisbio，货号62db1fdg)；标记铕穴状化合物抗6his抗体(cisbio，货号 61hi2kla)；亲和链霉素链接xl665(cisbio，货号611saxla)。
[0895]
以下所述的体外结合实验可测定受试化合物对bcl-xl结合活性。将测试化合物溶解于二甲亚砜中，并根据实验需要稀释至各浓度梯度，再将用二甲亚砜配制各浓度化合物100倍稀释于结合缓冲液中；用结合缓冲液将bcl-xl稀释至相应的浓度，4μl/孔加入白色384孔板中，再将稀释好的测试化合物2μl/孔加入白色384 孔板中，混合均匀后在25℃孵育1小时。用结合缓冲液将生物素标记的bim蛋白稀释至相应的浓度，4μl/孔加入白色384孔板中，混合均匀后在25℃孵育2小时。用检测缓冲液将标记铕穴状化合物抗6his抗体和亲和链霉素链接xl665分别稀释至相应的浓度，然后各取5μl/孔加入到白色384孔板中，混合均匀后在25℃孵育 2-4小时。用酶标仪(bmg labtech，型号pherastar fs)中htrf程序读取信号值。
[0896]
测试结果见表1。
[0897]
表1.本披露化合物对bcl-xl结合活性
[0898][0899][0900]
结论：本披露化合物与bcl-xl结合活性较高。
[0901]
测试例2：本披露化合物对bcl-2结合活性的测定
[0902]
体外bcl-2结合活性通过以下的方法进行测试。
[0903]
本实验使用的试剂：his标签bcl-2蛋白(r&d，货号827-bc-050)；生物素标记的bim蛋白(r&d，货号3526/1)；结合缓冲液(cisbio，货号62dlbddf)；检测缓冲液(cisbio，货号62db1fdg)；标记铕穴状化合物抗6his抗体(cisbio，货号61hi2kla)；亲和链霉素链接xl665(cisbio，货号611saxla)。
[0904]
使用材料：白色384孔板(corning，4513)
[0905]
以下所述的体外结合实验可测定受试化合物对bcl-2结合活性。将测试化合物溶解于二甲亚砜中，并根据实验需要稀释至各浓度梯度，再将用二甲亚砜配制各浓度化合物100倍稀释于结合缓冲液中；用结合缓冲液将bcl-2稀释至相应的浓度，4μl/孔加入白色384孔板中，再将稀释好的测试化合物2μl/孔加入白色384 孔板中，混合均匀后在25℃孵育1小时。用结合缓冲液将生物素标记的bim蛋白稀释至相应的浓度，4μl/孔加入白色384孔板中，混合均匀后在25℃孵育2小时。用检测缓冲液将标记铕穴状化合物抗6his抗体和亲和链霉素链接xl665分别稀释至相应的浓度，然后各取5μl/孔加入到白色384孔板中，混合均匀后在25℃孵育 2-4小时。用酶标仪(bmg labtech，型号pherastar fs)中htrf程序读取信号值。测试结果见表2。
[0906]
表2.本披露化合物对bcl-2结合活性
[0907]
化合物编号ki(nm)10.01430.03240.00750.00560.00570.00980.00790.009100.007110.006120.016130.002140.014150.024160.014170.020180.015190.016200.012220.061230.006240.004
250.004260.007270.028280.010290.006300.015310.023320.009330.013340.016350.015360.007370.010380.016
[0908] 结论：本披露化合物与bcl-2结合活性较高。
[0909]
测试例3：本披露化合物对rs4；11细胞和nci-h146细胞增殖抑制活性的测定
[0910]
体外rs4；11细胞和nci-h146细胞增殖抑制活性通过以下的方法进行测试。
[0911]
本实验使用的试剂：rpmi-1640培养基(hyclone，货号sh30243018)；胎牛血清(gibco，货号10099-141)；胰酶(gibco，货号25200-072)；cell titer-glo (promega，货号g7571)。
[0912]
使用材料：rs4；11细胞(南京科佰生物科技有限公司，货号cbp60641)； nci-h146细胞(atcc，货号htb-173)。
[0913]
以下所述的体外细胞增殖实验可测定受试化合物对rs4；11细胞和nci-h146 细胞增殖抑制活性。
[0914]
rs4；11细胞(或nci-h146细胞)培养在含10％fbs的rpmi-1640培养基中，一周传代2～3次，传代比列1:3或1:5。传代时，将细胞转至离心管中，1200rpm 离心3分钟，弃去上清培养基残液，加入新鲜培养基重悬细胞。在96孔细胞培养板中加入90μl的细胞悬液，rs4；11细胞和nci-h146细胞密度为2.22
×
105细胞 /ml，96孔板外围只加入100μl的完全培养基。将培养板在培养箱培养24小时 (37℃，5％co2)。
[0915]
根据实验需要将待测样品用二甲亚砜稀释成合适的浓度梯度；取配制成梯度浓度的待测化合物溶液5μl加入到95μl新鲜培养基中混匀，再向细胞培养板中加入10μl上述含化合物的培养基溶液。将细胞培养板在培养箱孵育3天(37℃， 5％co2)。在96孔细胞培养板中，每孔加入50μl celltiter-glo试剂，室温避光放置5-10分钟，用酶标仪(bmg labtech，型号pherastar fs)读取化学发光信号值，数据使用graphpad软件处理。结果见表3。
[0916]
表3.本披露化合物对rs4；11细胞和nci-h146细胞增殖抑制活性ic
50
(nm)
[0917][0918]
[0919]
结论：本披露化合物对rs4；11细胞和nci-h146细胞有较高的增殖抑制活性。
[0920]
测试例4：本披露adc分子对rs4；11细胞和nci-h146细胞增殖抑制活性的测定
[0921]
体外rs4；11细胞和nci-h146细胞增殖抑制活性通过以下的方法进行测试。
[0922]
本实验使用的试剂：rpmi-1640培养基(hyclone，货号sh30243018)；胎牛血清(gibco，货号10099-141)；胰酶(gibco，货号25200-072)；cell titer-glo (promega，货号g7571)。
[0923]
使用材料：rs4；11细胞(南京科佰生物科技有限公司，货号cbp60641)； nci-h146细胞(atcc，货号htb-173)。
[0924]
以下所述的体外细胞增殖实验可测定受试adc分子对rs4；11细胞和 nci-h146细胞增殖抑制活性。
[0925]
rs4；11细胞(或nci-h146细胞)培养在含10％fbs的rpmi-1640培养基中，一周传代2～3次，传代比列1:3或1:5。传代时，将细胞转至离心管中，1200rpm 离心3分钟，弃去上清培养基残液，加入新鲜培养基重悬细胞。在96孔细胞培养板中加入180μl的细胞悬液，rs4；11细胞和nci-h146细胞密度为4.44
×
104细胞 /ml，96孔板外围只加入200μl的完全培养基。将培养板在培养箱培养24小时 (37℃，5％co2)。
[0926]
根据实验需要将待测adc分子用pbs稀释成合适的浓度梯度；取配制成梯度浓度的待测样品溶液5μl加入到95μl新鲜培养基中混匀，再向细胞培养板中加入 20μl上述含adc的培养基溶液。将细胞培养板在培养箱孵育6天(37℃，5％co2)。在96孔细胞培养板中，每孔加入100μl celltiter-glo试剂，室温避光放置5-10 分钟，用酶标仪(bmg labtech，型号pherastar fs)读取化学发光信号值，数据使用graphpad软件处理。结果见表4：
[0927]
表4.本披露adc分子对rs4；11细胞和nci-h146细胞增殖抑制活性
[0928][0929]
结论：本披露adc分子对rs4；11细胞和nci-h146细胞有较高的增殖抑制活性。

技术特征：
1.一种通式(d)所示的化合物或其可药用的盐：其中：r1选自氢原子、卤素、羟烷基、羟基、烷基、烷氧基、氘代烷基、环烷基、杂环基、-c(o)-烷基、芳基和杂芳基；所述的烷基、-c(o)-烷基、环烷基和杂环基各自独立地任选进一步被一个或多个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、烷基、氘代烷基、环烷基、羟基、-c(o)nr
11
r
12
、-c(o)or
13
、烷氧基、芳基和杂芳基；r
11
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；r
12
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；r
13
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；l1选自亚烷基、亚烷基-o-c(o)-n(r
14
)-亚烷基和亚烷基-n(r
15
)-c(o)-亚烷基；r
14
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；r
15
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；各个x相同或不同，各自独立地选自碳原子、氧原子、硫原子和氮原子，m选自0，1，2和3；各个r2相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、氘代烷基和烷基，t1选自1、2、3和4；r3选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，r4选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，各个r5相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t2选自1、2、3、4和5；各个r6相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t3选自1、2、3和4；各个r7相同或不同，选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t4选自1、2、3和4；r8选自烷基、氨基、羟基、烷氧基和磷酸烷氧基；各个r9相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t5选自1、2、3和4；
各个r
10
相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t6选自1、2、3、4和5。2.根据权利要求1所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的x为碳原子；m选自1，2和3。3.根据权利要求1或2任一项所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的r2，r3，r4，r5，r6，r7和r9各自独立地选自氢原子和c
1-6
烷基。4.根据权利要求1至3任一项所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其为通式(d-i)所示的化合物：或其可药用的盐，其中l1，r1，r8和r
10
如权利要求1中所定义。5.根据权利要求1至4任一项所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其为通式(d-ii)或通式(d-iii)所示的化合物：或其可药用的盐，其中l1，r1，r8和r
10
如权利要求1中所定义。6.根据权利要求1至5任一项所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的l1选自c
1-6
亚烷基、c
1-6
亚烷基-o-c(o)-n(r
14
)-c
1-6
亚烷基和c
1-6
亚烷基-n(r
15
)-c(o)-c
1-6
亚烷基，r
14
为氢原子或c
1-6
烷基，r
15
为氢原子；优选地，l1为c
1-6
亚烷基；更优选地，l1为-ch
2-ch
2-。
7.根据权利要求1至6任一项所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的r1选自氢原子、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、-c(o)-c
1-6
烷基和苯基；所述的c
1-6
烷基、-c(o)-c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基各自独立地任选进一步被1至3个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、羟基、-c(o)nr
11
r
12
、-c(o)or
13
、苯基和5元至10元杂芳基；r
11
为氢原子或c
1-6
烷基；r
12
为氢原子或c
1-6
烷基；r
13
为氢原子或c
1-6
烷基；优选地，r1选自氢原子、c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基；所述的c
1-6
烷基任选进一步被1至3个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、c
3-6
环烷基、羟基、-c(o)nr
11
r
12
、-c(o)or
13
、苯基、噻唑基和吡啶基；r
11
为氢原子或c
1-6
烷基；r
12
为氢原子或c
1-6
烷基；r
13
为氢原子或c
1-6
烷基。8.根据权利要求1至7任一项所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的r
10
为卤素或卤代c
1-6
烷基，优选为氯原子。9.根据权利要求1至8任一项所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其中所述的r8选自羟基和磷酸c
1-6
烷氧基，优选为羟基。10.根据权利要求1至9任一项所述的通式(d)所示的化合物或其可药用的盐，其选自：
11.一种通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐：其中：r1选自氢原子、卤素、羟烷基、羟基、烷基、烷氧基、氘代烷基、环烷基、杂环基、-c(o)-烷基、芳基和杂芳基；所述的烷基、-c(o)-烷基、环烷基和杂环基各自独立地任选进一步被一个或多个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、烷基、氘代烷基、环烷基、羟基、-c(o)nr
11
r
12
、-c(o)or
13
、烷氧基、芳基和杂芳基；r
11
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；
r
12
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；r
13
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；l1选自亚烷基、亚烷基-o-c(o)-n(r
14
)-亚烷基和亚烷基-n(r
15
)-c(o)-亚烷基；r
14
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；r
15
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；各个x相同或不同，各自独立地选自碳原子、氧原子、硫原子和氮原子，m选自0，1，2和3；各个r2相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、氘代烷基和烷基，t1选自1、2、3和4；r3选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，r4选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，各个r5相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t2选自1、2、3、4和5；各个r6相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t3选自1、2、3和4；各个r7相同或不同，选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t4选自1、2、3和4；r8选自烷基、氨基、羟基、烷氧基和磷酸烷氧基；各个r9相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t5选自1、2、3和4；各个r
10
相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t6选自1至2，3，4和5；y为约1至约10；pc为配体；l为接头单元。12.根据权利要求11所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的x为碳原子；m选自1，2和3。13.根据权利要求11或12所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的r2，r3，r4，r5，r6，r7和r9各自独立地选自氢原子和c
1-6
烷基。14.根据权利要求11至13任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其为通式(pc-l-d-i)所示的化合物：
或其可药用的盐，其中pc，l，l1，y，r1，r8和r
10
如权利要求11中所定义。15.根据权利要求11至14任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其为通式(pc-l-d-ii)或通式(pc-l-d-iii)所示的化合物：或其可药用的盐，其中pc，l，l1，y，r1，r8和r
10
如权利要求11中所定义。16.根据权利要求11至15任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的l1选自c
1-6
亚烷基、c
1-6
亚烷基-o-c(o)-n(r
14
)-c
1-6
亚烷基和c
1-6
亚烷基-n(r
15
)-c(o)-c
1-6
亚烷基，r
14
为氢原子或c
1-6
烷基，r
15
为氢原子；优选地，l1为c
1-6
亚烷基；更优选地，l1为-ch
2-ch
2-。17.根据权利要求11至16任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的r1选自氢原子、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、-c(o)-c
1-6
烷基和苯基；所述的c
1-6
烷基、-c(o)-c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基各自独立地任选进一步被1至3个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、羟基、-c(o)nr
11
r
12
、-c(o)or
13
、苯基和5元至10元杂芳基；r
11
为氢原子或c
1-6
烷基；r
12
为氢原子或c
1-6
烷基；r
13
为氢原子或c
1-6
烷基；
优选地，r1选自氢原子、c
1-6
烷基和c
3-6
环烷基；所述的c
1-6
烷基任选进一步被1至3个取代基所取代，其中每个取代基独立地选自卤素、c
3-6
环烷基、羟基、-c(o)nr
11
r
12
、-c(o)or
13
、苯基、噻唑基和吡啶基；r
11
为氢原子或c
1-6
烷基；r
12
为氢原子或c
1-6
烷基；r
13
为氢原子或c
1-6
烷基。18.根据权利要求11至17任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的r
10
为卤素或卤代c
1-6
烷基，优选为氯原子。19.根据权利要求11至18任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的r8选自羟基和磷酸c
1-6
烷氧基，优选为羟基。20.根据权利要求11至19任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中y为1至8；优选为2至8。21.根据权利要求11至20任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述pc为抗体。22.根据权利要求11至21任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中所述的配体选自抗her2(erbb2)抗体、抗egfr抗体、抗b7-h3抗体、抗c-met抗体、抗her3(erbb3)抗体、抗her4(erbb4)抗体、抗cd20抗体、抗cd22抗体、抗cd30抗体、抗cd33抗体、抗cd44抗体、抗cd56抗体、抗cd70抗体、抗cd73抗体、抗cd105抗体、抗cea抗体、抗a33抗体、抗cripto抗体、抗epha2抗体、抗g250抗体、抗mucl抗体、抗lewis y抗体、抗vegfr抗体、抗gpnmb抗体、抗integrin抗体、抗psma抗体、抗tenascin-c抗体、抗trop-2抗体、抗cd79b抗体、抗slc44a4抗体和抗mesothelin抗体。23.根据权利要求11至22任一项所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中接头单元-l-为-l
a-l
b-l
c-l
d-，l
a
选自选自和-c(o)-w-c(o)-，其中w选自c
1-6
亚烷基和c
1-6
亚烷基-c
3-6
环烷基，其中所述的c
1-6
亚烷基和c
1-6
亚烷基-c
3-6
环烷基各自独立地任选进一步被选自卤素、氧代基、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基、-ch
2-o-亚烷基-so3h和c
3-6
环烷基中的一个或多个取代基所取代；所述的r
w
为-o-ch2ch2so3h或-nh-c(o)-(ch2ch2o)p
0-ch3，其中p0为1至20的整数；l
b
选自-nh(ch2ch2o)p1ch2ch2c(o)-、-nh(ch2ch2o)p1ch2c(o)-、-s(ch2)p1c(o)-和化学键，其中p1为1至20的整数；l
c
为由2至7个氨基酸残基构成的肽残基，其中所述的氨基酸残基选自苯丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、丝氨酸、谷氨酸和天冬氨酸中的氨基酸形成的氨基酸残基，并任选进一步被选自卤素、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、氯代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基
和c
3-6
环烷基中的一个或多个取代基所取代；l
d
选自-nh-r
a-ch2o-c(o)-、-nh-ch2o-r
b-c(o)-和化学键；r
a
为芳基或杂芳基，所述的芳基或杂芳基任选进一步被选自卤素、氧代基、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、卤代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基、c
1-6
烷氧基和-c
1-6
亚烷基-糖的一个或多个取代基所取代；r
b
选自c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基和c
3-6
杂环基，所述的c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基或c
3-6
杂环基任选进一步被选自卤素、氧代基、羟基、氰基、氨基、c
1-6
烷基、c
3-6
环烷基、c
3-6
杂环基、卤代c
1-6
烷基、氘代c
1-6
烷基和c
1-6
烷氧基的一个或多个取代基所取代；其中l
a
的端与配体连接，l
d
与药物连接的。24.根据权利要求23所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中l
a
选自选自其中w为-(ch2)
2-或-(ch2)
5-；r
w
为-o-ch2ch2so3h；其中端与配体相连接。25.根据权利要求23所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中l
b
为-nh(ch2ch2o)p1ch2c(o)-或化学键；其中p1为6至12的整数。26.根据权利要求23所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中l
c
为四肽残基或二肽残基；优选自甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸的四肽残基、缬氨酸-丙氨酸的二肽残基和缬氨酸-瓜氨酸的二肽残基。27.根据权利要求23所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中l
d
选自其中*端与药物相连接。28.根据权利要求23至27所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物或其可药用的盐，其中接头单元-l-选自：
其中端与抗体相连接，*端与药物相连接。29.根据权利要求11所述的通式(pc-l-d)所示的配体-药物偶联物，选自：
所述的ab为抗体，优选自：抗b7h3抗体，其包含如seq id no:1所示的重链和如seq id no:2所示的轻链，抗trop2抗体，其包含如seq id no:3所示的重链和如seq id no:4所示的轻链，和抗b7h3抗体，其包含如seq id no:5所示的重链和如seq id no:6所示的轻链；y为约1至约8。30.一种通式(lu-d)所示的化合物或其可药用的盐：
c(o)nr
11
r
12
、-c(o)or
13
、烷氧基、芳基和杂芳基；r
11
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；r
12
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；r
13
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；l1选自亚烷基、亚烷基-o-c(o)-n(r
14
)-亚烷基和亚烷基-n(r
15
)-c(o)-亚烷基；r
14
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；r
15
选自氢原子、氘原子、烷基和氘代烷基；各个x相同或不同，各自独立地选自碳原子、氧原子、硫原子和氮原子，m选自0，1，2和3；各个r2相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、氘代烷基和烷基，t1选自1、2、3和4；r3选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，r4选自氢原子、羟烷基、氨基、烷基、氘代烷基、环烷基和环烷基烷基，各个r5相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t2选自1、2、3、4和5；各个r6相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t3选自1、2、3和4；各个r7相同或不同，选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t4选自1、2、3和4；r8选自烷基、氨基、羟基、烷氧基和磷酸烷氧基；各个r9相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t5选自1、2、3和4；各个r
10
相同或不同，各自独立地选自氢原子、卤素、烷基、氘代烷基、羟基和烷氧基，t6选自1、2、3、4和5。31.根据权利要求30所述的通式(lu-d)所示的化合物或其可药用的盐，其选自如下所示的化合物：
32.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至10中任意一项所述的通式(d)所示的化合物、或其可药用的盐，或根据权利要求11至29中任意一项所述的配体-药物偶联物或其可药用的盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。33.根据权利要求1至10中任意一项所述的通式(d)所示的化合物、或其可药用的盐，或根据权利要求11至29中任意一项所述的配体-药物偶联物或其可药用的盐，或根据权利要求32所述的药物组合物在制备bcl-2和/或bcl-xl抑制剂中的用途。34.根据权利要求1至10中任意一项所述的通式(d)所示的化合物、或其可药用的盐，或根据权利要求11至29中任意一项所述的配体-药物偶联物或其可药用的盐，或根据权利要求32所述的药物组合物在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途。35.根据权利要求1至10中任意一项所述的通式(d)所示化合物或其可药用的盐，或根据权利要求11至29中任意一项所述的配体-药物偶联物或其可药用的盐，或根据权利要求32所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途，其中所述癌症黑色素瘤、肝癌、肾癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、结肠直肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡中心淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌、子宫颈癌、甲状腺癌、淋巴瘤、肉瘤、成神经细胞瘤、脑瘤、骨髓瘤、星形细胞瘤和胶质瘤。

技术总结
本披露涉及磺酰苯甲酰胺类衍生物及其偶联物、其制备方法及其应用。具体而言，本披露涉及一种具有式(D)所示结构的磺酰苯甲酰胺类衍生物及其偶联物、其制备方法及其应用其制备方法，含有其的药物组合物，以及其通过受体调节在制备治疗癌症的药物中的用途。其中通式(D)中的各取代基与说明书中的定义相同。。。


技术研发人员：许建烟 章瑛 高建红 蔡晓锋 刘世梦 梁金栋 贺峰 陶维康
受保护的技术使用者：上海恒瑞医药有限公司
技术研发日：2022.04.29
技术公布日：2022/11/1